Intraluminal MCAO의 마우스 모델 : Cresyl 보라 착색에 의한 뇌 경색 평가

요약

쥐 intraluminal 중간 뇌성 가림 모델은 여기서 제공됩니다. 대뇌 경색의 범위는 neurologic 점수와 cresyl 보라색의 착색, TTC의 대안 얼룩, 병렬 많은 관심 마커에서 테스트 큰 이점을 제공함으로써 평가됩니다.

초록

행정 사망률 세계에서 장애의 주요 원인의 세 번째 원인입니다. 모든 스트로크의 약 80 % 허혈성 뇌졸중 차지한다. 그러나, thrombolytic 조직 plasminogen 활성 (TPA)는 존재 급성 허혈성 뇌졸중의 유일한 치료입니다. 이 LED 연구자들은 종의 다양한 여러 허혈성 뇌졸중 모델을 개발할 수 있습니다. 쥐 모델의 두 가지 주요 유형이 개발되었습니다 : 글로벌 뇌성 국소 빈혈 또는 초점 뇌성 국소 빈혈의 모델. 누구에 약 80 %가 thrombotic 또는 embolic 스트로크는 중간 대뇌 동맥 (MCA), 모델은 뇌졸중 연구 상당히 관련이 intraluminal 중간 대뇌 동맥 폐색 (MCAO)의 영역에서 발생, 환자의 허혈성 뇌졸중을 모방합니다. 이 모델이 처음 고이즈미 외로 쥐 개발되었습니다. 1,986 ^1인치 때문에 쥐 유전자 조작의 용이성 때문에,이 모델은 또한이 종 ^2-3으로 개발되었습니다. 내용은 "> 여기, 우리는 C57/Bl6 마우스에 과도 MCA 폐색 절차를 제시한다. 이전 연구 등 팁의 직경, 길이, 모양, 및 유연성 등의 occluder의 물리적 속성 경색 볼륨 ^(4)의 재현성에 중요하다고보고했습니다. 여기, 상용 실리콘 코팅 monofilaments (Doccol 공사)가 사용되었습니다. 또 다른 큰 이점이 모노 필라멘트가 subarachnoid의 출혈을 유발 할 수있는 위험을 줄일 수 있다는 것입니다. Zeiss 스테레오 - 현미경 Stemi 2000을 사용하여 실리콘 코팅 된 모노 필라멘트는 속목 동맥에 소개되었습니다 (ICA) 모노 필라멘트 때까지 외부 경동맥 동맥 (ECA)의 컷을 통해이 MCA의 기반을 occludes. 혈액 흐름이 thromboembolic 응고의 용해에 후 혈액 흐름의 복원을 모방 할 수있는 모노 필라멘트의 제거로 1 시간 이상 복원되었습니다 인간. 대뇌 경색의 범위가 neurologic 점수 의해 경색 볼륨의 측정에 의해 먼저 평가 될 수 있습니다.허혈성 마우스 따라서 다른 포스트 - reperfusion 시간에 자신의 neurologic 점수에 대해 분석 하였다. 2,3,5 - triphenyltetrazolium 염화 (TTC)와 얼룩, 경색 볼륨을 평가하기 위해 일반적으로 수행되었다. 이 immunohistochemistry하여 많은 중요한 마커를 테스트 할 수있는 기회를 제공하기 때문에 여기에서, 우리는 cresyl 보라색의 착색를 사용했습니다. 이 동영상에서는, 우리는 MCAO 절차를보고, 신경 점수 및 cresyl 보라색의 착색에 의한 경색 볼륨의 평가.

프로토콜

과도 중간 대뇌 동맥 폐색 (MCAO)

1. 수술 절차 (그림 1)

과도 중간 대뇌 동맥 폐색 (tMCAO)는 2 일에 수행됩니다 - 3 개월 된 남자 C57Bl / 6 마​​우스 (22~28g)에. 이 프로토콜은 IRCM 생명 윤리위원회 동물 관리에 의해 승인되었습니다. 수술 도구 autoclaving (60 분 15 PSI에서 121 ° C)의 소독을했다. 각 동물 사이, 그들은 뜨거운 비드 살균기를 (15 초)를 사용하여 소독되었습니다. 수술 테이블 및 기타 장비는 70 % 에탄올을 사용하여 살균합니다.

수술 전에 2 시간, 마우스는 buprenorphine (0.03 밀리그램 / kg bwip)로 analgesized되었습니다.

그림 1A.

1. 깊이 isoflurane 5퍼센트과 쥐를 마취시키다 후 2.5 % isoflurane에서 마취를 유지합니다. 마우스 본체 온도는 가열 패드와 수술 중 지속적으로 유지됩니다.
2. 모피와 SK를 소독70 % 에탄올 또는 Betadine으로 인치 면도는 뇌졸중 pathophysiology에 영향을 미칠 수 있습니다 머리카락 자료, microabrasions과 염증을 생산하고 있기 때문에, 우리는 마우스 털을 면도하지 않습니다.
3. 중간 선에 목을 절개하고 부드럽게 부드러운 조직을 분열.
4. 스테레오 현미경 (Stemi 2000, Zeiss)에서 무딘 절개는 경동맥을 찾습니다 기관을 표시하고 근육을 철회 수행됩니다.
5. 왼쪽 온목 동맥 (CCA)는주의 깊게 조직을 주변에서 해부되고 CCA가 일시적으로 20mm 세그먼트에 5-0 실크 봉합 컷을 사용하여 임시 봉합 (1)에 의해 occluded 있습니다. 좋은 치료는 vagal 신경을 손상하지 행사해야합니다.
6. 왼쪽 내부 온목 동맥 (ICA)와 외부 온목 동맥 (ECA)의 분기를 분리합니다. 영구 봉합 (2)와 같은 distally 가능한, ECA 주위에 배치하고 있으며, 약간 빡빡 다른 임시 봉합 (3)에 말초 ECA에 위치분기.
7. 피를 피하기 위해 리버스 액션 핀셋을 사용하여 왼쪽 ICA (4) 클립. 좋은 치료는 vagal 신경을 손상하지 행사해야합니다.
8. 영구 (2) 및 임시 (3) 봉합 사이의 ECA (5)에 작은 구멍을 잘라 버릴거야.

1B 그림.

9. , 12mm 길이 6-0 실리콘 코팅 (9~10mm에 대한 코팅 실리콘입니다) ECA (6)에 모노 필라멘트의 봉합 (Doccol 공사)를 소개 완전히 영구적 봉합에 말초 ECA을 잘라 ICA에 occluder로 바꾸 . 봉합은 단단히 출혈을 방지 할 수있는 모노 필라멘트 주위에 연결되어 있으며 리버스 액션 핀셋이 제거됩니다.
10. occluder는 윌리스의 원에있는 MCA의 출처를 막다하기 위해 도입된다. ECA와 CCA의 분기 이후 9~10밀리미터 주변의 삽입을 중지합니다. occluder가 차단되어 더 이상 이동할 수 없습니다. 주의 pterygopalatine 동맥을 통과하지 행사해야합니다. ECA에서 봉합 (3) 싸움이다htly 위치에서 모노 필라멘트를 해결하기 위해 묶어.
11. autoclip의 상처 폐쇄 시스템과 피부를 닫습니다.
12. 피하 생리 식염수 1 ML를 삽입하고 모든 포스트 가림 기간 (60 분) 동안 적외선 가열 램프에서 마우스를 놓습니다.

2. 중간 뇌 동맥 혈액 흐름의 복원

reanesthesia 전에 neuroscore은 수술의 성공 여부를 평가하기 위해 확인하실 수 있습니다.

1. 로 이전에 설명 된 생쥐를 마취하고 autoclips를 제거합니다.
2. 약간 모노 필라멘트 탈퇴 및 혈액 reperfusion을 허용하도록 ECA에 봉합 (3) 엽니 다.
3. 영구적으로 혈액 손실을 방지하기 위해 ECA에서 임시 봉합을 묶어. 모노 필라멘트는 재사용을 위해 보관됩니다.
4. 혈액 재순환을 허용 할 수있는 CCA로 임시 봉합 (1)를 제거합니다.
5. 상처를 닫습니다. 마우스 피하에 또 다른 하나 ML 생리 식염수을 받아야합니다.
6. 1 시간에 대한 적외선 가열 램프 아래에 마우스를 놓습니다. 동물이 이동성을 회복 여부를 확인 후, 마우스의 케이지에 반환되고 가열 패드, 72 시간 용 수건에서 떠났다. 케이지의 절반 만이 쥐가 자신의 환경을 선택할 수 있도록 가열 패드에 배치되어 있습니다. 후 수술 체중 감소는 일반적으로 관찰되기 때문에, 다진 식품을 섭취 권장 할 수있는 배양 접시에 배치됩니다.
   열두 시간 수술, 쥐 buprenorphine (0.03 밀리그램 / kg bwip)의 또 다른 복용량을 받았습니다.

3. 위장 운영

체하다 작업의 모든 절차가 occluder가 삽입되어 있지 제외하고 동일합니다.

4. Neuroscore

신경 결손은 reperfusion 이후 부상의 심각성의 정도의 이후 평가 tMCAO의 성공의 평가를 할 수 있습니다. 이전 ^5에 설명 된대로 신경 결손이 채점 ^</ 저녁을 먹다>, 1, 24, 48, 72 시간의 포스트 reperfusion에서 수행. 확장 여섯 점 척도가 사용됩니다 :

• 0 : 정상.
• 1 : 부드러운 꼬리가 감지 할 때 사용하거나 일관성없이 회전 동작을 돌고, contralateral 측면으로 회전 할 <50 % 시도합니다.
• 2 : 가벼운 돌고 일관 contralateral 측면으로 회전 할> 50 % 시도.
• 3 : 강한 일관성과 돌고 즉시, 마우스는 코가 거의 꼬리를 도달과 함께, 이상 1-2 초 동안 회전 위치를 보유하고 있습니다.
• 4 : barreling으로 진행 심한 회전, 반사를 산책하거나 righting의 손실.
• 5 : 혼수 상태 나 죽어가는.

5. Cresyl 보라 착색 (그림 2)

PBS 솔루션 재관류 후, 머리는 빠르게 이소 펜탄에 고정되어 있으며 -80에 저장 °C. 마우스 뇌는 계획 immunohistochemistry 연구에 따라 4 % paraformaldehyde (PFA)와 perfused 될 수 있습니다. 코로나 뇌 섹션 (17 μm)의 그라 이오 스탯 - 상처가 수행됩니다. 매 30에서 한 섹션은 대표 뇌성 부상을 가지고 동일한 슬라이드에 수집됩니다. 볼륨 정량화를 들어, 2 슬라이드 (귀공자 공사, 프레데릭, MD)이 병변을 평가하는 데 사용 된 cresyl 보라색의 착색 및 이미지 분석 시스템으로 얼룩 져 있습니다. 부상의 볼륨은 임의의 단위 (픽셀)으로 계산하고, 각 섹션에 대한 contralateral 비 lesioned 지역의 백분율로 표시되었습니다. 다른 슬라이드 immunohistochemistry 연구를 위해 -80 ° C에 보관됩니다. 또한, PFA-고정 뇌는 vibratome 등 한 외. (2009) ^6에서 권장하는 측정 경색 볼륨을 사용하여 30-50 μm에서 절단 할 수 있습니다.

결과

neuroscore 평가는 tMCAO 후 스트로크의 성공을 확인하고 tMCAO 후 reperfusion의 효율성을 결정합니다. 우리 손에, 모든 마우스는 적어도 온화한 일관성 컬링 (neuroscore 2) 신경 적자가 72 시간에 일반적으로 안정 제시 intraluminal 절차를 받게. 대부분의 마우스는 가벼운 일관성 컬링 (neuroscore 2) 나타냅니다. 컬링의 부재를 보여주는 마우스는 연구에서 제외됩니다. 그러나, neuroscore 평가는 우리가 부상당한 해마와 그대로 해마있는 사람과 쥐를 구별 할 수 없습니다.

어떤 사망률은 subarachnoid의 출혈이 발생하지 않은 제안, 수술 일 동안 관찰되지 않았습니다. subarachnoid의 출혈이 마우스에서 확인되는 경우,이 하나는 체계적으로 분석에서 제외됩니다. 집에서 준비 monofilaments보다 부드럽고입니다 Doccol 공사,에서 실리콘 코팅 모노 필라멘트의 사용은의 성공을 증가tMCAO하고 subarachnoid의 출혈을 줄일 수 있습니다. 24 시간과 72 시간 사이의 사망률이 모델에 14 %이며, 같은 일반적으로 폐색의 60 분에보고했다. 관찰 사망률은 아마도이 마우스 변형에 큰 경색 볼륨 때문입니다. 강한 병변 재현성이 또한 효과 (들)이 모델의 다양성에 의해 숨겨 질 수 neuroprotection 분자를 연구하기가 매우 흥미로운입니다 (표준 편차는 15 %입니다) 관찰되었습니다.

tMCAO에 따라 뇌 손상의 정도를 평가하기 위해, 우리는 재료의 많은 관련 마커에게 ⁶ 테스트해야하기 위해 오히려 TTC보다 cresyl 보라색의 착색 (그림 2)를 사용하도록 선택. 병변의 정도는 비교적 일치합니다. 그러나, 우리는 마우스에 해마가 (쥐 30 %) 부상하고있는 것으로 나타났습니다. 그렇게 cresyl 보라색의 착색이 나중에 일주까지 적용 할 수있는 참고 할 수 흥미 롭습니다. 문학에서 뇌 경색의 비율이 다양 하나에서다른 공부합니다. 이 마우스 긴장, 마취, 뇌 섹션의 두께, 사용 된 모노 필라멘트, 또는 ^{6, 7을} 사용 착색의 선택에 따라 달라집니다.

1 그림. 실리콘 코팅 intraluminal 모노 필라멘트를 사용하여 중간 대뇌 동맥의 폐색의 제도. 마우스 뇌와 실리콘 코팅 모노 필라멘트의 도입을 준비하는 연속 봉합 및 클립을 보여 뇌성 동맥의. (간체) 제도. B.는 윌리스의 원을 통해 모노 필라멘트의 위치가 표시됩니다. . 모노 필라멘트는 MCA ACA, 앞 뇌동맥의 기반을 막다하기 위해 ECA를 통해 ICA에 도입, BA, 뇌 바닥 동맥, CCA, 온목 동맥, C. 윌리스, 윌리스의 장 (场), ECA, 외부 경동맥 아르테는보시지, ICA, 내부 경동맥, MCA, 중, 뇌동맥, PCA, 뒤 교통 동맥, PPA, pterygopalatine 동맥.

그림 2. 72 시간 후 reperfusion. 경색 지역 (주로 striatum, 피질과 인접 뇌 영역) 이후 cresyl 보라색으로 물들 마우스 뇌의 대표 코로나 섹션은 흰색 (cresyl 보라색으로 흠없는)에 나타납니다. 부상 볼륨 (흰 부분, 오른쪽 뇌)가 구분이고 contralateral 비 lesioned 지역 (왼쪽 반구)의 백분율로 표시.

토론

다른 뇌졸중 모델은 환자 뇌졸중 결과를 모방하기 위해 개발되었습니다. 스트로크 모델의 선택은 생물학적 질문에 따라 달라집니다. intraluminal MCAO 모델은 환자의 허혈성 뇌졸중의 가장 일반적인 유형 중 하나를 모방하고 타무라 모델 ^4,7보다 침습적 더 일치합니다. 이 neuroprotection, neurorepair 및 세포 죽음에 분석을위한 정말 흥미로운 모델입니다. intraluminal 모델의 성공은 제어​​해야하는 등 동물의 성별, 나이, 무게, 온도, 마취 및 수술 시간 등 여러 요인에 따라 달라집니다. occluder (팁 직경, 길이, 모양, fexibility)의 물리적 예절은 MCAO ^(4)의 일관성 중요하다. 여기, 우리는 Doccol 공사 9~10밀리미터에 실리콘으로 코팅 12mm 길이의 6-0 모노 필라멘트를 사용합니다. 의 길이는 모든 ICA를 적용하기 때문에이 모노 필라멘트의 가장 큰 장점은 subarachnoid의 출혈을 줄일 수 있으며,윌리스와 PPA의 마법사 협회의 앞쪽과 뒤쪽 통신 동맥에서 나오는 길이, 잔류 혈액의 흐름은, 예방 및 경색 볼륨 감소의 다양성 (우리의 손에 다양성의 15 %)은 ^8입니다. CCA의 봉합은 또한 경색 볼륨 ⁹ 다양성을 낮 춥니 다.

뇌 손상 다음 tMCAO의 범위는 여러 가지 방법에 의해 평가 될 수있다. 앞서 언급 한 바와 같이 신경 결손을 측정 할 수 있습니다. 그러나이 방법으로 효율적인 측정을하기가 어렵습니다. 경색의 범위는 일반적으로 TTC의 착색에 의해 수행됩니다. 최근 자기 공명 기술은 또한 neuroprotective 트리트먼트 특히 흥미로운 기술을 사용합니다. 이러한 neurorepair, 세포 사망 또는 세포 증식 등의 행정에 관여 기본 세포 메커니즘을 이해하려면, immunohistochemistry에 의해 서로 다른 마커의 연구는 중요하고 매우 유익한 것입니다. 따라서, 우리 protoc뇌 섹션 준비의 충실한이 분석을 허용하는 큰 이점을 가지고 있으며, 사용 마우스의 수를 최소화합니다. 또한, Tureyen 외 ^10. cresyl 보라색의 착색 및 TTC 사이 좋은 상관 관계가있는 것으로보고있다.

자료

스테레오 현미경	Zeiss	Stemi 2000
섬유 - 가벼운 고강도 조명기	Dolan - 제너 산업 주식회사
Isoflurane	CDMV	108737
난방 담요	Gaymar Medsearch	TP22G
적외선 가열 램프
울트라 고급 핀셋, 스타일 5	전자 현미경 과학	78,320 - 5TI
Vannas 가위 3mm 커팅 에지, 직선	전자 현미경 과학	72932-01
스타일 LA-1과 MPF-1 모든 부드러운 블레이드	전자 현미경 과학	77926-5
부정적 행동 핀셋, 스타일 KOPINC 5	전자 현미경 과학	72850-F
가위, 5 1 / 2 "직선을 해부	Cedarlane	72,960
Autoclip 스타터 세트	하버드 장치	34-0557
BD Autoclip은 휴관일 Syst을 나갔습니다., 9mm 길이 100/pk	피셔	01-804-5
5-0 봉합	하버드 장치	517763
봉합 재료 PDS II 모노 필라멘트 바이올렛, 5-0, RB-1, Z303H	CDMV	6167
12mm 길이 6-0 실리콘 코팅 모노 필라멘트의 봉합	Doccol 기업	60SPRePK5
1ml를 Seringes	피셔	14-823 - 2F
바늘 26G1 / 2	피셔	BD-305111
IRCM