Modelo de Rato OACM Intraluminal: Avaliação infarto cerebral por coloração violeta Cresyl

Resumo

O modelo de oclusão intraluminal cerebral média em ratinhos é aqui apresentada. A extensão do enfarte cerebral é avaliada por uma pontuação neurológica e coloração com violeta de cresilo, a coloração de uma alternativa ao TTC, que oferece a grande vantagem de testar em paralelo marcadores de interesse muitos.

Resumo

AVC é a terceira causa de mortalidade ea principal causa de incapacidade no mundo. Isquêmicos contas AVC por aproximadamente 80% de todos os derrames. No entanto, o tecido trombolítica activador do plasminogénio (tPA) é o único tratamento do acidente vascular cerebral isquémico agudo que existe. Isto levou os pesquisadores a desenvolver diversos modelos de acidente vascular cerebral isquêmico em uma variedade de espécies. Dois grandes tipos de modelos de roedores foram desenvolvidos: modelos de isquemia cerebral global ou isquemia cerebral focal. Para imitar AVC isquémico em doentes, nos quais cerca de 80% AVC trombótico ou embólico ocorrer no território da artéria cerebral média (MCA), a oclusão da artéria cerebral média intraluminal (MCAO) modelo é muito relevante para os estudos de acidente vascular cerebral. Este modelo foi desenvolvido pela primeira vez em ratos por Koizumi et al., Em 1986, ^1. Devido à facilidade de manipulação genética em ratinhos, estes modelos têm sido desenvolvidos neste ^2-3 espécie. conteúdo "> Aqui, nós apresentamos a MCA transiente procedimento de oclusão em ratos C57/BL6. Estudos anteriores relataram que as propriedades físicas do oclusor como o diâmetro da ponta, o comprimento, a forma ea flexibilidade são críticas para a reprodutibilidade do volume do enfarte ^4. Nisto, um monofilamentos de silício comerciais revestidos (Doccol Corporation) foram utilizados. Outra grande vantagem é que este monofilamento reduz o risco de induzir hemorragia subaracnóidea. Usando o estereomicroscópio Zeiss-Stemi 2000, o monofilamento de silicone revestido foi introduzido na artéria carótida interna (ICA), através de um corte da artéria carótida externa (ECA) até que o monofilamento oclui a base da MCA. fluxo sanguíneo foi restaurado 1 hora depois da remoção do monofilamento para imitar o restabelecimento do fluxo sanguíneo após a lise de um coágulo de tromboembólico humanos. A extensão do enfarte cerebral pode ser avaliada primeiro por uma pontuação neurológica e pela medição do volume do enfarte.Ratos isquêmicos isso foram analisados ​​para a sua pontuação neurológica em diferentes pós-reperfusão vezes. Para avaliar o volume de enfarte, a coloração com cloreto de 2,3,5-trifeniltetrazólio (TTC) foi geralmente realizada. Aqui, usamos a coloração violeta cresil uma vez que oferece a oportunidade de testar muitos marcadores de críticas por imuno-histoquímica. Neste vídeo, relata o procedimento OACM; pontuações neurológicas e da avaliação do volume de infarto por coloração violeta cresil.

Protocolo

Oclusão da artéria cerebral transitória Médio (OACM)

1. Procedimento cirurgia (Figura 1)

A oclusão da artéria cerebral média transiente (tMCAO) é realizado em 2 - a 3 meses de idade macho C57BL / 6 (22-28g). Este protocolo foi aprovado pelo IRCM cuidados com os animais bioética comitê. Instrumentos cirúrgicos foram esterilizados por autoclave (121 ° C a 15 psi durante 60 min.) Entre cada animal, foram esterilizadas utilizando o esterilizador quente talão (15 seg.) Mesa de cirurgia e outros equipamentos são higienizadas utilizando etanol a 70%.

Duas horas antes da cirurgia, os ratos foram analgesized com buprenorfina (0,03 bwip mg / kg).

Figura 1A.

1. Profundamente anestesiar ratos com 5% de isoflurano e depois manter a anestesia isoflurano em 2,5%. A temperatura corporal dos ratos é mantida constante durante a cirurgia, com uma almofada de aquecimento.
2. Desinfectar a pele e skem etanol com 70% ou Betadine. Desde barbear para liberação cabelo fragmento, microabrasions e inflamação que pode ter impacto na fisiopatologia curso, nós não raspar pele do rato.
3. Faça uma incisão na linha média do pescoço e puxe para além dos tecidos moles.
4. Sob um microscópio estéreo (Stemi 2000, Zeiss), uma dissecção romba é realizada para expor a traqueia e retrair os músculos para localizar a artéria carótida.
5. A artéria carótida comum esquerda (CCA) é cuidadosamente dissecada do tecido circundante e o CCA está temporariamente obstruído por uma sutura temporária (1), usando sutura de seda 5-0 cortada em segmentos de 20 mm. Grande cuidado deve ser exercido para não prejudicar o nervo vago.
6. Separe a bifurcação da artéria comum esquerda carótida interna (ACI) e artéria carótida externa comum (ECA). Uma sutura permanente (2) é colocada em torno da ECA, como distalmente quanto possível, e um outro fio de sutura temporária ligeiramente apertado (3) é colocado sobre o ECA distal aobifurcação.
7. Clipe da ACI esquerda (4) com uma pinça reversa de ação para evitar a hemorragia. Grande cuidado deve ser exercido para não prejudicar o nervo vago.
8. Corte um pequeno buraco ECA (5) entre permanentes (2) e temporária (3) suturas.

Figura 1B.

9. Introduzir um 12 mm de comprimento 6-0 silício revestido (cerca de 9 a 10 mm é de silício revestido) de sutura de monofilamento (Doccol Corporation) para a ECA (6), completamente cortado da ECA distal à sutura permanente e inverter a prótese na ICA . A sutura é rigidamente ligada em torno do monofilamento para prevenir hemorragias e as pinças de acção inversa são removidas.
10. O oclusor é introduzido para ocluir a origem da MCA no círculo de Willis. Pare de sua inserção em torno de 9-10 mm além da bifurcação do ECA e CCA. A prótese é bloqueado e não pode mais mover-se. Deve ser tomado cuidado para não penetrar na artéria pterigopalatina. A sutura (3) sobre o ECA é tightly amarrado para fixar o monofilamento em posição.
11. Fechar a pele com um sistema de fecho Autoclip ferida.
12. Injectar 1 mL de solução salina subcutaneamente e coloque ratos sob uma lâmpada de aquecimento de infravermelhos durante todo o período pós-oclusão (60 min).

2. Restauração do fluxo sanguíneo da artéria cerebral média

Antes reanesthesia, o neuroscore pode ser verificado para avaliar o sucesso da cirurgia.

1. Anestesiar os ratos, tal como anteriormente descrito e retire os autoclips.
2. Abra ligeiramente a sutura (3) sobre o ECA para permitir a retirada monofilamentos e reperfusão sangue.
3. Permanentemente amarrar a sutura temporária no ECA para evitar a perda de sangue. O monofilamento é mantido para reutilização.
4. Remover a sutura temporária (1) sobre o CCA para permitir a recirculação de sangue.
5. Fechar a ferida. Os ratos devem receber um outro 1 ml de solução salina por via subcutânea.
6. Colocar os ratos sob a lâmpada de aquecimento infravermelha para 1 hr. Depois de verificar que o animal recupere a mobilidade, o rato é devolvido à sua gaiola e deixadas sob a almofada de aquecimento e toalhas para 72 h. Note-se que apenas a metade da gaiola é colocada sobre a almofada de aquecimento para permitir que os ratos para escolher o seu ambiente. Porque pós-cirúrgica a perda de peso é geralmente observado, alimentos puré é colocado numa placa de Petri, para encorajar a comer.
   Doze horas após a cirurgia, os ratos receberam uma segunda dose de buprenorfina (0,03 bwip mg / kg).

3. Operação Sham

Para as operações de simulação, todos os procedimentos são idênticos, excepto que a prótese não está inserido.

4. Neuroscore

Défices neurológicos permitir a avaliação do sucesso de tMCAO apenas após a reperfusão e mais tarde a estimativa do grau de severidade da lesão. Défices neurológicos são pontuados como previamente descrito ^{5 <}/ Sup> e realizada a 1, 24, 48 e 72 horas pós-reperfusão. Uma escala de seis pontos expandida é utilizada:

• 0: normal.
• 1: ligeira circulando comportamento com ou sem rotação inconsistente quando apanhado pela cauda, ​​<50% de tentativas para girar para o lado contralateral.
• 2: leve consistente circulando,> 50% de tentativas para girar para o lado contralateral.
• 3: consistente forte e imediata circulando, o mouse tem uma posição de rotação por mais de 1-2 segundos, com o nariz quase atingindo sua cauda.
• 4: rotação grave progredindo em embarricamento, perda de andar ou dos reflexos.
• 5: coma ou moribundos.

5. Coloração com violeta de cresilo (Figura 2)

Seguindo PBS solução de perfusão, os cérebros são rapidamente congelados em isopentano e armazenados a -80 °C. cérebros de rato pode ser também submetido a perfusão com paraformaldeído a 4% (PFA) em função dos estudos imunohistoquímicos planeadas. Criostáticas-cortes das secções cerebrais coronais (17 um) são executadas. Uma secção de cada 30 é recolhida na mesma lâmina ter uma lesão cerebral representativo. Para a quantificação do volume, duas lâminas são coradas por coloração com violeta de cresilo e um sistema de análise de imagem (Scion Corporation, Frederick, MD) foi usado para avaliar a lesão. O volume da lesão foi calculada em unidades arbitrárias (pixels), e expresso como uma percentagem da área não lesada contralateral de cada secção. Outras lâminas são mantidas a -80 ° C para estudos imuno-histoquímicos. Alternativamente, fixa-PFA cérebro pode ser cortado em 30-50 uM utilizando vibratome e o volume do enfarte medido, tal como recomendado por Han et al. (2009) ^6.

Resultados

A avaliação neuroscore confirma o sucesso do tMCAO pós-AVC e determina a eficiência do tMCAO de pós-reperfusão. Nas nossas mãos, todos os ratos submetidos ao procedimento intraluminal apresentou pelo menos uma ondulação ligeira consistente (neuroscore 2) e os défices neurológicos são geralmente estáveis ​​até 72 horas. A maioria dos ratos apresentam um leve ondulação consistente (neuroscore 2). Ratinhos mostrando ausência de enrolamento são excluídos do estudo. No entanto, a avaliação neuroscore não permite-nos distinguir entre ratos com um hipocampo feridos e aqueles com um hipocampo intacto.

Nenhuma mortalidade foi observada durante o dia da cirurgia, o que sugere que a hemorragia subaracnóidea não ocorreu. Quando a hemorragia subaracnoidea é identificado no rato, este é sistematicamente excluídos da análise. O uso de silício revestido de monofilamento de Doccol Corporation, que é mais suave do que a casa preparados monofilamentos, aumenta o sucesso detMCAO e reduz a hemorragia subaracnóidea. A mortalidade entre 24 horas e 72 horas é de 14% neste modelo, como geralmente reportados por 60 minutos de oclusão. A mortalidade observada é provavelmente devido a um grande volume do enfarte neste estirpe de ratinho. A reprodutibilidade forte lesão foi também observada (desvio padrão é de 15%), o que é muito interessante para estudar moléculas neuroproteção onde o seu efeito (s) poderão ser escondidos pela variabilidade do modelo.

Para avaliar a extensão da lesão cerebral após tMCAO, optou-se por utilizar coloração violeta cresil (Figura 2) em vez de TTC a fim de ter uma grande quantidade de materiais para testar marcadores relevantes ^6. A extensão da lesão é relativamente consistente. No entanto, percebemos que em alguns ratos, o hipocampo foi ferido (cerca de 30% dos ratos). É interessante notar que a coloração com violeta de cresilo pode ser aplicado até uma semana mais tarde. Na literatura, a percentagem de enfarte cerebral varia de umestudar para o outro. Ela depende da escolha de estirpe de ratinho, a anestesia, a espessura das secções de cérebro, o monofilamento utilizado, ou a coloração utilizado ^{6, 7.}

Figura 1. Esquema da oclusão da artéria cerebral média, utilizando silício revestido monofilamento intraluminal. Um esquema. Simplificado do cérebro de rato e artérias cerebrais mostrando suturas sucessivas e clipe para preparar a introdução de silício revestido de monofilamento. B. A posição de monofilamento através do círculo de Willis é representada. O monofilamento é introduzido via ICA ECA para ocluir a base do MCA ACA, artéria cerebral anterior;. BA, da artéria basilar; CCA, artéria carótida comum; C. Willis, Círculo de Willis; ECA, carótida externa artery; ICA, interna da artéria carótida; MCA, artéria cerebral média; PCA, artéria comunicante posterior; PPA, artéria pterigopalatina.

Figura 2. Representante cortes coronais de cérebro de rato coradas com cresil violeta após 72 horas pós-reperfusão área de infarto. (Principalmente estriado, córtex e áreas cerebrais adjacentes) aparece em branco (imaculada por violeta cresil). O volume da lesão (parte branca, hemisfério direito) foi delimitado e expresso como uma percentagem da área não lesada contralateral (hemisfério esquerdo).

Discussão

Diferentes modelos de AVC têm sido desenvolvidos para imitar efeitos de AVC em pacientes. A escolha do modelo de acidente vascular cerebral depende da questão biológica. O modelo OACM intraluminal imita um dos tipos mais comuns de AVC isquêmico em pacientes e é menos invasiva e mais consistente do que o modelo Tamura ^4,7. É um modelo muito interessante para análises de morte neurorepair neuroproteção, e celular. O sucesso do modelo intraluminal depende de muitos factores tais como o sexo do animal, idade e peso, a temperatura, a anestesia e do momento da cirurgia, que têm de ser controladas. As propriedades físicas do oclusor (ponta de diâmetro, comprimento, forma e fexibilidade) são críticos para a consistência da MCAO ^4. Aqui, usamos a 12 milímetros de comprimento 6-0 monofilamento revestido com silicone em 9-10 mm da Corporação Doccol. A grande vantagem deste monofilamento é reduzir hemorragia subaracnóidea e porque seu comprimento cobriu todo o ICAcomprimento, o fluxo de sangue residual, que vem das artérias anterior e posterior comunicação do Círculo de Willis e PPA, é impedido e da variabilidade de volume diminui infarto (15% da variabilidade em nossas mãos) ^8. A sutura de CCA também diminui a variabilidade do volume de enfarte ^9.

A extensão da lesão cerebral a seguir tMCAO pode ser avaliada por modos diferentes. Défices neurológicos pode ser medida conforme anteriormente mencionado. No entanto, é difícil ter uma medida eficaz por este caminho. A extensão do enfarte é normalmente realizada por coloração com TTC. Mais recentemente, as técnicas de ressonância magnética também são utilizados, uma tecnologia particularmente interessante para os tratamentos neuroprotectores. Para compreender os mecanismos subjacentes celulares envolvidos no acidente vascular cerebral, tais como neurorepair morte celular, ou a proliferação celular, o estudo de diferentes marcadores por imuno-histoquímica é crítica e muito informativo. Assim, o nosso protocolool de preparações secção cérebro tem a grande vantagem de permitir que estas análises, e minimiza o número de ratos utilizados. Além disso, Tureyen et al. ¹⁰ relataram que há uma boa correlação entre a coloração violeta cresil e TTC.

Materiais

Microscópio estéreo	Zeiss	Stemi 2000
Fibra-Light Iluminador de Alta Intensidade	Dolan-Jenner Industries Inc.
Sistema de Anestesia para isoflurano
Isoflurano	CDMV	108737
Cobertor Aquecimento	Gaymar Medsearch	TP22G
Lâmpada de aquecimento de infravermelhos
Ultra pinça fina, estilo 5	Electron Microscopy Sciences	78320-5TI
Vannas Tesoura Cutting Edge 3 mm, Reto	Electron Microscopy Sciences	72932-01
Estilo LA-1 e MPF-1 Todas as lâminas lisas	Electron Microscopy Sciences	77926-5S
Negativos pinças de ação, estilo KOPINC 5	Electron Microscopy Sciences	72850-F
Dissecando tesoura 5 1/2 "Straight	Cedarlane	72960
Autoclip Starter Set	Harvard aparelho	34-0557
BD Autoclip Wound Syst Encerramento., 9mm de comprimento, 100/PK	Fisher	01-804-5
Sutura 5-0	Harvard aparelho	517763
Material de sutura PDS II monofilamento violeta, 5-0, RB-1; Z303H	CDMV	6167
12 mm de comprimento de sutura de monofilamento 6-0 siliconado	Doccol Corporação	60SPRePK5
Seringes 1ml	Fisher	14-823-2F
Agulhas 26G1 / 2	Fisher	BD-305111
IRCM