מודל עכבר של MCAO intraluminal: הערכת אוטם מוחית על ידי כתמים סגולים Cresyl

Summary

מודל intraluminal המוח האמצעי, החסימה בעכברים מוצג במסמך זה. ההיקף אוטם מוחית מחושב על ידי ציון נוירולוגים וכתמים סגולים cresyl, מכתים חלופה לTTC, להציע את היתרון הגדול לבדיקה בסמני ריבית רבים במקביל.

Abstract

שבץ הוא הגורם השלישי לתמותה והסיבה המובילה למוגבלות בעולם. חשבונות שבץ איסכמי מהווה כ 80% מכל מקרי השבץ. עם זאת, thrombolytic רקמת plasminogen activator (tPA) הוא הטיפול היחיד של שבץ איסכמי חריף שקיים. חוקרים בהראשות זו כדי לפתח מספר דגמי שבץ איסכמי במגוון מינים. שני סוגים עיקריים של מכרסמים פותחו: מודלים של איסכמיה המוחית הגלובלית או איסכמיה מוחית מוקדים. לחקות שבץ איסכמי בחולים, בכ 80% משיחות טרומבוטיים או תסחיפים מתרחשים בטריטוריה של עורק המוח האמצעי (MCA), חסימת עורק המוח האמצעית intraluminal (MCAO) מודל הוא די רלוונטי ללימודי שבץ. מודל זה פותח לראשונה בחולדות על ידי קואיזומי et al. בשנת 1986 ^1. בגלל הקלות של מניפולציה גנטית בעכברים, דגמים אלה גם פותחו ^ב2-3 מין זה. תוכן "> בזאת, אנו מציגים את הליך חסימת MCA החולף בC57/Bl6 עכברים. מחקרים קודמים דיווחו כי תכונות פיסיקליות של occluder כגון קוטר קצה, אורך, צורה וגמישות הן קריטיות לשחזור של נפח אוטם ^4. בזאת, בmonofilaments מצופי הסיליקון מסחרי (Doccol תאגיד) היה בשימוש. יתרון גדול נוסף הוא שmonofilament זה מקטין את הסיכון לדימומים לגרום subarachnoid. שימוש במיקרוסקופ סטריאו-STEMI צייס 2000, monofilament המצופה סיליקון הוכנס עורק התרדמה הפנימי (רשפ"ת) דרך חתך בעורק הראשי החיצוני (ECA) עד monofilament חוסם את הבסיס של MCA. זרימת דם שוחזרה 1 שעה מאוחר יותר על ידי הסרת monofilament לחקות השבת זרימת דם לאחר תמוגה של קריש בתרומבואמבוליים בני אדם. המידה של אוטם מוחי יכולה להיות מוערכת על ידי 1 ציון נוירולוגים ועל ידי המדידה של נפח האוטם.עכברי איסכמי נותחו ובכך לציון הנוירולוגים שלהם בזמנים שונים לאחר reperfusion. על מנת להעריך את נפח האוטם, מכתים עם כלוריד 2,3,5-triphenyltetrazolium (TTC) היה מבוצע בדרך כלל. בזאת, אנו משמשים מכתימים סגולים cresyl כן הוא מציע את ההזדמנות כדי לבדוק סמנים קריטיים רבים על ידי אימונוהיסטוכימיה. בסרטון הזה, אנו מדווחים על הליך MCAO; עשרות נוירולוגיות וההערכה של נפח האוטם ידי צביעה סגולה cresyl.

Protocol

חסימת עורק מוחית חולפת תיכונה (MCAO)

1. הליך ניתוח (איור 1)

חסימת עורק מוח אמצעית חלוף (tMCAO) מתבצעת ב 2 - לC57Bl גבר בן 3-חודש / 6 עכברים (22-28g). פרוטוקול זה אושר על ידי הטיפול בבעלי חי IRCM אתיקת הוועדה. כלים כירורגיים עוקרו על ידי מעוקר (121 מעלות צלזיוס ב 15 psi במשך 60 דקות). בין כל בעלי חיים, הם מעוקרים באמצעות חרוז המעקר החם (15 שניות). שולחן ניתוחים וציוד אחר המחוטאים באמצעות אתנול 70%.

שעות לפני הניתוח, עכברי analgesized עם עצירות (0.03 וויפ מ"ג / ק"ג).

איור 1 א '.

1. עמוק לטשטש את העכברים עם 5% isoflurane ולאחר מכן לשמור בהרדמת 2.5% isoflurane. טמפרטורת גוף של העכברים נשמרה קבועה במהלך ניתוח עם כרית חימום.
2. לחטא את הפרווה וskעם אתנול 70% או פולידין. מאז שחרורו מייצר גילוח שיער בר, microabrasions ודלקת שעשוי להשפיע על הפתופיזיולוגיה שבץ, אנחנו לא לגלח פרוות עכבר.
3. לעשות חתך קו אמצע צוואר ובעדינות לפרק את הרקמות הרכות.
4. תחת מיקרוסקופ סטריאו (STEMI 2000, Zeiss), לנתיחה בוטה מבוצעת כדי לחשוף את קנה הנשימה וחוזר בי את השרירים כדי לאתר את העורק הראשי.
5. עורק התרדמה המשותף השמאל (CCA) הוא גזור בקפידה מרקמות והמרכז לאמנות העכשווית היא באופן זמני על ידי occluded תפר זמני (1) באמצעות קיצוץ תפר משי 5-0 ל20 מגזרי מ"מ. זהירות רבה צריכה להיות למימוש שלא לפגוע בעצב vagal.
6. הפרד הסתעפות של עורק התרדמה המשותף השמאל הפנימי (רשפ"ת) ועורק תרדמה משותף חיצוני (ECA). תפר קבוע (2) ממוקם סביב ECA, כdistally ככל האפשר, ועוד פס דק מעט זמני (3) דגש על ECA דיסטלי כדיהסתעפות.
7. קליפ ICA השמאלי (4) שימוש בפינצטה הפוכה פעולה, כדי למנוע דימום. זהירות רבה צריכה להיות למימוש שלא לפגוע בעצב vagal.
8. לחתוך חור קטן לתוך ECA (5) בין (3) תפרים קבועים (2) וזמניים.

איור 1 ב.

9. להציג מ"מ באורך 6-0 12 סיליקון מצופה (כ 9-10mm הוא סיליקון המצופה) תפר monofilament (Doccol תאגיד) לECA (6), לחתוך ECA דיסטלי לתפר התמידי לגמרי ולהפוך occluder לרשפ"ת . התפר נקשר בחוזקה סביב monofilament כדי למנוע דימום ופינצטה הפוכת הפעולה יוסרה.
10. Occluder הוא הציג לסגור מוצא של MCA במעגל של ויליס. עצור החדרתה סביב 9-10 מ"מ מעבר להסתעפות של ECA ומרכז לאמנות עכשווית. Occluder חסום ולא יכול לזוז יותר. טיפול חייב להיות מופעל לא לחדור עורק pterygopalatine. התפר (3) על ECA הוא tigקשר htly לתקן monofilament בעמדה.
11. סגור את העור עם מערכת סגירת פצע autoclip.
12. מזריק 1 מ"ל של תמיסת מלח תת העור ולמקם את העכברים תחת מנורת חימום אינפרא אדום במשך כל התקופה שאחרי החסימה (60 דקות).

2. שחזור זרימת דם עורקי מוח האמצעית

לפני reanesthesia, neuroscore ניתן לבדוק כדי להעריך את ההצלחה של הניתוח.

1. הרדם את העכברים שתוארו כעבר ולהסיר את autoclips.
2. קצת לפתוח את התפר (3) על ECA כדי לאפשר נסיגת monofilament וreperfusion דם.
3. לצמיתות לקשור את התפר הזמני על ECA כדי למנוע איבוד דם. Monofilament נשמר לשימוש חוזר.
4. הסר את התפר הזמני (1) על המרכז לאמנות העכשווית כדי לאפשר סחרור דם.
5. לסגור את הפצע. העכברים צריכים לקבל פתרון אחר 1 מ"ל מי מלח תת עורי.
6. מקם את העכברים מתחת למנורת חימום אינפרא האדום לשעה 1. אחרי שווידאתי שהחיה חוזרת לניידות, העכבר חזר לכלוב שלו והשאיר תחת כרית החימום ומגבות ל72 שעות. שים לב שרק מחצית מהכלוב מונחת על כרית החימום כדי לאפשר לעכברים כדי לבחור את סביבתם. בגלל ירידה במשקל לאחר הניתוח נצפית בדרך כלל, אוכל פירה מונח בצלחת פטרי כדי לעודד אכילה.
   שתים עשר שעות לאחר הניתוח, עכברים קבלו מנה נוספת של עצירות (0.03 וויפ מ"ג / ק"ג).

3. מבצע שאם

לפעולות דמה, כל הנהלים זהים, הפרט שoccluder לא הוכנס.

4. Neuroscore

גירעונות נוירולוגיות לאפשר הערכה של ההצלחה של tMCAO רק לאחר reperfusion ומאוחר יותר להערכת מידת החומרה של פציעה. גירעונות נוירולוגיות מקבלים נקודות כפי שתואר קודם לכן ^{5 <}/ Sup> והופיע ב1, 24, 48 ושעות לאחר reperfusion 72. היקף מורחב שש נקודות משמש:

• 0: נורמלי.
• 1: קל מקיף התנהגות עם או בלי סיבוב עקבי כאשר לקח בזנב, ניסיונות <50% כדי לסובב לצד הנגדי.
• 2: קל עקבי חג, 50%> ניסיונות כדי לסובב לצד הנגדי.
• 3: בקנה אחד חזק ומקיף מיידיים, העכבר מחזיק בעמדת רוטציה במשך יותר מ 1-2 שניות, עם האף כמעט להגיע בזנבו.
• 4: סיבוב חמור המתקדם למתגלגל, אובדן הליכה או ליישר רפלקס.
• 5: תרדמת או גוסס.

5. הכתמים סגולים Cresyl (איור 2)

בעקבות זלוף הפתרון PBS, המוח מוקפא במהירות בisopentane ואוחסן ב -80 °מוחה ג עכבר ניתן גם perfused עם paraformaldehyde 4% (PFA) בהתאם למחקרי אימונוהיסטוכימיה המתוכננים. Cryostat חיתוך של חלקי מוח עטרה (17 מיקרומטר) מבוצע. סעיף אחד מתוך כל 30 נאסף על אותה השקופית שיש פגיעה מוחית נציג. לכימות נפח, 2 שקופיות מוכתמות מהכתמה סגולה cresyl ומערכת ניתוח תמונה (Scion תאגיד, פרדריק, מרילנד) שמש כדי להעריך את הנגע. היקף הפגיעה היה מחושב ביחידות שרירותיות (פיקסלים), ומבוטא באחוזים מהשטח הלא lesioned הנגדי עבור כל מקטע. שקופיות אחרות נשמרות ב-80 ° C ללימודי אימונוהיסטוכימיה. לחלופין, מוח PFA קבוע ניתן לחתוך ב30-50 מיקרומטר באמצעות vibratome ונפח האוטם נמדד כמומלץ על ידי האן et al. (2009) ^6.

תוצאות

הערכת neuroscore מאשרת את ההצלחה של tMCAO לאחר השבץ וקובעת את היעילות של הפוסט reperfusion tMCAO. בידות שלנו, כל העכברים נתונים להליך intraluminal הציג לפחות מסתלסל קל עקבי (neuroscore 2) ואת גירעונות הנוירולוגיות הם עד 72 שעות בדרך כלל יציבים. רוב עכברי תערוכה מסתלסלים עקבי קל (neuroscore 2). עכברים מראים היעדר מסתלסל הם הוצאו מהמחקר. עם זאת, הערכת neuroscore אינה מאפשרת לנו להבחין בין עכברים עם ההיפוקמפוס פצוע ואלה עם ההיפוקמפוס ללא פגע.

אין תמותה נצפתה במהלך יום הניתוח, טוענת כי דימומי subarachnoid לא התרחשו. כאשר הדימום תת עכבישים מזוהה בעכבר, זה לא נכלל באופן שיטתי מהניתוח. השימוש בחוט הניילון סיליקון מצופה מDoccol תאגיד, שהוא חלק יותר monofilaments הביתי מוכן, מגביר את ההצלחהtMCAO ומפחית את דימום subarachnoid. תמותה בין 24 שעות ועד 72 שעות היא 14% במודל זה, כפי שדווח באופן כללי ל60 דקות של חסימה. התמותה נצפתה היא כנראה בשל נפח אוטם גדול בעכבר זן זה. שחזור נגע חזק גם נצפה (סטיית תקן היא 15%), וזה מאוד מעניין ללמוד מולקולות neuroprotection בי ההשפעה שלהם (הים) יכולה להיות מוסתרת על ידי ההשתנות של המודל.

כדי להעריך את מידת פגיעה מוחית בעקבות tMCAO, אנחנו בחרנו להשתמש מכתימים סגולים cresyl (איור 2) ולא TTC על מנת שיהיה הרבה חומרים לבדיקת סמנים רלוונטיים ^6. היקף הפגיעה הוא יחסית עקבי. עם זאת, הבחין כי בעכברים מסוימים, ההיפוקמפוס נפצע (סביב 30% מעכברים). זה מעניין לציין כי הכתמים הסגולים cresyl יכולים להיות מיושם עד 1 שבוע מאוחר יותר. בספרות, שיעור האוטם מוחי משתנה מאחדללמוד לצד השני. זה תלוי בבחירה של עכבר זן, הרדמה, בעובי של חלקי מוח, חוט הניילון בשימוש, או בשימוש מכתים ^{6, 7.}

איור 1. ערכה של החסימה של עורק המוח האמצעי באמצעות monofilament intraluminal סיליקון מצופה. ערכה. פשוט של מוח עכבר ועורקי המוח מראים תפרים וקליפ רצופים כדי להכין את ההקדמה של monofilament סיליקון המצופה. B. עמדת monofilament באמצעות המעגל של ויליס מיוצגת. Monofilament מוחדר דרך ICA ECA כדי לחסום את הבסיס של MCA ACA, עורק המוח קדמי;. התואר ראשון, basilar עורק; מרכז לאמנות עכשווית, עורק תרדמה משותף; ג ויליס, מעגל של ויליס; ECA, החיצוני התרדמה arteר"י; יק"א, עורק התרדמה הפנימית; MCA, עורק המוח האמצעי; PCA, עורק תקשורת אחורי; PPA, עורק pterygopalatine.

איור 2. סעיפי עטרה יציגים של מוח עכבר המוכתם בסגול cresyl אחרי 72 שעות שלאחר reperfusion. אזור אוטם (בעיקר סטריאטום, קליפה ואזורי מוח סמוכים) מופיעים בלבן (בתוליים ידי סגול cresyl). נפח הפציעה (חלק לבן, אונה ימנית) היה מופרד ומבוטא כאחוז מהשטח הנגדי אינו lesioned (אונה שמאלית).

Discussion

מודלי שבץ שונים פותחו כדי לחקות השלכות שבץ בחולים. הבחירה במודל השבץ תלוי בשאלות הביולוגיות. מודל MCAO intraluminal מחק אחד מהסוגים הנפוצים ביותר של שבץ איסכמי בחולים והוא פחות פולשני ויותר עקבי מאשר מודל טאמורה ^4,7. זהו מודל מעניין באמת עבור ניתוחי מות neuroprotection, neurorepair ותא. הצלחתו של מודל intraluminal תלוי בגורמים רבים כמו מין חיה, גיל ומשקל, טמפרטורה, הרדמה וזמן הניתוח, אשר צריכים להיות בשליטה. לחזות הפיסית של occluder (טיפ קוטר, אורך, צורה וfexibility) היא קריטית לעקביות של MCAO ^4. בזאת, אנו משתמשים 6-0 12 monofilament מ"מ הארוך מצופה בסיליקון על 9-10 מ"מ מחברת Doccol. היתרון הגדול של monofilament זה הוא להפחית דימום subarachnoid ובגלל אורכו כיסה את כל ICAאורך זרימה, שיורי דם, אשר מגיעה מעורקי התקשורת של הקדמיים ואחוריים של המעגל של ויליס וPPA, נמנעת וההשתנות בירידות נפח האוטם (15% מהשתנות בידות שלנו) ^8. התפר של מרכז לאמנות עכשווית גם מקטין את השונות של נפח האוטם ^9.

היקף פגיעה המוחית tMCAO הבא יכול להיות מוערך על ידי דרכים שונות. גירעונות נוירולוגיות ניתן למדוד כאמור לעיל. עם זאת, קשה לי אמצעי יעיל בדרך זו. ההיקף האוטם מבוצע בדרך כלל על ידי מכתים TTC. לאחרונה, טכניקות תהודה מגנטיות משמשות גם, טכנולוגיה מעניינת במיוחד עבור טיפולי neuroprotective. כדי להבין את המנגנונים התאיים הבסיסיים המעורבים בשבץ כגון neurorepair, מוות של תאים או התפשטות תאים, המחקר של סמנים שונים על ידי אימונוהיסטוכימיה הוא קריטי ומאוד אינפורמטיבי. לפיכך, protocol הכנות סעיף במוח יש את היתרון הגדול של ניתוחים אלו מאפשרים, ומצמצם את מספר העכברים בשימוש. יתר על כן, Tureyen et al. ¹⁰ דיווח כי קיימת קורלציה טובה בין הכתמים סגולים cresyl וTTC.

Materials

מיקרוסקופ סטריאו	Zeiss	STEMI 2000
פנס עצמה גבוה סיבי אור	דולן-ג'נר תעשיות בע"מ
מערכת הרדמה לisoflurane
Isoflurane	CDMV	108737
שמיכת חימום	Gaymar Medsearch	TP22G
מנורת חימום אינפרא אדומה
Ultra פינצטה בסדר, סגנון 5	מדעי מיקרוסקופ אלקטרונים	78320-5TI
מספרי Vannas 3 קרח דק מ"מ, סטרייט	מדעי מיקרוסקופ אלקטרונים	72932-01
אורח LA-1 וMPF-1 כל הלהבים החלקים	מדעי מיקרוסקופ אלקטרונים	77926-5S
פינצטה פעולה שלילית, בסגנון 5 KOPINC	מדעי מיקרוסקופ אלקטרונים	72850-F
ביתור מספריים 5 1/2 "סטרייט	Cedarlane	72960
Autoclip המתנע סט	הרווארד מנגנון	34-0557
BD Autoclip פצע Syst סגירה., 9 מ"מ ארוך, 100/pk	פישר	01-804-5
5-0 תפר	הרווארד מנגנון	517763
תפר חומרי PDS השני monofilament סגול, 5-0, RB-1; Z303H	CDMV	6167
12 6-0 תפר monofilament סיליקון מצופה מ"מ ארוך	Doccol תאגיד	60SPRePK5
Seringes 1ml	פישר	14-823-2F
מחטי 26G1 / 2	פישר	BD-305111
IRCM