Modelo de ratón de MCAO intraluminal: Evaluación del infarto cerebral mediante tinción con violeta de cresilo

Resumen

El medio de oclusión intraluminal modelo cerebral en ratones se presentan en la presente memoria. La extensión del infarto cerebral se evaluó mediante una puntuación neurológica y tinción con violeta de cresilo, una alternativa a la tinción con TTC, que ofrece la gran ventaja de prueba en paralelo marcadores de interés muchos.

Resumen

El accidente cerebrovascular es la tercera causa de mortalidad y la principal causa de discapacidad en el mundo. Isquémicos cuentas de recorrido para aproximadamente el 80% de todos los accidentes cerebrovasculares. Sin embargo, el trombolítico activador del plasminógeno tisular (tPA) es el único tratamiento del accidente cerebrovascular isquémico agudo que existe. Estos investigadores llevaron a desarrollar varios modelos de accidente cerebrovascular isquémico en una variedad de especies. Dos tipos principales de modelos de roedores se han desarrollado: modelos de isquemia global cerebral o isquemia cerebral focal. Para imitar el accidente cerebrovascular isquémico en los pacientes, en los cuales aproximadamente el 80% Ataques cerebrales trombóticos o embólicos ocurren en el territorio de la arteria cerebral media (MCA), la oclusión intraluminal de arteria cerebral media (MCAO) el modelo es muy relevante para los estudios de tiempos. Este modelo fue desarrollado por primera vez en ratas por Koizumi et al. En 1986 ^1. Debido a la facilidad de manipulación genética en ratones, estos modelos también se han desarrollado en este ^2-3 especies. contenido "> Aquí, se presenta el procedimiento de oclusión MCA transitoria en ratones C57/BL6. Estudios previos han informado que las propiedades físicas del dispositivo de oclusión tales como diámetro de la punta, la longitud, la forma y la flexibilidad son fundamentales para la reproducibilidad del volumen de infarto ^4. aquí, un monofilamentos silicio comerciales recubiertos (Doccol Corporation) han sido utilizados. Otra gran ventaja es que este monofilamento reduce el riesgo de inducir hemorragias subaracnoideas. Usando el estereomicroscopio Zeiss Stemi 2000, el monofilamento recubierto de silicona se introduce en la arteria carótida interna (ICA) a través de un corte en la arteria carótida externa (ECA) hasta que el monofilamento ocluye la base de la MCA. El flujo sanguíneo fue restaurado 1 hora después de la eliminación del monofilamento para imitar la restauración del flujo sanguíneo después de la lisis de un coágulo en tromboembólica los seres humanos. La extensión de infarto cerebral pueden ser evaluados primero por una puntuación neurológica y por la medición del volumen del infarto.Ratones isquémicos fueron analizados tanto por su puntuación neurológica en diferentes tiempos después de la reperfusión. Para evaluar el volumen del infarto, la tinción con cloruro de 2,3,5-trifeniltetrazolio (TTC) se llevó a cabo por lo general. En esto, se utilizó tinción con violeta de cresilo, ya que ofrece la oportunidad de probar muchos marcadores críticos por inmunohistoquímica. En este vídeo, se presenta el procedimiento MCAO, los resultados neurológicos y la evaluación del volumen de infarto por tinción con violeta de cresilo.

Protocolo

Oclusión transitoria de la arteria cerebral media (MCAO)

1. Cirugía de Procedimiento (Figura 1)

Oclusión transitoria de la arteria cerebral media (tMCAO) se realiza en 2 - a 3-meses de edad de sexo masculino C57BL / 6 ratones (22-28g). Este protocolo fue aprobado por el cuidado de los animales bioética IRCM comité. Los instrumentos quirúrgicos se esterilizaron mediante tratamiento en autoclave (121 ° C a 15 psi durante 60 min). Entre cada animal, que fueron esterilizadas mediante el calor esterilizador de cuentas (15 segundos). Mesa de cirugía y otros equipos se desinfectan con 70% de etanol.

Dos horas antes de la cirugía, los ratones se analgesized con buprenorfina (0,03 mg / kg bwip).

Figura 1A.

1. Profundamente anestesiar a los ratones con isoflurano 5% y luego mantener la anestesia con isoflurano al 2,5%. La temperatura corporal de los ratones se mantiene constante durante la cirugía con una almohadilla térmica.
2. Desinfecte la piel y skcon 70% de etanol o Betadine. Desde el afeitado produce liberación de pelo fragmento, microabrasiones y la inflamación que puede repercutir en la fisiopatología de golpe, no afeitarse la piel del ratón.
3. Hacer una incisión en la línea media del cuello y suavemente separar los tejidos blandos.
4. Bajo un microscopio estéreo (Stemi 2000, Zeiss), una disección roma se realiza para exponer la tráquea y retraer los músculos para localizar la arteria carótida.
5. La arteria carótida común izquierda (CCA) se diseca cuidadosamente del tejido circundante y la CCA está temporalmente ocluido por una sutura temporal (1) con sutura de seda 5-0 corte en segmentos de 20 mm. Gran cuidado debe ejercerse para no dañar el nervio vago.
6. Separe la bifurcación de la izquierda interna arteria carótida común (ICA) y la arteria carótida externa común (ECA). Una sutura permanente (2) se coloca alrededor de la ECA, como distalmente como sea posible, y otra sutura temporal ligeramente apretado (3) se coloca en la ECA distal a labifurcación.
7. Clip de la ACI izquierda (4) utilizando unas pinzas de acción inversa para evitar el sangrado. Gran cuidado debe ejercerse para no dañar el nervio vago.
8. Corte un pequeño agujero en la CEPA (5) entre permanentes (2) y temporal (3) puntos de sutura.

La figura 1B.

9. Introducir un 12 mm de largo 6-0 revestido con silicio (alrededor de 9-10mm es recubierto de silicona) sutura de monofilamento (Doccol Corporation) en la ECA (6), cortar completamente el ECA distal a la sutura permanente e invertir el oclusor en la ICA . La sutura está fuertemente atada alrededor del monofilamento para evitar el sangrado y las pinzas de acción inversa se eliminan.
10. El oclusor se introdujo para ocluir el origen de la MCA en el círculo de Willis. Deje su inserción en torno a 9-10 mm más allá de la bifurcación de la CEPA y la CCA. El oclusor está bloqueado y no se puede mover más. Se debe tener cuidado de no penetrar en la arteria esfenopalatino. La sutura (3) en el ECA es tightly atado para fijar el monofilamento en posición.
11. Cierre de la piel con un sistema de cierre autoclip herida.
12. Inyectar 1 ml de solución salina por vía subcutánea y colocar los ratones bajo una lámpara de calentamiento por infrarrojos durante todo el período de post-oclusión (60 min).

2. Restauración del Medio flujo cerebral sanguíneo de la arteria

Antes de reanesthesia, la neuroscore se pueden comprobar para evaluar el éxito de la cirugía.

1. Anestesiar a los ratones descritas anteriormente, y eliminar las autograpas.
2. Abra ligeramente la sutura (3) en la ECA para permitir la retirada de monofilamento y reperfusión sanguínea.
3. Permanentemente atar la sutura temporal de la ECA para evitar la pérdida de sangre. El monofilamento se mantiene para su reutilización.
4. Retirar la sutura temporal (1) en el CCA para permitir la recirculación de sangre.
5. Cerrar la herida. Los ratones deben recibir otra solución de 1 ml de solución salina por vía subcutánea.
6. Coloque los ratones bajo la lámpara de calor infrarrojo para 1 hr. Después de comprobar que el animal recupera la movilidad, el ratón se devolvió a su jaula y se dejó bajo la almohadilla de calefacción y toallas para 72 hr. Tenga en cuenta que sólo la mitad de la jaula se coloca sobre la almohadilla de calentamiento para permitir que los ratones a elegir su medio ambiente. Debido post-quirúrgico de pérdida de peso se observa en general, alimentos en puré se coloca en una placa de Petri para promover la alimentación.
   Doce horas después de la cirugía, los ratones recibieron otra dosis de buprenorfina (0,03 mg / kg bwip).

3. Sham operación

Para operaciones simuladas, todos los procedimientos son idénticos excepto que el oclusor no está insertada.

4. Neuroscore

Déficits neurológicos permitir la evaluación del éxito de tMCAO justo después de la reperfusión y después de la estimación del grado de gravedad de la lesión. Déficits neurológicos se obtuvo como se ha descrito previamente ^{5 <}/ Sup> y realizaron a 1, 24, 48 y 72 horas después de la reperfusión. Una amplia escala de seis puntos se utiliza:

• 0: normal.
• 1: leve rodeando comportamiento con o sin rotación inconsistente al cogerlo por la cola, <50% de los intentos para girar hacia el lado contralateral.
• 2: leve consistente en círculos,> 50% de los intentos para girar hacia el lado contralateral.
• 3: consistente fuerte e inmediato en circuito, el ratón tiene una posición de rotación de más de 1-2 segundos, con la nariz casi llegando a la cola.
• 4: Rotación grave progresando en encubado, pérdida del reflejo de enderezamiento o caminar.
• 5: comatoso o moribundos.

5. Tinción con violeta de cresilo (Figura 2)

Tras la perfusión de solución de PBS, los cerebros se congelaron rápidamente en isopentano y se almacenaron a -80 °C. cerebros de ratón puede ser también perfundidos con paraformaldehído al 4% (PFA) en función de los estudios de inmunohistoquímica planificadas. Criostato de separación de las secciones del cerebro coronal (17 micras) se realizan. Una sección de cada 30 se recogen en la misma diapositiva de sufrir una lesión cerebral representante. Para la cuantificación del volumen, 2 portaobjetos se tiñen mediante tinción con violeta de cresilo y un sistema de análisis de imágenes (Scion Corporation, Frederick, MD) se usó para evaluar la lesión. El volumen de lesión se calculó en unidades arbitrarias (pixeles), y se expresó como un porcentaje de la contralateral no lesionado área de cada sección. Otras diapositivas se guardan a -80 ° C para estudios de inmunohistoquímica. Alternativamente, PFA-fijo cerebro puede ser cortado a 30-50 micras utilizando vibratome y el volumen del infarto medido según lo recomendado por Han et al. (2009) ^6.

Resultados

La evaluación neuroscore confirma el éxito de tMCAO post-apoplejía y determina la eficiencia de la tMCAO después de la reperfusión. En nuestras manos, todos los ratones sometidos al procedimiento intraluminal presenta al menos una leve consistente Curling (neuroscore 2) y los déficit neurológicos son generalmente estables hasta 72 hr. La mayoría de los ratones muestran una leve rizado consistente (neuroscore 2). Los ratones que muestran ausencia de rizado se excluyeron del estudio. Sin embargo, la evaluación neuroscore no nos permite distinguir entre los ratones con un hipocampo lesionado y los que tienen un hipocampo intacto.

No se observó mortalidad durante el día de la cirugía, lo que sugiere que las hemorragias subaracnoideas no ocurrió. Cuando la hemorragia subaracnoidea se identifica en un ratón, éste es sistemáticamente excluidos del análisis. El uso de silicio recubierto con monofilamento de Doccol Corporation, que es más suave que preparados en casa monofilamentos, incrementa el éxito detMCAO y reduce la hemorragia subaracnoidea. La mortalidad entre 24 hr y 72 hr es 14% en este modelo, como generalmente se informó de 60 minutos de oclusión. La mortalidad observada se debe probablemente a un volumen de infarto grande en esta cepa de ratón. Una reproducibilidad lesión fuerte también se ha observado (desviación estándar es 15%), que es muy interesante para estudiar las moléculas de neuroprotección donde podría ser su efecto (s) ocultas por la variabilidad del modelo.

Para evaluar el alcance de la lesión cerebral después de tMCAO, se optó por utilizar tinción con violeta de cresilo (Figura 2) en lugar de TTC con el fin de tener una gran cantidad de materiales a prueba de marcadores relevantes ^6. La extensión de la lesión es relativamente consistente. Sin embargo, nos dimos cuenta de que en algunos ratones, el hipocampo se lesionó (alrededor del 30% de los ratones). Es interesante notar que la tinción de violeta de cresilo se puede aplicar hasta 1 semana después. En la literatura, el porcentaje de infarto cerebral varía de unestudiar a la otra. Depende de la elección de la cepa de ratón, la anestesia, el espesor de las secciones del cerebro, el monofilamento usado, o la tinción utilizado ^{6, 7.}

Figura 1. Esquema de la oclusión de la arteria cerebral media utilizando silicio recubierto con monofilamento intraluminal. Un esquema. Simplificado de cerebro de ratón y las arterias cerebrales que muestran suturas sucesivas y clip de preparar la introducción de silicio recubierto con monofilamento. B. La posición de monofilamento a través del círculo de Willis se representa. El monofilamento se introduce en la ACI a través de ECA para ocluir la base de la MCA ACA, la arteria cerebral anterior;. BA, arteria basilar, CCA, arteria carótida común; C. Willis, Círculo de Willis; ECA, la carótida externa artery, ICA, la arteria carótida interna, MCA, la arteria cerebral media, PCA, arteria comunicante posterior, PPA, arteria esfenopalatino.

Figura 2. Representativos secciones coronales de cerebro de ratón teñidas con violeta de cresilo después de 72 horas después de la reperfusión. Área de infarto (principalmente cuerpo estriado, la corteza y las áreas adyacentes del cerebro) aparece en blanco (sin manchas de violeta de cresilo). El volumen de la lesión (parte blanca, hemisferio derecho) se delimitó y se expresó como un porcentaje de la contralateral no lesionado área (hemisferio izquierdo).

Discusión

Diferentes modelos de accidente cerebrovascular se han desarrollado para imitar las consecuencias de accidente cerebrovascular en pacientes. La elección del modelo de accidente cerebrovascular depende de la cuestión biológica. El intraluminal modelo MCAO imita uno de los tipos más comunes de un accidente cerebrovascular isquémico en pacientes y es menos invasiva y más consistente que el modelo Tamura ^4,7. Es un modelo muy interesante para el análisis de la muerte neuroprotección, Neurorreparación y celular. El éxito del modelo intraluminal depende de muchos factores tales como el sexo del animal, edad y peso, la temperatura, la anestesia y el momento de la cirugía, que tienen que ser controlados. Las propiedades físicas del oclusor (diámetro de la punta, longitud, forma y fexibility) son críticos para la consistencia de la MCAO ^4. Aquí, se utiliza el 12 mm de largo 6-0 monofilamento recubierto con silicona en 9-10 mm de Corporación Doccol. La gran ventaja de este monofilamento es reducir las hemorragias subaracnoideas y porque su longitud cubierto toda la ICALa longitud, el flujo de sangre residual, que proviene de las arterias comunicantes anterior y posterior del Círculo de Willis y PPA, y se evita la variabilidad en ⁸ disminuye el volumen de infarto (15% de la variabilidad en las manos). La sutura de CCA también disminuye la variabilidad del volumen de infarto ^9.

La extensión de la lesión cerebral después de tMCAO puede evaluarse mediante diferentes maneras. Déficits neurológicos se puede medir como se ha mencionado anteriormente. Sin embargo, es difícil tener una medida eficiente de esta manera. La extensión del infarto se realiza comúnmente mediante tinción con TTC. Más recientemente, las técnicas de resonancia magnética se utilizan también, una tecnología particularmente interesante para los tratamientos neuroprotectores. Para comprender los mecanismos celulares implicados en el accidente cerebrovascular tal como muerte celular Neurorreparación, o la proliferación celular, el estudio de diferentes marcadores por inmunohistoquímica es crítico y muy informativo. Por lo tanto, nuestro protocol de preparaciones sección del cerebro tiene la gran ventaja de permitir que estos análisis, y minimiza el número de ratones utilizados. Además, Tureyen et al. ¹⁰ han informado de que hay una buena correlación entre la tinción con violeta de cresilo y TTC.

Materiales

Microscopio estéreo	Zeiss	Stemi 2000
Fibra-Light Iluminador de alta intensidad	Dolan-Jenner Industries Inc.
Sistema de Anestesia para isoflurano
Isoflurano	CDMV	108737
Calefacción manta	Gaymar Medsearch	TP22G
Lámpara de calefacción infrarroja
Ultra fino pinzas, estilo 5	Ciencias de Microscopía Electrónica	78320-5TI
Tijeras Vannas Cutting Edge 3 mm, Recto	Ciencias de Microscopía Electrónica	72932-01
Estilo de LA-1 y 1-MPF Todas las hojas lisas	Ciencias de Microscopía Electrónica	77926-5S
Pinzas acción negativa, estilo KOPINC 5	Ciencias de Microscopía Electrónica	72850-F
Tijeras de disección 5 1/2 "Straight	Cedarlane	72960
Autoclip starter set	Harvard aparato	34-0557
BD autoclip herida Syst Clausura., 9 mm de largo, 100 por paquete	Fisher	01-804-5
5-0 sutura	Harvard aparato	517763
Material de sutura monofilamento de PDS II violeta, 5-0, RB-1; Z303H	CDMV	6167
12 mm de longitud 6-0 de silicio recubierto de sutura monofilamento	Doccol Corporación	60SPRePK5
Seringes 1 ml	Fisher	14-823-2F
Agujas 26G1 / 2	Fisher	BD-305111
IRCM