JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

العظة حاسة الشم التوسط السلوكيات المختلفة في الحشرات، وغالبا ما تكون معقدة هي مزيج يتألف من عشرات إلى مئات من مركبات طيارة. باستخدام كروماتوغرافيا الغاز مع تسجيل متعدد القنوات في الفص antennal الحشرات، ونحن تصف طريقة لتحديد المركبات النشطة بيولوجيا.

Abstract

جميع الكائنات الحية تعيش في عالم مليء من المحفزات الحسية التي تحدد استجابتها السلوكية والفسيولوجية لبيئتهم. الشم أهمية خاصة في الحشرات، والتي تستخدم نظمها حاسة الشم للرد على، وتميز بين، المحفزات الرائحة المعقدة. هذه الروائح تثير السلوكيات التي تتوسط عمليات مثل الاستنساخ واختيار السكن 1-3. بالإضافة إلى ذلك، والاستشعار الكيميائية السلوكيات يتوسط الحشرات التي تكون مهمة للغاية من أجل الزراعة وصحة الإنسان، بما في ذلك التلقيح 4-6 و الحيوانات العاشبة من المحاصيل الغذائية 7، وانتقال الأمراض 8،9. تحديد إشارات حاسة الشم ودورها في سلوك الحشرات وبالتالي من المهم لفهم كل العمليات الإيكولوجية والموارد الغذائية البشرية ورفاهها.

حتى الآن، وقد تم تحديد المواد المتطايرة التي تدفع سلوك الحشرات صعبة وشاقة في كثير من الأحيان. وتشمل التقنيات الحاليةتسجيل electroantennogram الغاز اللوني يقترن (GC-EAG)، والغاز اللوني جانب واحد التسجيلات sensillum (GC-SSR) 10-12. أثبتت هذه التقنيات لتكون حيوية في تحديد المركبات النشطة بيولوجيا. قمنا بتطوير الطريقة التي يستخدم الغاز اللوني بالإضافة إلى متعدد القنوات التسجيلات الكهربية (وهو ما يسمى 'GCMR') من الخلايا العصبية في الفص antennal (AL؛ مركز الحشرة حاسة الشم الأولية) 13،14. هذه التقنية للدولة من بين الفن يسمح لنا لبحث كيفية تمثيل المعلومات في الدماغ رائحة الحشرات. وعلاوة على ذلك، وذلك لأن الاستجابات العصبية للروائح على هذا المستوى من التجهيز حاسة الشم هي حساسة للغاية نظرا لدرجة التقارب بين الخلايا العصبية مستقبلات الهوائي في الخلايا العصبية AL، سوف تسمح التسجيلات AL الكشف عن المكونات النشطة من الروائح الطبيعية بكفاءة ومع حساسية عالية. نحن هنا وصف GCMR وتعطي مثالا على استخدامها.

العديد من الخطوات العامة هي involفيد في الكشف عن المواد المتطايرة والاستجابة النشطة بيولوجيا الحشرات. المتطايرة تحتاج أولا إلى أن تم جمعها من مصادر ذات الاهتمام (في هذا المثال نستخدم الزهور من جنس Mimulus (Phyrmaceae)) وتتميز حسب الحاجة باستخدام معيار GC-MS تقنيات 14-16. وتعد الحشرات لدراسة باستخدام الحد الأدنى من تشريح، وبعد ذلك يتم إدخال إلكترود تسجيل في الفص antennal وتسجيل متعدد القنوات العصبية تبدأ. بعد معالجة البيانات العصبية التي تكشف ثم odorants خاصة تسبب ردود العصبية كبيرة من الجهاز العصبي للحشرات.

على الرغم من أن المثال هنا هو نقدم محددة لدراسات التلقيح، يمكن توسيع GCMR لطائفة واسعة من الكائنات الحية ومصادر الدراسة المتقلبة. على سبيل المثال، يمكن استخدام هذه الطريقة في تحديد odorants جذب الحشرات أو صد النواقل وآفات المحاصيل. وعلاوة على ذلك، يمكن أيضا أن تستخدم لGCMR تحديد جاذبة للحشرات النافعة، مثل بوllinators. ويمكن توسيع هذه التقنية في مواضيع غير الحشرات أيضا.

Protocol

1. متقلبة Follection

  1. في هذا المثال، فإننا نستخدم عينات المتطايرة من M. lewisii الزهور - زهرة برية في جبال الألب الأم إلى ولاية كاليفورنيا. يتم جمع المواد المتطايرة باستخدام أساليب الامتصاص الحيوي وفقا لوآخرون Riffell 14. لفترة وجيزة، وهذه الطريقة تستخدم لمحاصرة نظام حلقة مغلقة حيث يتم تضمين الزهور في كيس تفلون. باستخدام مضخة فراغ خاملة، وامتص الهواء حول الزهور من خلال "فخ" تتألف من ماصة باستور مليئة Porapak Q المصفوفة. يتم تصفية الهواء من مضخة العودة من الفحم المنشط. بعد فترة زمنية محددة، في ح لدينا 24 حالة، ومزال سؤال Porapak مصفوفة مع المذيبات غير القطبية الهكسين عادة، لجمع استخراج المركزة. ثم يتم تخزين واستخراج في -80 درجة مئوية حتى التحليل. إذا لزم الأمر، يمكن أن تتركز عينات قبل التحليل في إطار تيار من غاز النيتروجين. ما لم يتم بالفعل العينة جيدا من تميز، تشغيل قسامة من ذلك من خلالالغاز اللوني مطياف الكتلة (GC-MS) لتحديد المكونات المتطايرة قبل استخدام العينة.

2. إعداد الكهربية

  1. قطع ما يقرب من 1 سم من نهاية تلميح ماصة ميكرولتر 1000. وضع النحل تلعثم (impatiens Bombus) في قاعدة غيض ماصة، ودفع برفق نحو الطرف الآخر من طرف حتى يتعرض فقط الرأس.
  2. تذوب الشمع الأسنان وقولبته حول الرأس المكشوفة، والتأكد من أن تلتزم الشمع على أعين الأمن ومجمع لجعل رأس النحلة قادرة على الحركة تماما. تأكد من عدم حصول أي الشمع على الهوائي للنحل.
  3. مرة واحدة في الرأس آمنة، وجعل مربع، نافذة مثل شق في كبسولة الرأس باستخدام شفرة الحلاقة أو ثقيل الحجم المناسب مشرط لقطع بشرة. باستخدام شفرة الكسارة، بدء من الجانب الظهري من الكبسولة الرأس، على الفور وراء هوائي واحد وبالقرب من مجمع للعيون. قطعخط مستقيم، من واحد إلى مجمع العين بالعين مجمع المقابل. بعد قطع خط مستقيم إلى مجمع العين المعاكس، البدء بتقديم شق ظهريا حتى منحنيات كبسولة الرأس وينتهي بالقرب من الصدر. في هذه المرحلة، تبدأ في خفض نحو الطرف الآخر من الكبسولة الرأس. وأخيرا، مرة واحدة وقد تم قطع خط إلى الطرف الآخر، وقطع خط العودة إلى نقطة الانطلاق للشق الأول. من المهم إزالة إهاب هذا هو المتاخمة للهوائي، حيث سيؤدي ذلك إلى إعاقة إدخال القطب.
  4. مرة واحدة يتم قطع بشرة، استخدام زوج من ملقط لإزالة إهاب النحل، التي ينبغي أن تعرض الدماغ ثم النحل والأهم من ذلك الفص antennal. تبدأ على الفور مع superfusing الدماغ المالحة الحشرات، بحيث لا يصبح الدماغ المجفف. بعد تعرض الدماغ، استخدم بعناية زوج من ملقط دقيق جدا لإزالة غمد حول العصب مباشرة فوق فصوص antennal. يكون حريصا جدا على ألاثقب الدماغ النحل مع ملقط.

3. اللوني للغاز مع تسجيل متعدد القنوات

  1. النحلة "إعداد" - ثابتة في أنبوب مع دماغها يتعرض - على استعداد الآن لتسجيل الكهربية. وضع النحل في المشبك، مثبتة في قاعدة المغناطيسي الموجود على جدول الهواء.
  2. ترتيب حقيبة IV، تحكم في التدفق، وأنابيب (مليئة المالحة الحشرات) بحيث المالحة superfuses باستمرار الدماغ.
  3. باستخدام مياداة مجهرية، القطب insertareference، مصنوعة من الأسلاك التنغستن، في عين النحلة.
  4. باستخدام مياداة مجهرية منفصلة، ​​تضاف القناة متعدد القطب، مثل سلك ملفوف tetrode، أو السيليكون متعدد القنوات الكهربائي (Neuronexus تكنولوجيز)، في فصوص antennal للنحل. ويرتبط هذا القطب إلى مكبر للصوت قبل مثل نظام TDT في سلسلة S-3 Z إلى المعالج Z-bioamp حافلة من نظام TDT. الإخراج من الغاز CHROيمكن كشف matogram، عبر الكابل BNC محمية يكون ربطه مع نظام مكبر للصوت واقتناء مثل هذه البيانات التي يتم مزامنتها كل من إشارة العصبية وGC.
  5. الانتظار حوالي 30-60 دقيقة للتسجيلات العصبية لتحقيق الاستقرار. وبمجرد أن النشاط العفوي وشكل الموجي وحدات تسجيل في القنوات أصبحت متسقة، استخدم حقنة لتحفيز رائحة النحل ومراقبة الاستجابة للقنوات التسجيل للرائحة.
  6. تسجيل المسامير خارج الخلية من الخلايا العصبية التي كتبها لصناعة السيارات في العتبة القنوات التسجيل عن طريق 3،5 حتي 5 سيجما للإشارة على القنوات الفردية تسجيل. قد تكون هناك حاجة لدليل العتبة بعض القنوات لتجنب التلوث من الضوضاء الكهربائية. فإن إمكانات العمل من الخلايا العصبية تظهر ارتفاع الجهد في القناة التسجيل. عندما الجهد القناة يتجاوز عتبة، ونظام المخازن المؤقتة، وتقي جزء من الثانية قبل وبعد عبور العتبة، تاكين بذلكGA المفاجئة شوت للالموجي، أو ارتفاع.
  7. على الفور بجانب الجدول الهواء هو GC. قبل حقن خلاصة الزهور في GC، تأكد من أن طريقة لتعلية درجة حرارة التشغيل GC هو الصحيح. في مثالنا، ونحن نستخدم طريقة درجة الحرارة ابتداء من الساعة 50 درجة مئوية لمدة 4 دقائق تليها زيادة في درجة الحرارة بمعدل 10 درجة مئوية / دقيقة. إلى 220 ° C، في الوقت الذي نحن نحمل GC لحد أدنى 6 إضافية. نستخدم DB-5 العمود GC (J & W العلمية، فولسوم، CA، الولايات المتحدة الأمريكية)، مع الهليوم والغاز الناقل. مدخل هو إنعدام التقسيم، مع درجة حرارة 200 درجة لتعيين C. تم تعيين كاشف التأين درجة حرارة اللهب إلى 230 ° C.
  8. حقن العينة مستخرج من فراغ الرأس الموجود الأزهار في منفذ الحقن الساخنة في GC للافراج عن المواد المتطايرة كثف في العمود GC. يتم تقسيم النفايات السائلة من العمود 1:1 بين الشعلة كاشف التأين (FID) والهوائي النحل باستخدام الزجاج "Y" موصل (J & W العلمية). تبدأ تفصيلأوردينج من القطب كما كنت حقن عينة في GC.
  9. بعد انتهاء المدى GC، والسماح للبقية إعداد لمدة 5 إلى 15 دقيقة. ثم حقن عينة أخرى إما في GC أو تحفيز إعداد باستخدام مركبات طيارة واحد أو خليط من المركبات. في هذا الأسلوب الأخير لتحفيز إعداد، يتم تحويل البقول من الهواء من تيار الهواء المستمر من خلال حقنة زجاجية تحتوي على قطعة من ورق الترشيح الذي يكون قد تم فيه إيداع المركبات. كان الحافز رائحة نابض عن طريق صمام الملف اللولبي تنشيط تسيطر عليها البرنامج.
  10. إذا توقف فجأة وحدة النشاط أو التغييرات، والتحقق من بالتنقيط المالحة، والسماح للبقية إعداد لمدة 15 دقيقة. إذا كان النشاط العفوي لا يستعيد مستواه السابق وينبغي بعد ذلك يتم تجاهل إعداد واستخدام النحل أخرى إذا كانت متوفرة.
  11. بعد التجربة، إصلاح الدماغ مع الفورمالين 5٪ لمدة 20 دقيقة مع التحقيق لا يزال في الأنسجة. المقبل، استئصال الدماغووضعه في غلوتارالدهيد 2٪ لمدة 4 ساعة، والقيام بعد ذلك الجفاف الإيثانول متدرج سلسلة ومسح الدماغ مع ساليسيلات الميثيل. بناء على نتائج المباريات والمقاصة من الأنسجة، والمواقع في AL حيث الأقطاب ثقب الأنسجة يجب أن يكون مميزا بوضوح من خلال الفحص المجهري متحد البؤر.

4. تحليل البيانات

  1. تحليل البيانات التي تم جمعها بعد التجربة لفصل وتحديد وحدات مسجل العصبية. استخدام برامج الحاسب الآلي نموذجي (فارز متصل، MClust، وSClust) إلى الطول الموجي منفصلة، ​​أو "مسامير"، استنادا إلى ارتفاع الأشكال، مثل وادي الذروة أو السعة، ذروة نصف العرض، وما إلى ذلك، أو تدابير خفض (المكونات الرئيسية) 17 ، 18 (الشكل 2). فقط استخدام تلك مجموعات من المسامير التي تفصل في حيز ثلاثي الأبعاد (PC1 PC3-) وتختلف إحصائيا عن بعضها البعض (ANOVA متعدد المتغيرات، P <0.05) (الشكل 2) لمزيد من التحليل. يرجى الرجوع إلىالاقتباس # S 17-19 لوصف كامل للتسجيل ومنهجيات ارتفاع tetrode-الفرز.
  2. الوقت الطوابع المسامير في كل مجموعة، وتصدير هذه البيانات للتحليل باستخدام MATLAB أو Neuroexplorer (NEX تكنولوجيز، وينستون سالم، NC) لإنشاء المخططات النقطية والردود معدل اطلاق النار (أرقام 2، 3A).
  3. تحديد أوقات الاحتفاظ المتطايرة باستخدام البيانات المسجلة في وقت واحد GC. استغلال الأوقات الإبقاء على المواد المتطايرة، والتي تحددها ذروة الذروة من كروماتوغرام، لدراسة ردود تلك النقاط في وحدة الزمن.
  4. لدراسة ردود الفردية من خلال وحدة على المدى GC بن عدد المسامير في فترات ميللي ثانية 100 و دراسة الوقت أثناء إطلاق استجابات معدل بالإشارة إلى الوقت الاحتفاظ يبلغ حجمه المتطايرة. وbinning من المسامير في فترات ميللي ثانية 100 يوفر ما يكفي من التفاصيل، أو إشارة، حول المسار الزمني للاستجابة الخلايا العصبية ليبلغ حجمه الرائحة من GC.
  5. لإكساءالألغام الردود عدد السكان يبلغ حجمه إلى المتطايرة المختلفة، ودمج الردود معدل إطلاق الوحدات الفردية أكثر من النافذة 3 ثوانى أخذ العينات، 1.5 ثانية من قبل، و 1.5 ثوان بعد، في الوقت الإبقاء على المتطايرة (الشكل 3). هذه الفترة الزمنية هي الحال في مدة ليبلغ حجمه المضطربة من GC. نعرض اطلاق ردود معدل وحدات من الترميز اللوني، منها (الأحمر هو معدل اطلاق النار عالية الاستجابة؛ الأزرق هو استجابة منخفضة) (وترتيبها ومصفوفة النشاط مع كل صف يمثل استجابة لفرقة النفايات السائلة GC (أعمدة) الشكل 3).

النتائج

في مقايسة GCMR باستخدام M. lewisii رائحة الأزهار، ونحن حقن 3 ميكرولتر من استخراج في GC. العدد الإجمالي للالمتطايرة يبلغ حجمه من خلال GC هو عادة 60-70 المتطايرة. رائحة M. وتتكون في الغالب من lewisii monoterpenoids، بما في ذلك ميرسين-β (لا حلقية) وبينين α-، مع ما تبقى من ...

Discussion

الحشرات حاسة الشم بوساطة السلوكيات دفع العديد من الإجراءات المختلفة، بما في ذلك الاستنساخ، واختيار المضيف في الموقع، وتحديد الموارد الغذائية المناسبة. دراسة هذه العمليات يحتاج الى القدرة على تحديد المواد المتطايرة المنبعثة من المصدر، وكذلك القدرة على تحديد تلك ال...

Disclosures

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgements

وأيد هذا العمل من قبل NSF منحة IOS 1121692، وجامعة مؤسسة البحوث واشنطن.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
اسم البند شركة كتالوج رقم تعليقات
Porapak نوع س 80-100 شبكة مياه WAT027060
حقائب رينولدز فرن رينولدز
GC اجيلنت 7820A
GC العمود J & W العلمية، فولسوم، CA، الولايات المتحدة الأمريكية DB-5 (30 م، 0.25 ملم، 0.25 ميكرون)
التحليلية غاز الهيليوم الناقل PRAXAIR سعادة K 1 سم مكعب / دقيقة
16-قناة السيليكون الكهربائي Neuronexus ميتاليكاذكر a4x4-3mm50-177
غرامة NiCr الأسلاك، 0،012 مم) SANDVIK Kanthal HP ريد PX000004 لجعل العرف وtetrodes stereotrodes
قبل مكبر للصوت تاكر-ديفيس النظام PZ-2
مكبر الصوت تاكر-ديفيس النظام RZ-2
نظام الحصول على البيانات - جناح OpenEx تاكر-ديفيس النظام
ارتفاع الانترنت، برامج الفرز - SpikePac تاكر-ديفيس النظام
حاليا، ارتفاع الفرز البرمجيات - Mclust سبايك-الفرز الأدوات ديفيد Redish، قسم العلوم العصبية في جامعةمينيسوتا تحميل مجاني في http://redishlab.neuroscience.umn.edu/MClust/MClust.html MATLAB الأدوات

References

  1. Hildebrand, J. G., Shepherd, G. M. Mechanisms of olfactory: converging evidence for common principles across phyla. Annual Review of Neuroscience. 20, 595-631 (1997).
  2. Reisenman, C. E., Riffell, J. A., Bernays, E. A., Hildebrand, J. G. Antagonistic effects of floral scent in an insect-plant interaction. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 277, 2371-2379 (2010).
  3. Reisenman, C. E., Riffell, J. A., Hildebrand, J. G. . International Symposium on Olfaction and Taste. 1170, 462-467 (2009).
  4. Alarcón, R. Congruence between visitation and pollen-transport networks in a California plant-pollinator community. Oikos. 119, 35-44 (2010).
  5. Alarcón, R., Waser, N. M., Ollerton, J. Year-to-year variation in the topology of a plant-pollinator interaction network. Oikos. 117, 1796-1807 (2008).
  6. Riffell, J., et al. Behavioral consequences of innate preferences and olfactory learning in hawkmoth-flower interactions. P. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 3404-3409 (2008).
  7. De Moraes, C. M., Lewis, W. J., Pare, P. W., Alborn, H. T., Tumlinson, J. H. Herbivore-infested plants selectively attract parasitoids. Nature. 393, 570 (1998).
  8. Carey, A. F., Wang, G., Su, C. -. Y., Zwiebel, L. J., Carlson, J. R. Odorant reception in the malaria mosquito Anopheles gambiae. Nature. 464, 66-71 (2010).
  9. Turner, S. L., et al. Ultra-prolonged activation of CO2-sensing neurons disorients mosquitoes. Nature. 474, 87-91 (2011).
  10. Pellegrino, M., Nakagawa, T., Vosshall, L. B. Single sensillum recordings in the insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae. J Vis Exp. (36), e1725 (2010).
  11. Syed, Z., Leal, W. S. Electrophysiological measurements from a moth olfactory system. J. Vis. Exp. (49), e2489 (2011).
  12. Roelofs, W. L., Comeau, A., Hill, A., Milicevic, G. Sex attractant of the codling moth: characterization with electroantennogram technique. Science. 174, 297-299 (1971).
  13. Riffell, J. A., Lei, H., Christensen, T. A., Hildebrand, J. G. Characterization and coding of behaviorally significant odor mixtures. Current Biology. 19, 335-340 .
  14. Riffell, J. A., Lei, H., Hildebrand, J. G. Neural correlates of behavior in the moth Manduca sexta in response to complex odors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the U.S.A. 106, 19219-19226 (2009).
  15. Raguso, R. A., Pellmyr, O. Dynamic headspace analysis of floral volatiles: a comparison of methods. Oikos. 81, 238-254 (1998).
  16. Rodriguez-Saona, C. R. Herbivore-induced blueberry volatiles and intra-plant signaling. J Vis Exp. , e3440 (2011).
  17. Nguyen, D. P., et al. Micro-drive array for chronic in vivo recording: tetrode assembly. J Vis Exp. , e1098 (2009).
  18. Schjetnan, A. G. P., Luczak, A. Recording large-scale neuronal ensembles with silicon probes in the anesthetized rat. J Vis Exp. , e3282 (2011).
  19. Deisig, N., Giurfa, M., Lachnit, H., Sandoz, J. -. C. Neural representation of olfactory mixtures in the honeybee antennal lobe. European Journal of Neuroscience. 24, 1161-1174 (2006).
  20. Stökl, J., et al. A deceptive pollination system targeting drosophilids through olfactory mimicry of yeast. Current Biology. 20, 1846-1852 (2010).
  21. Schneider, D. Elektrophysiologische untersuchungen von chemo- und mechanorezeptoren der antenne des seidenspinners Bombyx mori L. Journal of Comparative Physiology A: Neuroethology, Sensory, Neural, and Behavioral Physiology. 40, 8-41 (1957).
  22. Arn, H., Städler, E., Rauscher, S. The electroantennographic detector: a selective and senstitive tool in the gas chromatographic analysis of insect pheromones. Zeitschrift für Naturforschung. 30c, 722-725 (1975).
  23. Schneider, D., Boeckh, J. Rezeptorpotential und nervenimpulse einzelner olfaktorischer sensillen der insektenantenne. Journal of Comparative Physiology A: Neuroethology, Sensory, Neural, and Behavioral Physiology. 45, 405-412 (1962).
  24. Blight, M. M., Pickett, J. A., Wadhams, L. J., Woodcock, C. M. Antennal perception of oilseed rape Brassica napus (Brassicaceae) volatiles by the cabbage seed weevil Ceutorhynchus assimilis (Coleoptera, Curculionidae). Journal of Chemical Ecology. 21, 1649-1664 (1995).
  25. Lin, D. Y., Shea, S. D., Katz, L. C. Representation of natural stimuli in the rodent main olfactory bulb. Neuron. 50, 937-949 (2006).
  26. Lei, H., Reisenman, C. E., Wilson, C. H., Gabbur, P., Hildebrand, J. G. Spiking patterns and their functional implications in the antennal lobe of the tobacco hornworm Manduca sexta. PLoS ONE. 6, e23382 (2011).
  27. Syed, Z., Leal, W. S. Acute olfactory response of Culex mosquitoes to a human- and bird-derived attractant. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106, 18803-18808 (2009).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

72 Entomlogy impatiens Bombus

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved