Modèle murin d'MCAO intraluminale: Évaluation infarctus cérébral par coloration au violet de crésyl

Résumé

Le modèle de milieu intraluminal occlusion cérébrale chez la souris est présentée ici. L'étendue de l'infarctus cérébral est évaluée par un score neurologique et coloration au violet de crésyl, une alternative à la coloration TTC, offrant le grand avantage de tester en parallèle de nombreux marqueurs d'intérêt.

Résumé

L'AVC est la troisième cause de mortalité et la première cause d'invalidité dans le monde. Ischémiques comptes course pour environ 80% de tous les AVC. Cependant, le thrombolytique activateur tissulaire du plasminogène (tPA) est le seul traitement de l'AVC ischémique aigu qui existe. Cela conduit les chercheurs à développer plusieurs modèles d'AVC ischémiques dans une grande variété d'espèces. Deux grands types de modèles de rongeurs ont été développés: des modèles d'ischémie cérébrale globale ou une ischémie cérébrale focale. Pour simuler un accident ischémique cérébral chez les patients chez lesquels environ 80% thromboses ou embolique se produire sur le territoire de l'artère cérébrale moyenne (ACM), l'occlusion intraluminale de l'artère cérébrale moyenne (MCAO) modèle est tout à fait pertinent pour les études de temps. Ce modèle a été développé chez le rat par Koizumi et al., En 1986 ^1. En raison de la facilité de manipulation génétique chez la souris, ces modèles ont été développés dans ce ^2-3 espèces. contenu "> Ici, nous présentons le MCA transitoire occlusion procédure C57/BL6 souris. études antérieures ont rapporté que les propriétés physiques de l'occlusion tels que diamètre de la pointe, la longueur, la forme et la flexibilité sont essentiels pour la reproductibilité du volume de l'infarctus ^4. Ici, un monofilaments de silicium commerciaux revêtus (Doccol Corporation) ont été utilisés. Un autre grand avantage est que ce monofilament réduit le risque d'induire des hémorragies sous-arachnoïdiennes. Utilisation du stéréomicroscope Zeiss Stemi 2000, le silicium monofilament revêtu a été introduit dans l'artère carotide interne (ACI) via une réduction de l'artère carotide externe (CEA) jusqu'à ce que le monofilament obture la base de la MCA. flux sanguin a été restaurée 1 heure plus tard par l'élimination du monofilament pour imiter la restauration du flux sanguin après lyse d'un caillot dans thromboembolique humains. L'étendue de l'infarctus cérébral peut être évalué par une première partition neurologiques et par la mesure du volume de l'infarctus.Souris ischémiques ont ainsi été analysés pour leur score neurologique à différents post-reperfusion fois. Pour évaluer le volume de l'infarctus, coloration avec du chlorure de 2,3,5-triphényltétrazolium (TTC) était habituellement réalisée. Ici, nous avons utilisé une coloration violet de crésyl, car il offre la possibilité de tester de nombreux marqueurs essentiels par immunohistochimie. Dans cette vidéo, nous présentons la procédure MCAO; scores neurologiques et l'évaluation du volume de l'infarctus par coloration au violet de crésyl.

Protocole

Occlusion transitoire Artère cérébrale moyenne (MCAO)

1. Procédure chirurgie (Figure 1)

Occlusion transitoire de l'artère cérébrale moyenne (tMCAO) est réalisée sur 2 - à 3 mois mâle C57BL / 6 souris (22-28g). Ce protocole a été approuvé par le soin des animaux de bioéthique de l'IRCM comité. Outils chirurgicaux sont stérilisés par autoclavage (121 ° C à 15 psi pendant 60 minutes). Entre chaque animal, ils ont été stérilisés à l'aide de la chaude stérilisateur à billes (15 sec). Table d'opération et d'autres équipements sont désinfectés à l'aide d'éthanol à 70%.

Deux heures avant la chirurgie, les souris ont été analgesized avec la buprénorphine (0,03 mg / kg BWIP).

Figure 1A.

1. Profondément anesthésier les souris avec l'isoflurane 5%, puis de maintenir l'anesthésie à l'isoflurane 2,5%. Température corporelle des souris est maintenue constante au cours de la chirurgie avec un coussin chauffant.
2. Désinfecter la fourrure et skdans l'éthanol à 70% ou Betadine. Depuis rasage produit fragment communiqué cheveux, microabrasions et l'inflammation qui peut avoir une incidence sur la physiopathologie course, nous n'avons pas raser la fourrure de la souris.
3. Faire une incision médiane du cou et tirez doucement en dehors des tissus mous.
4. Sous un microscope stéréo (Stemi 2000, Zeiss), une dissection est réalisée afin d'exposer la trachée et de rétracter les muscles pour localiser l'artère carotide.
5. L'artère carotide commune gauche (CCA) est soigneusement disséquée des tissus environnants et le CCA est temporairement fermé par une suture temporaire (1) en utilisant une suture de soie 5-0 coupé en 20 segments mm. Un grand soin doit être exercé pour ne pas nuire au nerf vagal.
6. Séparer la bifurcation de l'artère carotide interne gauche commune (ICA) et externe artère carotide commune (CEA). Suture permanent (2) est placé autour de l'ECA, comme distalement que possible, et un autre fil de suture temporaire légèrement serré (3) est placé sur le CEA distale de l'bifurcation.
7. Fixez le gauche ICA (4) à l'aide d'une pincette inverse d'action pour éviter les saignements. Un grand soin doit être exercé pour ne pas nuire au nerf vagal.
8. Découpez un petit trou dans la CEA (5) entre permanents (2) et temporaires (3) points de suture.

Figure 1B.

9. Introduire un 12 mm de long 6-0 siliconé (environ 9-10mm est revêtue de silicium) suture monofilament (Doccol Corporation) dans le CEA (6), couper complètement le CEA distale de la suture permanente et inverser le dispositif d'occlusion dans la LSA . La suture est étroitement lié autour du monofilament pour prévenir les saignements et les pinces inverse d'action sont supprimés.
10. L'obturateur est introduit pour obturer l'origine de la MCA dans le cercle de Willis. Arrêter son insertion autour de 9-10 mm au-delà de la bifurcation de la CEA et de l'ACC. L'obturateur est bloqué et ne peut plus bouger. Il faut prendre soin de ne pas pénétrer dans l'artère ptérygopalatine. La suture (3) sur le CEA est tightly liée à fixer le monofilament en position.
11. Fermer la peau avec un système de fermeture Autoclip plaie.
12. Injecter 1 ml de solution saline sous-cutanée et placez la souris sous une lampe à infrarouge de chauffage pendant toute la période post-occlusion (60 min).

2. Restauration du Moyen débit sanguin cérébral Artère

Avant reanesthesia, le neuroscore peut être vérifiée pour évaluer le succès de la chirurgie.

1. Anesthésier les souris comme décrit précédemment et enlever les autoclips.
2. Ouvrir légèrement la suture (3) sur la CEA pour permettre le retrait monofilament et la reperfusion sanguine.
3. Permanente attacher le fil de suture temporaire sur le CEA pour éviter la perte de sang. Le monofilament est conservé pour être réutilisé.
4. Retirez la suture temporaire (1) sur le CCA pour permettre la recirculation du sang.
5. Fermer la plaie. Les souris doivent recevoir une autre solution saline sous-cutanée de 1 ml.
6. Placez la souris sous la lampe chauffante infrarouge pendant 1 heure. Après avoir vérifié que l'animal ne reprenne la mobilité, la souris est ramené à sa cage et à gauche sous le coussin chauffant et serviettes pour 72 heures. Notez que seule la moitié de la cage est placée sur le coussin chauffant pour permettre souris pour choisir leur environnement. Parce que la perte de poids post-opératoire est généralement observé, de la nourriture en purée est placé dans une boîte de Pétri pour l'encourager à manger.
   Douze heures après la chirurgie, les souris ont reçu une dose de buprénorphine (0,03 mg / kg BWIP).

3. Opération Sham

Pour les opérations fictives, toutes les procédures sont identiques, sauf que l'obturateur n'est pas insérée.

4. Neuroscore

Les déficits neurologiques permettre l'évaluation de la réussite de tMCAO juste après la reperfusion et plus tard l'estimation du degré de gravité de la blessure. Les déficits neurologiques sont marqués comme précédemment décrit ^{5 <}/ Sup> et effectuée à 1, 24, 48 et 72 heures après la reperfusion. Un élargissement échelle de six points est utilisé:

• 0: normal.
• 1: légère encerclant le comportement avec ou sans rotation incompatibles quand ramassé par la queue, <50% des tentatives pour faire pivoter vers le côté controlatéral.
• 2: légère cohérente encerclant,> 50% des tentatives pour faire pivoter vers le côté controlatéral.
• 3: conforme forte et immédiate encerclant, la souris occupe une position de rotation pour plus de 1-2 secondes, avec son nez presque atteint sa queue.
• 4: rotation sévère progresse en barrique, la perte de la marche ou réflexe de redressement.
• 5: comateux ou moribond.

5. La coloration crésyl violet (figure 2)

Après perfusion solution de PBS, les cerveaux sont rapidement congelés dans l'isopentane et conservés à -80 °C. cerveaux de souris peut également être perfusés avec du paraformaldéhyde 4% (PFA) selon les études immunohistochimiques prévues. Cryostat les coupes coronales de coupes de cerveau (17 um) sont effectuées. Une partie de chaque 30 est collecté sur la même lame pour avoir une blessure cérébrale représentant. Pour la quantification du volume, 2 lames sont colorées par coloration au violet de crésyl et un système d'analyse d'image (Scion Corporation, Frederick, MD) a été utilisé pour évaluer la lésion. Le volume préjudice a été calculé en unités arbitraires (pixels), et exprimée en pourcentage de l'controlatéral non lésé zone pour chaque section. Autres diapositives sont conservées à -80 ° C pour les études d'immunohistochimie. Alternativement, PFA-fixe cerveau peut être coupé à 30-50 um en utilisant vibratome et le volume de l'infarctus mesurée tel que recommandé par Han et al. (2009) ^6.

Résultats

L'évaluation neuroscore confirme le succès de tMCAO post-AVC et détermine l'efficacité de la tMCAO post-reperfusion. Dans nos mains, toutes les souris soumises à la procédure intraluminale présenté au moins une légère curling cohérente (neuroscore 2) et les déficits neurologiques sont généralement stables jusqu'à 72 heures. La plupart des souris présentent une légère curling cohérente (neuroscore 2). Souris présentant absence de curling sont exclus de l'étude. Cependant, l'évaluation neuroscore ne nous permet pas de faire la distinction entre les souris avec un hippocampe blessés et ceux qui ont un hippocampe intact.

Aucune mortalité n'a été observée au cours de la chirurgie d'un jour, ce qui suggère que les hémorragies sous-arachnoïdiennes n'a pas eu lieu. Lorsque hémorragie sous-arachnoïdienne est identifié dans une souris, celle-ci est systématiquement exclus de l'analyse. L'utilisation du silicium revêtu de monofilament de Doccol Corporation, qui est plus lisse que préparés à la maison monofilaments, augmente le succès detMCAO et réduit les hémorragies sous-arachnoïdiennes. Mortalité entre 24 h et 72 h est de 14% dans ce modèle, comme c'est généralement rapportés pour 60 min d'occlusion. La mortalité observée est probablement due à un volume de l'infarctus important dans cette souche de souris. Une forte reproductibilité lésion a également été observée (écart-type est de 15%), ce qui est très intéressant pour étudier les molécules neuroprotectrices où leur effet (s) peuvent être dissimulés par la variabilité du modèle.

Pour évaluer l'étendue des lésions cérébrales à la suite tMCAO, nous avons opté d'utiliser une coloration violet de crésyl (figure 2) plutôt que TTC afin d'avoir une grande quantité de matériel à tester des marqueurs pertinents ^6. L'étendue de la lésion est relativement uniforme. Cependant, nous avons remarqué que chez certaines souris, l'hippocampe a été blessé (environ 30% des souris). Il est intéressant de noter que la coloration crésyl violet peut être appliqué jusqu'à 1 semaine plus tard. Dans la littérature, le pourcentage d'infarctus cérébral varie d'unétudier à l'autre. Il dépend du choix de la souche de souris, l'anesthésie, l'épaisseur des coupes de cerveau, le monofilament utilisé, ou la coloration utilisée ^{6, 7.}

Figure 1. Schéma de l'occlusion de l'artère cérébrale moyenne avec siliconé monofilament intraluminale. Un schéma. Simplifié de cerveau de souris et les artères cérébrales montrant sutures successives et le clip de préparer l'introduction de siliconé monofilament. B. La position du monofilament à travers le cercle de Willis est représenté. Le monofilament est introduit dans ICA via la CEA pour occlure la base du MCA ACA, artère cérébrale antérieure;. BA, basilaire artère; CCA, l'artère carotide commune; C. Willis, cercle de Willis; CEA, carotide externe artery, ICA, artère carotide interne; MCA, l'artère cérébrale moyenne, ACP, l'artère communicante postérieure; APP, artère ptérygopalatine.

Figure 2. Représentant des coupes coronales de cerveau de souris colorées au violet de crésyl après 72 heures post-reperfusion. Zone de l'infarctus (principalement le striatum, le cortex et les zones adjacentes du cerveau) apparaît en blanc (non colorées par crésyl violet). Le volume des blessures (partie blanche, l'hémisphère droit) a été délimitée et exprimée en pourcentage de l'controlatéral non lésé zone (hémisphère gauche).

Discussion

Différents modèles d'AVC ont été développés pour simuler les conséquences d'AVC chez les patients. Le choix du modèle de course dépend de la question biologique. Le modèle intraluminale MCAO imite l'un des types les plus communs de l'AVC ischémique chez les patients et est moins invasive et plus cohérent que le modèle de Tamura ^4,7. C'est un modèle très intéressant pour les analyses de la mort neuroprotection, neurorepair et cellulaire. Le succès du modèle intraluminale dépend de nombreux facteurs tels que le sexe des animaux, l'âge et le poids, la température, l'anesthésie et le moment de la chirurgie, qui doivent être contrôlés. Les propriétés physiques de l'obturateur (diamètre de pointe, la longueur, la forme et la fexibilité) sont essentielles à la cohérence de la MCAO ^4. Ici, nous utilisons le long de 12 mm 6-0 monofilament revêtu de silicium sur 9-10 mm de Doccol Corporation. Le grand avantage de ce monofilament est de réduire les hémorragies sous-arachnoïdiennes et parce que sa longueur couvrait tout l'ICAlongueur, le débit sanguin résiduel qui provient des artères communicantes antérieure et postérieure du cercle de Willis et PPA, est empêchée et la variabilité des baisses des volumes d'infarctus (15% de la variabilité dans nos mains) ^8. Le fil de suture de la DPA diminue également la variabilité du volume d'infarctus ^9.

L'étendue de la lésion cérébrale qui suit tMCAO peut être évaluée de différentes façons. Les déficits neurologiques peuvent être mesurés comme précédemment mentionné. Cependant, il est difficile d'avoir une mesure efficace de cette façon. L'étendue de l'infarctus est généralement effectuée par coloration TTC. Plus récemment, des techniques de résonance magnétique sont également utilisés, une technologie particulièrement intéressante pour les traitements neuroprotecteurs. Pour comprendre les mécanismes cellulaires sous-jacents impliqués dans la course comme neurorepair, la mort cellulaire ou la prolifération cellulaire, l'étude de différents marqueurs par immunohistochimie est essentiel et très instructif. Ainsi, notre protocol de préparations section du cerveau a le grand avantage de permettre à ces analyses, et réduit le nombre de souris utilisées. En outre, Tureyen et al. ¹⁰ ont signalé qu'il existe une bonne corrélation entre les taches violet de crésyl et TTC.

matériels

Microscope stéréoscopique	Zeiss	Stemi 2000
Fibre-Light Illuminator à haute intensité	Dolan-Jenner Industries Inc
L'isoflurane	CDMV	108737
Gaymar Medsearch	TP22G
Lampe de chauffage infrarouge
Ultra fine pince à épiler, style 5	Sciences microscopie électronique	78320-5TI
Ciseaux Vannas 3 Bord de coupe mm, droite	Sciences microscopie électronique	72932-01
Style de LA-1 et MPF-1 Toutes les lames lisses	Sciences microscopie électronique	77926-5S
Pincettes action négative, le style KOPINC 5	Sciences microscopie électronique	72850-F
Dissection Ciseaux 5 1/2 "Straight	Cedarlane	72960
Autoclip Kit de démarrage	Harvard appareil	34-0557
BD Autoclip plaies Syst clôture., 9mm de long, 100/pqt	Fisher	01-804-5
5-0 suture	Harvard appareil	517763
Suture monofilament matériau PDS II violet, 5-0, RB-1; Z303H	CDMV	6167
12 mm de long 6-0 suture monofilament siliconé	Doccol Corporation	60SPRePK5
Seringes 1ml	Fisher	14 à 823-2F
Aiguilles 26G1 / 2	Fisher	BD-305111
IRCM