腔内MCAOのマウスモデル：クレシルバイオレット染色による脳梗塞の評価

要約

マウスにおける腔内中大脳閉塞モデルは、本明細書に提示されます。脳梗塞の程度は、神経学的スコアとクレジルバイオレット染色は、TTCに代わる染色、並列多くの関心マーカーでテストする大きな利点を提供することによって評価されます。

要約

脳卒中は死亡率と世界の障害の主要な原因の3番目の原因である。すべてのストロークの約80％、虚血性脳卒中を占めています。しかし、血栓溶解組織プラスミノーゲンアクチベーター（tPA）が存在する急性虚血性脳卒中の唯一の治療法です。これは、研究者は、様々な種のいくつかの虚血性脳梗塞モデルを開発するために導いた。齧歯類モデルの2つの主要なタイプが開発されている：全脳虚血または限局性脳虚血のモデル。患者における虚血性脳卒中を模倣するために、誰に約80％の血栓または塞栓性脳卒中が中大脳動脈（MCA）の領土で発生し、管腔内中大脳動脈閉塞（MCAO）モデルでは、脳卒中の研究に大いに関係があります。このモデルは第一小泉らがラットで開発された、1986年^1インチそのため、マウスにおける遺伝子操作のしやすさのために、これらのモデルは、この種の^2-3に開発されてきた。 このような先端径、長さ、形状、柔軟性などオクルダーの物性は梗塞容積⁴の再現のために重要であることをコンテンツ">ここで、我々はC57/BL6マウスにおける過渡MCA閉塞手順を紹介します。これまでの研究で報告されています。ここで、商用シリコンコーティングされたモノフィラメント（Doccolコーポレーション）が使用されている。もう一つの大きな利点は、このモノフィラメントは、くも膜下出血を誘発する危険性を減少させるということです。ツァイスステレオ顕微鏡STEMI 2000を使用し、シリコンコーティングされたモノフィラメントは内頚動脈に導入されました（ICA）を外頸動脈（ECA）のカット経由モノフィラメントは、MCAのベースを閉塞するまで血流は血栓塞栓症における血栓の溶解後の血流の回復を模倣するためにモノフィラメントを除去して1時間後に復元されました人間。脳梗塞の範囲は、神経学的スコアにより、梗塞体積の測定によって最初に評価することができる。虚血マウスは、このように異なる後再灌流時々彼らの神経学的スコアを分析した。 2,3,5 - トリフェニルテトラゾリウムクロライド（TTC）で染色し、梗塞体積を評価するために通常行われた。それは免疫組織化学によって多くの重要なマーカーをテストする機会を提供していますのでここで、我々はクレシルバイオレット染色を使用していました。このビデオでは、MCAO手順を報告し、神経学的スコアとクレシルバイオレット染色による梗塞体積の評価。

プロトコル

一過性中大脳動脈閉塞（MCAO）

1。手術の手順（ 図1）

一過性中大脳動脈閉塞（tMCAO）が2日に行われる - 3ヶ月の雄のC57BL / 6マウス（22〜28グラム）まで。このプロトコルは、IRCM生命倫理委員会の動物のケアにより承認された。手術器具はオートクレーブ（60分、15 psiで121°C）で滅菌した。それぞれの動物の間に、彼らは熱いビーズ滅菌器（15秒）を使用して滅菌した。手術テーブルと他の機器を70％エタノールを用いて消毒されています。

手術2時間前に、マウスをブプレノルフィン（0.03 mg / kgでbwip）でanalgesizedた。

図1A。

1. 深くイソフルラン5％のマウスをanaesthetizeその後イソフルラン2.5％で麻酔を維持している。マウスの体温は、加熱パッドを備えた手術中に一定に保たれる。
2. 毛皮やSKを消毒70％エタノールまたはベタジンとインチシェービングは、脳卒中病態に影響を与える可能性があり毛髪断片リリース、microabrasionsや炎症を生成するので、我々は、マウスの毛皮を剃っていません。
3. 正中頸部切開を加え、穏やかに軟組織を引き離す。
4. ステレオ顕微鏡（STEMI 2000、ツァイス）の下では、鈍的切開、気管を露出し、頸動脈を見つけるために筋肉を撤回するために実行されます。
5. 左総頸動脈（CCA）を慎重に周囲の組織から解剖され、CCAは、一時的に20ミリメートルのセグメントに5から0絹縫合糸のカットを使用して、一時的な縫合（1）で閉塞されています。細心の注意が迷走神経を害しないよう注意が必要である。
6. 左内総頸動脈（ICA）と外部の総頸動脈（ECA）の分岐を分ける。永久的な縫合糸（2）のように遠位になるべく、ECAの周囲に配置されており、ややタイトな別の一時的な縫合（3）から遠位ECAの上に置かれる分岐。
7. 出血を避けるために逆作用ピンセットを使用して、左のICA（4）クリップ。細心の注意が迷走神経を害しないよう注意が必要である。
8. 永久的な（2）と一時的な（3）縫合糸の間にECA（5）に小さな穴を開けます。

図1B。

9. 、12ミリメートル、長さ6から0シリコン被覆（9-10mm程度被覆したシリコンです）ECA（6）にモノフィラメント縫合糸（Doccol株式会社）を導入し、完全に永久的な縫合糸の遠位にECAをカットし、ICAにオクルダーを反転。縫合糸は、しっかりと出血を防ぐためにモノフィラメントの周り縛られ、逆作用ピンセットは削除されます。
10. オクルダーはウィリス動脈輪におけるMCAの起点を閉塞するために導入される。 ECAとCCAの分岐を越えて9〜10ミリメートルの周りにその挿入を停止します。オクルーダは遮断され、もはや移動することはできません。ケアは、翼口蓋動脈を貫通していない注意しなければなりません。 ECAの縫合（3）TIGですhtly位置にモノフィラメントを修正するために接続されています。
11. autoclip創傷閉鎖システムで皮膚を閉じます。
12. 皮下に生理食塩水の1ミリリットルを注入し、すべての閉塞後期間（60分）の間、赤外線加熱ランプの下にマウスを置きます。

2。中大脳動脈の血流の回復

reanesthesia前に、neuroscoreは、手術の成功を評価するためにチェックすることができます。

1. 前述のようにマウスを麻酔し、オートクリップを取り外します。
2. 少しモノフィラメント撤退や血液灌流を可能にするためのECAに縫合（3）を開きます。
3. 永久に失血を防ぐために、ECAの一時的な縫合糸を結紮する。モノフィラメントは再使用のために保持されます。
4. 血液の循環を可能にするために、CCAへの一時的な縫合（1）を取り外します。
5. 傷口を閉じます。マウスは、皮下に別の1ミリリットル生理食塩水を受けるべきである。
6. 1時間赤外線加熱ランプ下でマウスを置きます。動物は移動性を取り戻していることを確認した後、マウスをそのケージに戻され、72時間加熱パッドとタオルの下に残しました。ケージの半分だけがマウスは自分の環境を選択できるように加熱パッド上に配置されることに注意してください。手術後の体重減少は、一般的に観察されているので、マッシュポテト食べ物は食べ奨励するペトリ皿に置かれます。
   十二時間後に手術、マウスは、ブプレノルフィン（0.03 mg / kgでbwip）の別の投与を受けた。

3。偽手術

偽の操作は、すべての手順がオクルーダーが挿入されていないことを除いて同一である。

4。 Neuroscore

神経障害は、単に再灌流後tMCAOの成功の評価を可能にし、後で傷害の重症度の推定。前述のように神経学的欠損は^{、5 <を}採点される/ sup>の、1、24、48および72時間後に再灌流に出演。拡張された6点スケールは使用されています：

• 0：正常。
• 1：軽度の尾が拾うとき、または矛盾した回転せずに動作を旋回、対側に回転させるための<50％の試み。
• 2：軽度の旋回、一貫性のある反対側に回転させるための> 50％の試み。
• 3：強力な一貫性と旋回即時、マウスはその鼻がほぼその尾に達して、以上の1〜2秒の回転位置を保持しています。
• 4：バレルに進んで深刻な回転、反射を歩いたり、立ち直りの損失。
• 5：昏睡状態または瀕死。

5。クレジルバイオレット染色（ 図2）

PBS溶液灌流後、脳を素早くイソペンタン中で凍結されており、-80℃で保存C.マウスの脳はまた、計画された免疫組織化学の研究に応じて4％パラホルムアルデヒド（PFA）で灌流することができる。冠状脳切片（17μm）のクライオスタット·カットが実行されます。すべての30の1つのセクションのうち、代表的な脳損傷を持っているために、同じスライド上で収集されます。ボリュームの定量のために、2スライドはクレシルバイオレット染色によって染色されており、画像解析システム（サイオン社、フレデリック、メリーランド州）は病変を評価するために使用されていました。傷害ボリュームは任意の単位（ピクセル）で計算され、各セクションの反対側の非病変領域の割合として表した。他のスライドは、免疫組織化学的研究のために-80℃に保たれている。あるいは、PFA固定脳はビブラトームととしてHan ら ^（2009）6が推奨する測定梗塞体積を用いて30から50μmでカットすることができます。

結果

neuroscore評価がtMCAO脳卒中後の成功を確認しtMCAO後再灌流の効率を決定する。我々の手では、すべてのマウスは、少なくとも軽度の一貫カーリング（neuroscore 2）、神経障害、最大72時間まで、一般的に安定している提示腔内手続きを行った。ほとんどのマウスは、軽度の一貫カーリング（neuroscore 2）を示す。カーリングの不在を示すマウスは研究から除外されます。しかし、neuroscoreの評価は、私たちは負傷した海馬とそのまま海馬とのそれらを持つマウスを区別することはできません。

死亡例は、くも膜下出血が発生しなかったことを示唆し、手術日の間に観察されなかった。くも膜下出血は、マウスで同定されている場合、このいずれかを系統的に分析から除外されます。自宅に準備モノフィラメントよりスムーズですDoccol株式会社からシリコンコーティングされたモノフィラメントの使用はの成功を増加させるtMCAOとくも膜下出血を減らすことができます。 24時間と72時間の間での死亡率は、一般的に咬合の60分間報告したように、このモデルでは14％です。観察された死亡率は、おそらくこのマウス系統の大梗塞体積が原因です。強い病変の再現性もその効果（s）は、モデルのばらつきによって隠される可能性が神経保護分子を勉強することは非常に興味深いものである（標準偏差が15％）が観察されている。

tMCAO後の脳損傷の程度を評価するために、我々は、関連するマーカー^6をテストするための材料の多くを持っているために、むしろTTCよりクレシルバイオレット染色（ 図2）を使用することにしました。病変の程度は比較的一貫している。しかし、我々はいくつかのマウスでは、海馬が（マウスの約30％）負傷したことに気づいた。これは、クレシルバイオレット染色は後1週間まで適用可能であることは興味深いことです。文献では、脳梗塞の割合が1から変化お互いに勉強しています。それは、マウス系統、麻酔、脳切片の厚さ、使用モノフィラメント、または^6、7を使用^し染色の選択に依存します。

図1。シリコン被覆管腔内モノフィラメントを用いて中大脳動脈の閉塞のスキーム。マウス脳とシリコンコーティングされたモノフィラメントの導入を準備するために連続した縫合糸およびクリップを示す脳動脈の簡略化した方式を採用しています。B.は、ウィリス動脈輪を介してモノフィラメントの位置が表されます。ますが、BA、脳底動脈、、CCA、総頸動脈、C.ウィリス、ウィリスのサークル、モノフィラメントは、MCA、ACA、前大脳動脈の根元を閉塞するECA を介してのICAに導入され、ECA、外頸動脈アルテRY、ICA、内頚動脈、MCA、中大脳動脈、PCAは、後交通動脈、PPAは、翼口蓋動脈。

図2。 72時間後の再灌流後クレシルバイオレットで染色したマウスの脳の代表的な冠状断面。梗塞領域（主に線条体、皮質と隣接する脳領域）（クレシルバイオレットで染色さ）白で表示されます。傷害ボリューム（白い部分、右半球）が区切りだったと反対側の非病変領域（左半球）の割合として表される。

ディスカッション

異なるストロークモデルは患者の脳卒中の影響を模倣するために開発されてきた。ストロークモデルの選択は、生物学的な問題に応じて異なります。腔内MCAOモデルは、患者における虚血性脳卒中の最も一般的なタイプのいずれかを模倣し、田村モデル^4,7と比較して低侵襲、より一貫性があります。それは、神経保護、neurorepairと細胞死の解析のための本当に興味深いモデルです。腔内モデルの成功は、制御されなければならないような動物の性別、年齢、体重、体温、麻酔や手術の時のような多くの要因に依存します。オクルーダ（先端径、長さ、形状及びfexibility）の物理的な礼儀はMCAO ⁴の整合性を保つために重要です。ここで、我々はDoccolコーポレーション9〜10ミリメートル上にシリコンでコーティングされた12ミリメートル、長さ6から0モノフィラメントを使用しています。その長さはすべてのICAを覆ったので、このモノフィラメントの大きな利点は、くも膜下出血を減少させることであると長さは、ウィリスとPPAのサークルの前部と後部の通信動脈から来る残留血流が防止及び梗塞体積が減少する（我々の手の変動の^15％）8の変動しています。 CCAの縫合も梗塞容積⁹の変動を減少させます。

tMCAO後の脳損傷の程度は様々な方法によって評価することができる。前述したように神経学的欠損を測定することができます。しかし、それはこのようにすることで、効率的な対策を持っていることは困難である。梗塞の範囲は、一般的にTTC染色によって実行されます。さらに最近では、磁気共鳴技術はまた、神経保護治療のために特に興味深い技術を使用しています。そのようなneurorepair、細胞死や細胞増殖、脳卒中に関与基礎細胞のメカニズムを理解するために、免疫組織化学によって異なるマーカーの研究は重要で非常に有益です。したがって、我々のprotoc脳切片標本のOLは、これらの分析を可能にするという大きな利点を持っており、使用したマウスの数を最小限に抑えます。また、Tureyen ら ¹⁰クレシルバイオレット染色とTTCとの間に良好な相関関係があることが報告されています。

資料

ステレオ顕微鏡	ツァイス	STEMI 2000
ファイバーライト高輝度イルミ	ドーラン - ジェナー工業株式会社
イソフルラン	CDMV	108737
暖房ブランケット	Gaymar Medsearch	TP22G
赤外線加熱ランプ
超微細なピンセット、スタイル5	電子顕微鏡学	78320-5TI
Vannasはさみ3ミリメートルのCutting Edge、ストレート	電子顕微鏡学	72932から01
スタイルLA-1およびMPF-1すべての滑らかなブレード	電子顕微鏡学	77926-5S
ネガティブな作用ピンセット、スタイルKOPINC 5	電子顕微鏡学	72850-F
Cedarlane	72960
Autoclipスターターセット	ハーバード装置	34から0557
BD Autoclipは閉会ブローネを巻いた。、9mmの長い、100個	フィッシャー	01-804-5
5から0縫合	ハーバード装置	517763
縫合材料のPDS IIのモノフィラメントバイオレット、5-0、RB-1; Z303H	CDMV	6167
12ミリメートル、長さ6から0、シリコンコーティングされたモノフィラメント縫合糸	Doccol株式会社	60SPRePK5
Seringes 1ミリリットル	フィッシャー	14-823-2F
針26G1 / 2	フィッシャー	BD-305111
IRCM