Мыши Модель внутрипросветного MCAO: церебральный Оценка инфаркта на Cresyl Окрашивание Фиолетовый

Резюме

Внутрипросветного средней мозговой модель прикуса у мышей здесь представлены. Объем инфаркта головного мозга оценивается неврологический результат и крезиловый окрашивания фиолетовый, альтернативные окрашивания TTC, предлагая большое преимущество для проверки параллельно многих маркеров интерес.

Аннотация

Инсульт является третьей причиной смертности и ведущей причиной инвалидности в мире. Ишемический инсульт приходится около 80% всех инсультов. Тем не менее, ткани тромболитической активатора плазминогена (ТАП) является единственным лечения острого ишемического инсульта, что существует. Это привело исследователей к разработке нескольких моделей ишемического инсульта в различные виды. Два основных вида грызунов модели были разработаны: модели глобальной ишемии головного мозга или церебральной ишемии. Для имитации ишемического инсульта у пациентов, у которых примерно 80% тромботических или эмболических инсультов происходят на территории средней мозговой артерии (СМА), внутрипросветного окклюзии средней мозговой артерии (MCAO) модель является весьма актуальной для хода исследования. Эта модель была впервые разработана в крыс Коидзуми и соавт., В 1986 ^1. Из-за легкости генетических манипуляций у мышей, эти модели были разработаны для этого вида ^2-3. Содержание "> Здесь мы представляем переходного MCA окклюзии процедуры в C57/BL6 мышей. Предыдущие исследования показали, что физические свойства окклюдера, таких как чаевые диаметр, длина, форма и гибкость имеют важное значение для воспроизводимости объем инфаркта ^4. При этом, технического кремния покрытием мононитей (Doccol Corporation) были использованы. Другим большим преимуществом является то, что эта леска снижает риск вызвать субарахноидального кровоизлияния. Использование Zeiss стерео-микроскоп Stemi 2000, кремния покрытием леска была введена во внутренней сонной артерии (ICA) через разрез во внешней сонной артерии (ECA), пока леска закрывает базу MCA. кровотока было восстановлено через 1 час после удаления из мононити, чтобы имитировать восстановление кровотока после лизиса сгустка в тромбоэмболические людей. степени инфаркта головного мозга могут быть оценены сначала неврологических оценка и измерение объема инфаркта.Ишемический мышей таким образом, анализировали их оценка неврологического на различных пост-реперфузии раз. Чтобы оценить объем инфаркта, окрашивание с 2,3,5-трифенилтетразолий хлорид (ТТС), как правило, выполняются. Здесь мы использовали крезиловый фиолетового окрашивания, поскольку он предоставляет возможность проверить многие важные маркеры иммуногистохимии. В этом видео, мы сообщаем MCAO процедуры; неврологической оценки и оценки объема инфаркта на крезиловый окрашивание фиолетовым.

протокол

Переходный окклюзии средней мозговой артерии (MCAO)

1. Хирургия процедуры (рис. 1)

Переходный окклюзии средней мозговой артерии (tMCAO) осуществляется на 2 - 3-месячный летний мужчина C57BL / 6 (22-28г). Этот протокол был одобрен IRCM помощи комитета по биоэтике животных. Хирургические инструменты были стерилизованы в автоклаве (121 ° C при 15 фунтов на квадратный дюйм в течение 60 мин). Между каждого животного, они были стерилизованы с использованием горячего шарика стерилизатор (15 сек). Таблица хирургии и другое оборудование продезинфицировать с использованием 70% этанола.

За два часа до операции, мышей analgesized с бупренорфин (0,03 мг / кг bwip).

Рисунок 1А.

1. Глубоко анестезию мышей с изофлуран 5%, а затем сохранить анестезии на уровне 2,5% изофлурана. Температура тела мышей поддерживается постоянным во время операции с грелку.
2. Лечить меха и скВ 70% этанола или Бетадин. Так как бритье волос приводит фрагмент релизе, microabrasions и воспаления, которые могут повлиять на ход патофизиологии, мы не брить мыши меха.
3. Сделайте срединный разрез шеи и осторожно потяните, кроме мягких тканей.
4. Под стерео микроскоп (Stemi 2000, Zeiss), тупой диссекции осуществляется подвергать трахеи и убрать мышцы, чтобы найти сонную артерию.
5. Левой общей сонной артерии (ОСА) тщательно расчлененный от окружающих тканей и ОСО временно поглощается временный шов (1) с 5-0 шелковых шва нарезать на 20 мм сегменты. Большая осторожность следует проявлять, чтобы не навредить блуждающего нерва.
6. Отделить бифуркации левой внутренней сонной артерии (ВСА) и внешние общей сонной артерии (ECA). Постоянного шва (2), расположенных вокруг ЭКА, а дистально, как это возможно, и другой временный шов слегка жесткие (3) находится на ЭКА дистальнеебифуркации.
7. Клип левой ВСА (4) использование обратного действия пинцетом, чтобы избежать кровотечения. Большая осторожность следует проявлять, чтобы не навредить блуждающего нерва.
8. Сокращение маленькое отверстие в ECA (5) между постоянными (2) и временные (3) швов.

Рисунок 1б.

9. Ввести 12 мм длиной 6-0 кремния покрытием (около 9-10мм покрыта кремния) мононити шов (Doccol Corporation) в ECA (6), полностью вырезать ECA дистальнее шва постоянным и инвертировать окклюдера в ICA . Шов плотно завязан вокруг мононити, чтобы предотвратить кровотечение и обратное действие пинцетом удаляют.
10. Окклюдера вводится закрывают происхождения MCA в круг Уиллиса. Остановить его введения около 9-10 мм за пределы бифуркации ЭКА и ССА. Окклюдера заблокирован и не может больше двигаться. Следует быть внимательным, чтобы не проникнуть в крылонебной артерии. Шва (3) на ЕЦА TIGhtly связали, чтобы исправить мононити на месте.
11. Закрыть кожи с закрытием системы рану AutoClip.
12. Вводят 1 мл физиологического раствора подкожно и поместить мышей под инфракрасной лампой отопления в течение всего после окклюзии периода (60 мин).

2. Восстановление средней мозговой артерии кровотока

Перед reanesthesia, neuroscore могут быть проверены, чтобы оценить успех операции.

1. Anesthetize мышей, как описано ранее, и удалить autoclips.
2. Слегка приоткройте шва (3) на ЭКА, чтобы вывод мононити и кровь реперфузии.
3. Постоянно завязать временный шов на ЭКА для предотвращения потери крови. Мононити хранятся для дальнейшего использования.
4. Удалите временный шов (1) на ОСО, чтобы позволить крови рециркуляции.
5. Закрыть рану. Мыши должны получать еще 1 мл физиологического раствора подкожно.
6. Поместите мышей под инфракрасной лампой нагревания в течение 1 часа. Убедившись, что животное восстанавливает подвижность, мышь возвращается в клетку и оставили под грелку и полотенца в течение 72 часов. Обратите внимание, что только половина из клетки помещают на грелку, чтобы мыши выбирать свою среду. Потому что после хирургического потеря веса наблюдается, как правило, пюре пищу помещают в чашку Петри поощрять едой.
   Двенадцать часов после операции, мышей получала очередную дозу бупренорфина (0,03 мг / кг bwip).

3. Sham операции

Для операций обман, все процедуры идентичны, за исключением, что окклюдера не установлена.

4. Neuroscore

Неврологические дефициты позволяют оценить успех tMCAO сразу после реперфузии, а затем оценки степени тяжести травмы. Неврологические дефициты забил, как описано выше ^{5 <}/ SUP> и осуществляется на 1, 24, 48 и 72 ч после реперфузии. Расширенный шестибалльной шкале используются:

• 0: нормальный.
• 1: мягкая кружили поведения с или без вращения несовместимыми при поднятии за хвост, <50% попыткам повернуть в противоположную сторону.
• 2: мягкое последовательное кружась,> 50% попыткам повернуть в противоположную сторону.
• 3: соответствует сильной и немедленной кружась, мышь имеет вращение положении более 1-2 сек, с ее носа почти достигает своего хвоста.
• 4: тяжелая прогрессирующая вращения в бочкообразности, потери при ходьбе или рефлекса.
• 5: коматозном или умирающим.

5. Cresyl Окрашивание Violet (рис. 2)

После перфузии решение PBS, мозг быстро замораживали в изопентан и хранят при температуре -80 °C. мышь мозг также может быть перфузию 4% параформальдегида (PFA) в зависимости от планируемого исследования иммуногистохимии. Криостат сокращений корональные срезы головного мозга (17 мкм) не выполняются. Одна часть из каждых 30 собираются на том же слайде иметь представителя черепно-мозговой травмы. Для определения количественного, 2 горки окрашиваются по крезиловый окрашивание фиолетового и системы анализа изображений (Scion Corporation, Frederick, MD) был использован для оценки поражения. Травмы объеме рассчитывается в условных единицах (пикселях), и выражается в процентах от контралатеральной без поражений области для каждого раздела. Другие слайды хранятся при -80 ° С для иммуногистохимии исследований. Кроме того, PFA-фиксированные мозга могут быть сокращены на 30-50 мкм с использованием vibratome и объем инфаркта измеряется в соответствии с рекомендациями Хан и др.. (2009) ^6.

Результаты

Оценка neuroscore подтверждает успех tMCAO после инсульта и определяет эффективность tMCAO после реперфузии. В наших руках, все мышей, подвергнутых процедуре внутрипросветного представлены по крайней мере, мягкий соответствует керлинга (neuroscore 2) и неврологического дефицита, как правило, стабильны до 72 часов. Большинство мышей обладают мягким соответствует керлинга (neuroscore 2). Мыши показывающие отсутствие скручивания исключены из исследования. Тем не менее, оценка neuroscore не позволяют нам провести различие между мышами с потерпевшей гиппокампе и те, с нетронутыми гиппокампа.

Нет смертности наблюдалось во время операции день, предполагая, что субарахноидального кровоизлияния не происходит. Когда субарахноидального кровоизлияния определяется в мышь, на этот раз систематически исключаются из анализа. Использование кремния покрытием из мононити Doccol Corporation, которая является более гладкой, чем домашнего приготовления мононитей, повышает успешностьtMCAO и снижает субарахноидального кровоизлияния. Смертность в период с 24 часов и 72 часа составляет 14%, в этой модели, как правило, сообщается в течение 60 мин окклюзии. Смертность наблюдается, вероятно, из-за большого объема инфаркта в этой мыши штамма. Сильное поражение воспроизводимость также наблюдается (стандартное отклонение составляет 15%), который является очень интересной для изучения нейропротекции молекул, где их эффект (ы) может быть скрыта изменчивости модели.

Для оценки степени повреждения мозга после tMCAO, мы решили использовать крезиловый фиолетового окрашивания (рис. 2), а не TTC того, чтобы иметь много материалов для проверки соответствующими маркерами ^6. Степень поражения является относительно постоянной. Тем не менее, мы заметили, что в некоторых мышей, гиппокамп был ранен (около 30% мышей). Интересно отметить, что крезиловый фиолетового окрашивания можно применять до 1 недели позже. В литературе, доля мозга инфаркт варьируется от одногоучиться в другой. Это зависит от выбора мыши штамма, анестезия, толщина срезов головного мозга, мононити используется или окрашивания использовались ^{6, 7.}

Рисунок 1. Схема окклюзии средней мозговой артерии с использованием кремния покрытием внутрипросветного мононити. . Упрощенная схема мозга мыши и церебральных артерий с указанием следующих швов и клип для подготовки к внедрению кремния покрытием мононити. B. Положение моноволокна через круг Уиллиса представлена. Моноволокно вводят в ICA через ЭКА закрывать базу MCA ACA, передней мозговой артерии;. BA, основной артерии; CCA, общей сонной артерии; C. Уиллис, Круг Уиллис; ЭКА, наружной сонной артеры, ICA, внутренняя сонная артерия; MCA, средней мозговой артерии; СПС, задней соединительной артерии; PPA, крылонебной артерии.

Рисунок 2. Представитель корональных участков головного мозга мыши окрашивали крезиловый фиолетовый через 72 ч после реперфузии. Инфаркта область (главным образом полосатого тела, мозга и прилегающих районах мозга) появляется в белом (запятнано крезиловый фиолетовый). Объем травмы (белая часть, правое полушарие) был разделителями и выражается в процентах от контралатеральной без поражений область (левое полушарие).

Обсуждение

Различные тактные модели были разработаны, чтобы имитировать последствия инсульта у пациентов. Выбор хода модели зависит от биологических вопрос. Внутрипросветного модели MCAO имитирует один из наиболее распространенных типов ишемического инсульта у пациентов и менее инвазивных и более последовательно, чем модель Tamura ^4,7. Это действительно интересная модель для анализа нейропротекция, neurorepair и гибели клеток. Успех внутрипросветного модели зависит от многих факторов, таких как животное пола, возраста и веса, температуры, анестезии и во время операции, которая должна быть под контролем. Физические приличий из окклюдера (макс. диаметр, длина, форма и fexibility) имеют решающее значение для согласованности MCAO ^4. Здесь мы используем 12 мм длиной 6-0 мононити покрыта кремния на 9-10 мм от корпорации Doccol. Большим преимуществом этого леска является уменьшение субарахноидального кровоизлияния и потому, что его длина охватывает все ICAДлина, остаточный поток крови, который идет от передней и задней соединительной артерии Круг Уиллис и PPA, предотвращается и изменчивости в инфаркт уменьшается объем (15% изменчивости в наших руках) ^8. Шва ОСО также уменьшает изменчивость объема инфаркта ^9.

Степень повреждения мозга следующий tMCAO можно оценить по-разному. Неврологического дефицита может быть измерена как уже упоминалось ранее. Тем не менее, трудно иметь эффективные меры по этому пути. Объем инфаркта обычно проводится путем окрашивания TTC. Совсем недавно магнитного резонанса используются также особенно интересные технологии нейропротекторное лечение. Чтобы понять основные клеточные механизмы, участвующие в ход такие как neurorepair, гибели клеток или пролиферации клеток, изучение различных маркеров с помощью иммуногистохимии является критической и очень информативно. Таким образом, наши protocол препаратов мозга раздел имеет большое преимущество, что позволяет эти анализы, и сводит к минимуму количество мышей использовали. Кроме того, Tureyen и др. ^10. Сообщили, что есть хорошая корреляция между крезиловый окрашивание фиолетового и TTC.

Материалы

Стерео микроскоп	Zeiss	Stemi 2000
Волоконно-Light Высокая интенсивность подсветки	Dolan-Jenner Industries, Inc
Анестезия системы изофлуран
Isoflurane	CDMV	108737
Отопление одеяло	Гаймар Medsearch	TP22G
Инфракрасные лампы отопления
Ultra тонкий пинцет, стиль 5	Электрон наук микроскопии	78320-5ти
Vannas Ножницы 3 мм Cutting Edge, Straight	Электрон наук микроскопии	72932-01
Стиль LA-1 и MPF-1 все гладкие лезвия	Электрон наук микроскопии	77926-5S
Отрицательное действие пинцета, стиль KOPINC 5	Электрон наук микроскопии	72850-F
Пройдя ножницы 5 1/2 "Straight	Cedarlane	72960
AutoClip стартовый набор	Harvard аппарата	34-0557
BD AutoClip закрытия ран Syst., 9 мм длиной, 100/pk	Fisher	01-804-5
5-0 шва	Harvard аппарата	517763
Шовный материал PDS II мононить фиолетовый, 5-0, RB-1; Z303H	CDMV	6167
12 мм длиной 6-0 кремния покрытием мононити шов	Doccol корпорации	60SPRePK5
Seringes 1 мл	Fisher	14-823-2F
Иглы 26G1 / 2	Fisher	BD-305111
IRCM