Modello murino di MCAO intraluminale: valutazione infarto cerebrale da colorazione viola cresile

Riepilogo

Il modello intraluminale occlusione cerebrale nei topi viene qui presentato. Il grado di infarto cerebrale viene valutata da un punteggio neurologico e colorazione violetto cresolo, una colorazione alternativa alla TTC, che offre il grande vantaggio di testare in parallelo molti marcatori di interesse.

Abstract

L'ictus è la terza causa di mortalità e la principale causa di disabilità nel mondo. Ischemici conti del tratto per circa l'80% di tutti gli ictus. Tuttavia, il tessuto trombolitico plasminogeno (tPA) è l'unico trattamento dell'ictus ischemico acuto che esiste. Ciò ha indotto i ricercatori a sviluppare diversi modelli di ictus ischemico in una varietà di specie. Due principali tipi di modelli di roditori sono stati sviluppati modelli di ischemia cerebrale globale o ischemia cerebrale focale. Per simulare ictus ischemico nei pazienti, in cui circa l'80% ictus trombotico o embolico si verificano nel territorio dell'arteria cerebrale media (MCA), il intraluminale occlusione dell'arteria cerebrale media (MCAO) modello è molto rilevante per gli studi ictus. Questo modello è stato sviluppato nei ratti di Koizumi et al. Nel 1986 ^1. Grazie alla facilità di manipolazione genetica nei topi, questi modelli sono stati sviluppati anche in questa specie ^2-3. contenuto "> Qui, presentiamo il transitorio MCA procedura occlusione in C57/Bl6 topi. Precedenti studi hanno riportato che le proprietà fisiche del occlusore come diametro della punta, lunghezza, forma e flessibilità sono critici per la riproducibilità del volume dell'infarto ^4. qui, un monofilamenti commerciali al silicio rivestite (Doccol Corporation) sono stati utilizzati. Un altro grande vantaggio è che questo monofilo riduce il rischio di indurre emorragie subaracnoidea. Uso stereomicroscopio Zeiss Stemi 2000, il monofilamento di silicio rivestito è stato introdotto nella carotide interna (ICA) attraverso un taglio nella carotide esterna (ECA) finché il monofilamento occlude la base del MCA. flusso di sangue è stato ripristinato dopo 1 ora dalla rimozione del monofilamento di imitare il ripristino del flusso sanguigno dopo la lisi di un coagulo in tromboembolica umani. Il grado di infarto cerebrale possono essere valutati prima da un punteggio neurologica e dalla misura del volume dell'infarto.Ischemici topi sono stati quindi analizzati per il loro punteggio neurologico a diversi post-riperfusione volte. Per valutare il volume dell'infarto, colorazione con 2,3,5-trifeniltetrazolio cloruro (TTC) è stato di solito eseguita. Qui, abbiamo usato la colorazione viola cresile in quanto offre la possibilità di testare molti indicatori critici di immunoistochimica. In questo video, si segnala la procedura MCAO; punteggi neurologici e la valutazione del volume dell'infarto mediante colorazione violetto cresolo.

Protocollo

Transitoria occlusione dell'arteria cerebrale media (MCAO)

1. Chirurgia Procedura (Figura 1)

Transitoria occlusione dell'arteria cerebrale media (tMCAO) viene eseguito il 2 - a 3 mesi maschio topi C57BL / 6 (22-28g). Questo protocollo è stato approvato dalla cura degli animali IRCM comitato di bioetica. Strumenti chirurgici sono stati sterilizzati in autoclave (121 ° C a 15 psi per 60 min). Tra ogni animale, sono stati sterilizzati con il caldo tallone sterilizzatrice (15 sec). Tavolo Chirurgia e altre attrezzature sono disinfettati con etanolo al 70%.

Due ore prima dell'intervento chirurgico, i topi sono stati analgesized con buprenorfina (0,03 mg / kg BWIP).

Figura 1A.

1. Profondamente anestetizzare topi con isoflurano 5% e poi mantenere l'anestesia al 2,5% isoflurano. Temperatura corporea dei topi è mantenuta costante durante l'intervento con un cuscinetto riscaldante.
2. Disinfettare la pelliccia e skcon il 70% in etanolo o Betadine. Dal momento che la rasatura produce frammento rilascio capelli, microabrasioni e infiammazione che possono avere un impatto sulla fisiopatologia corsa, non di rado pelliccia del mouse.
3. Effettuare una incisione mediana del collo e delicatamente separare i tessuti molli.
4. Sotto un microscopio stereo (Stemi 2000, Zeiss), una dissezione smussa viene eseguita per esporre la trachea e ritrarre i muscoli per individuare la carotide.
5. La sinistra arteria carotide comune (CCA) è attentamente sezionato dal tessuto circostante e il CCA è temporaneamente occluso da una sutura temporanea (1) con sutura di seta 5-0 tagliato in 20 segmenti mm. Grande attenzione deve essere esercitata non danneggiare il nervo vagale.
6. Separare la biforcazione della sinistra interna carotide comune (ICA) ed esterni carotide comune (ECA). Una sutura permanente (2) è posizionato intorno alla ECA, più distalmente possibile, e un'altra sutura leggermente stretto temporanea (3) è posto sulla ECA distale albiforcazione.
7. Agganciare la sinistra ICA (4) utilizzando un reverse-azione pinzette per evitare emorragie. Grande attenzione deve essere esercitata non danneggiare il nervo vagale.
8. Tagliare un piccolo foro in ECA (5) tra permanenti (2) e temporanei (3) punti di sutura.

Figura 1B.

9. Introdurre un 12 mm di lunghezza 6-0 siliconato (circa 9-10mm è siliconata) sutura monofilamento (Doccol Corporation) nel ECA (6), completamente tagliato l'ECA distale alla sutura permanente e invertire il occlusore nella ICA . La sutura è strettamente legato intorno al monofilo per prevenire le emorragie e le reverse-azione pinzette vengono rimossi.
10. L'occlusione è introdotto per occludere l'origine del MCA nel cerchio di Willis. Interrompere l'inserimento circa il 9-10 mm oltre la biforcazione di ECA e CCA. L'occlusione è bloccato e non può più muoversi. La cura deve essere esercitata non a penetrare l'arteria pterigopalatino. La sutura (3) sul ECA è tightly legato per fissare il monofilo in posizione.
11. Chiudere la pelle con un sistema di chiusura AutoClip ferita.
12. Iniettare 1 ml di soluzione fisiologica per via sottocutanea e posizionare topi sotto una lampada di riscaldamento a infrarossi durante tutto il periodo post-occlusione (60 min).

2. Restauro del Medio flusso ematico cerebrale Arteria

Prima reanesthesia, il neuroscore può essere controllato per valutare il successo della chirurgia.

1. Anestetizzare i topi come precedentemente descritto e rimuovere le autoclips.
2. Aprire leggermente la sutura (3) sulla Corte dei conti per riunire la revoca monofilamento e riperfusione sangue.
3. Permanente legare la sutura temporanea della Corte dei conti per evitare la perdita di sangue. Il monofilo è tenuto per il riutilizzo.
4. Rimuovere la sutura temporaneo (1) sul CCA per consentire ricircolo di sangue.
5. Chiudere la ferita. I topi dovrebbero ricevere un altro 1 ml di soluzione fisiologica per via sottocutanea.
6. Posizionare i topi sotto la lampada di riscaldamento a raggi infrarossi per 1 ora. Dopo aver verificato che l'animale riprenda mobilità, il mouse viene restituito alla sua gabbia e lasciato sotto il termoforo e asciugamani per 72 ore. Si noti che solo la metà della gabbia è collocata sul cuscinetto di riscaldamento per permettere topi di scegliere il loro ambiente. Poiché post-chirurgica perdita di peso è generalmente osservata, cibo purè è posto in una capsula di Petri per incoraggiare mangiare.
   Dodici ore dopo la chirurgia, i topi hanno ricevuto un'altra dose di buprenorfina (0,03 mg / kg BWIP).

3. Sham Funzionamento

Per le operazioni fittizie, tutte le procedure sono identiche tranne che l'occlusione non è inserita.

4. Neuroscore

Deficit neurologici consentire la valutazione del successo di tMCAO appena dopo riperfusione e successivamente la stima del grado di gravità della lesione. Deficit neurologici sono segnati come descritto in precedenza ^{5 <}/ Sup> ed eseguito a 1, 24, 48 e 72 ore post-riperfusione. Un espanso scala di sei punti viene utilizzato:

• 0: normale.
• 1: lieve cerchio comportamento con o senza rotazione incoerente se preso per la coda, i tentativi <50% per ruotare verso il lato controlaterale.
• 2: lieve coerente cerchio,> tentativi 50% per ruotare verso il lato controlaterale.
• 3: in linea forte e immediato girando, il mouse ha una posizione di rotazione per più di 1-2 secondi, con il suo naso quasi a raggiungere la coda.
• 4: rotazione grave procedendo in burattatura, la perdita di camminare o di riflesso di raddrizzamento.
• 5: in coma o moribondi.

5. Violet colorazione cresolo (Figura 2)

Seguendo soluzione perfusione PBS, cervelli vengono rapidamente congelati in isopentano a -80 °C. cervello del mouse può essere anche perfusi con 4% paraformaldeide (PFA) in base agli studi di immunoistochimica previsti. Criostato-tagli di sezioni cerebrali coronali (17 micron) vengono eseguite. Una sezione su ogni 30 viene raccolta nello stesso vetrino di avere una lesione cerebrale rappresentativo. Per la quantificazione del volume, 2 alla colorazione mediante colorazione violetto cresolo ed un sistema di analisi di immagine (Scion Corporation, Frederick, MD) è stato utilizzato per valutare la lesione. Il volume pregiudizio è stato calcolato in unità arbitrarie (pixel), ed espressa come percentuale del controlaterale non lesionato area per ciascuna sezione. Altre diapositive sono mantenuti a -80 ° C per studi di immunoistochimica. In alternativa, PFA-fisso cervello può essere tagliato a 30-50 micron utilizzando vibratomo e il volume dell'infarto misurata come raccomandato da Han et al. (2009) ^6.

Risultati

La valutazione neuroscore conferma il successo tMCAO post-stroke e determina l'efficienza del tMCAO post-riperfusione. Nelle nostre mani, tutti i topi sottoposti alla procedura intraluminale presentato almeno una lieve arricciatura consistente (neuroscore 2) ed i deficit neurologici sono generalmente stabili fino a 72 ore. La maggior parte dei topi mostrano un lieve arricciatura consistente (neuroscore 2). Topi mostrano assenza di arricciature sono esclusi dallo studio. Tuttavia, la valutazione neuroscore non ci permette di distinguere tra i topi con un ippocampo ferito e quelli con un ippocampo intatto.

Nessuna mortalità è stata osservata durante il day surgery, suggerendo che emorragie subaracnoidea non si è verificato. Quando emorragia subaracnoidea è identificato in un topo, questo viene sistematicamente esclusi dall'analisi. L'uso di silicio rivestito monofilamento da Doccol Corporation, che è più liscia preparate in casa, monofilamenti, aumenta il successotMCAO e riduce emorragie subaracnoidea. La mortalità tra 24 ore e 72 ore è del 14% in questo modello, come generalmente riportato per 60 minuti di occlusione. La mortalità osservata è probabilmente dovuto ad un grande volume dell'infarto in questo ceppo di topi. Una lesione riproducibilità forte è stata osservata anche (deviazione standard è del 15%), che è molto interessante studiare molecole neuroprotezione dove il suo effetto (s) potrebbe essere nascosti dalla variabilità del modello.

Per valutare l'entità del danno cerebrale dopo tMCAO, abbiamo scelto di utilizzare la colorazione cresyl violetto (Figura 2) anziché TTC per avere un sacco di materiale per testare marcatori pertinenti ^6. L'estensione della lesione è relativamente costante. Tuttavia, abbiamo notato che in alcuni topi, l'ippocampo è stato ferito (circa il 30% dei topi). È interessante notare che la colorazione violetto cresolo può essere applicata fino a 1 settimana dopo. In letteratura, la percentuale di infarto cerebrale varia da unostudiare all'altro. Essa dipende dalla scelta del ceppo di topo, l'anestesia, lo spessore delle sezioni cerebrali, il monofilo utilizzata, o la colorazione utilizzata ^{6, 7.}

Figura 1. Schema della occlusione dell'arteria cerebrale media utilizzando siliconato monofilo intraluminale. A. Schema semplificato di cervello di topo e arterie cerebrali che mostrano suture successive e clip per preparare l'introduzione di silicio rivestito monofilamento. B. La posizione del monofilo attraverso il circolo di Willis è rappresentato. Il monofilamento è introdotto nella ICA via Corte a occludere alla base del MCA ACA, arteria cerebrale anteriore,. BA, arteria basilare, CCA, arteria carotide comune, C. Willis, circolo di Willis, Corte dei conti, carotide esterna artery, ICA, arteria carotide interna, MCA, l'arteria cerebrale media, PCA, posteriore dell'arteria comunicante, PPA, arteria pterigopalatino.

Figura 2. Rappresentative sezioni coronali di cervello di topo colorate con violetto cresolo, dopo 72 ore di post-riperfusione. Dell'area infartuale (soprattutto striato, la corteccia e le aree cerebrali adiacenti) viene visualizzata in bianco (non colorati di violetto cresolo). Il volume lesioni (parte bianca, emisfero destro) era delimitato ed espressa come percentuale del controlaterale non lesionato area (emisfero sinistro).

Discussione

Diversi modelli ictus sono stati sviluppati per imitare conseguenze ictus nei pazienti. La scelta del modello dipende dalla corsa questione biologica. Il modello intraluminale MCAO imita uno dei tipi più comuni di ictus ischemico nei pazienti ed è meno invasivo e più coerente rispetto al modello Tamura ^4,7. Si tratta di un modello molto interessante per le analisi di morte neuroprotezione, neurorepair e cellula. Il successo del modello intraluminale dipende da molti fattori quali il sesso animale, età e peso, la temperatura, l'anestesia e l'intervento chirurgico, che devono essere controllati. Le proprietà fisiche del occlusore (diametro della punta, lunghezza, forma e fessibilità) sono critici per la consistenza del MCAO ^4. Qui, usiamo i 12 mm di lunghezza 6-0 monofilamento ricoperti in silicone il 9-10 mm dalla Corporation Doccol. Il grande vantaggio di questo monofilo è quello di ridurre le emorragie subaracnoidea e per la sua lunghezza coperto tutta l'ACIlunghezza, il flusso di sangue residuo, che proviene dalle arterie comunicanti anteriore e posteriore del Circolo di Willis e PPA, sia precluso e il variabilità diminuisce volume di infarto (15% della variabilità nelle nostre mani) ^8. La sutura di CCA diminuisce anche la variabilità del volume dell'infarto ^9.

L'entità del seguente tMCAO lesioni cerebrali può essere valutata per vie diverse. Deficit neurologici può essere misurata come accennato in precedenza. Tuttavia, è difficile avere una misura efficace in questo modo. L'entità dell'infarto è comunemente eseguita mediante colorazione TTC. Più recentemente, tecniche di risonanza magnetica sono utilizzati anche, una tecnologia particolarmente interessante per trattamenti neuroprotettivi. Per comprendere i meccanismi cellulari coinvolti nella corsa come neurorepair morte cellulare o proliferazione cellulare, lo studio dei diversi marcatori di immunoistochimica è critica e molto informativo. Così, il nostro protocolo di preparati sezione del cervello ha il grande vantaggio di consentire queste analisi, e riduce al minimo il numero di topi utilizzati. Inoltre, Tureyen et al. ¹⁰ hanno riportato che esiste una buona correlazione tra colorazione violetto cresolo e TTC.

Materiali

Stereomicroscopio	Zeiss	Stemi 2000
Fibra-illuminatore a luce ad alta intensità	Dolan-Jenner Industries Inc.
Sistema di Anestesia per isoflurano
Isoflurano	CDMV	108737
Riscaldamento coperta	Gaymar Medsearch	TP22G
Lampada di riscaldamento a raggi infrarossi
Ultra fine pinzette, stile 5	Scienze della microscopia elettronica	78320-5TI
Forbici Vannas Cutting Edge 3 mm, dritto	Scienze della microscopia elettronica	72932-01
Stile LA-1 e MPF-1 Tutte le lame lisce	Scienze della microscopia elettronica	77926-5S
Pinzette ad azione negativa, stile KOPINC 5	Scienze della microscopia elettronica	72850-F
Dissezione forbici 5 1/2 "Straight	Cedarlane	72960
AutoClip STARTER SET	Harvard Apparatus	34-0557
BD AutoClip Wound Syst chiusura., 9mm lungo, 100/conf	Fisher	01-804-5
5-0 sutura	Harvard Apparatus	517763
Materiale di sutura PDS II monofilamento viola, 5-0, RB-1; Z303H	CDMV	6167
12 mm di lunghezza 6-0 siliconato sutura monofilamento	Doccol Corporation	60SPRePK5
Seringes 1ml	Fisher	14-823-2F
Aghi 26G1 / 2	Fisher	BD-305111
IRCM