昆虫の触角葉でガスクロマトグラフィー - マルチユニットレコーディング（GCMR）を使用して、嗅覚揮発性物質の同定

要約

嗅覚は、昆虫の多くの異なった行動を媒介し、よく揮発性化合物の数十〜数百から構成される複雑な混合物である。昆虫の触角葉でマルチチャンネル録音でガスクロマトグラフィーを用いて、我々は、生物活性化合物の同定のための方法を説明します。

要約

すべての生物は、その環境への彼らの行動や生理的な応答を決定する感覚刺激に満ちた世界に生息しています。嗅覚はに反応し、間で、複雑な香りの刺激を区別するために彼らの嗅覚システムを使用して昆虫、特に重要である。これらの臭気はこのような再生や生息地の選択^1月3日のようなプロセスを仲介する行動を誘発する。食用作物の受粉^4-6、草食^7、病気^8,9の伝送を含む、農業と人間の健康のために非常に重要である昆虫を媒介行動によってさらに、化学センシング。嗅覚信号と昆虫行動における役割の同定は、生態学的なプロセスおよびヒューマン·食糧資源と幸福の両方を理解するためにこのように重要です。

現在までに、昆虫行動を駆動揮発性物質の同定は困難で、しばしば退屈であった。現在の技術には、ガスクロマトグラフィー結合electroantennogram記録（GC-EAG）、およびガスクロマトグラフィー-結合されたシングル感覚子の録音^{（GC-SSR）10-12。}これらの技術は、生物活性化合物の同定に不可欠であることが判明した。 ^13,14、我々は、触角葉のニューロン（昆虫の主嗅覚中枢AL）からマルチチャンネルの電気生理学的記録（ 'GCMR "と呼ばれる）に結合し、ガスクロマトグラフィーを用いた方法を開発しました。この最先端の技術は、私たちは匂いの情報は昆虫脳の中でどのように表現されるかを調べることが可能になります。嗅覚処理のこのレベルの匂いに対する神経反応がALニューロンへのアンテナの受容ニューロンの収束の度合いに非常に敏感なせいであるので、さらに、ALの録音は自然な臭気の活性成分の検出を効率的かつ高感度にできるようになります。ここでは、GCMRを説明し、その使用例を与える。

いくつかの一般的な手順はinvolアール生理揮発性物質と昆虫応答の検出にVED。揮発性物質は、最初に興味のある情報源から収集します（この例では、我々は属Mimulus（Phyrmaceae）から花を使用）および標準のGC-MS技術を^14-16を使用して、必要に応じて特徴づけする必要があります。昆虫は記録電極が神経録音が始まる触角葉およびマルチチャネルに挿入された後、最小限の切開を用いた研究のために準備されます。神経データの後処理はその後、特定の匂い物質は、昆虫の神経系で重要な神経反応を起こしているか明らかにする。

ここでお見せする例では、受粉の研究に固有のものですが、GCMRは試験生物と揮発性ソースの広い範囲に拡大することができます。たとえば、このメソッドは媒介昆虫と作物の害虫を集めたり反発臭気物質の識別に使用することができます。また、GCMRはまた、POと益虫に対して誘引を識別するために使用することができますllinators。技術は同様に非昆虫被験者に拡張される可能性があります。

プロトコル

1。揮発性Follection

1. この例では、Mから揮発性のサンプルを使用するlewisii花-カリフォルニア州に高山野草ネイティブ。揮発性物質をRiffell らに従って動的吸着法を用いて収集されます^14。簡単に説明すると、このメソッドは花がテフロン袋に囲まれている閉ループ捕捉システムを採用しています。不活性の真空ポンプを使用して、花の周りの空気がPorapak Q行列でいっぱいパスツールピペットからなる "トラップ"を介して吸引される。ポンプからの戻り空気は活性炭によってフィルタリングされます。所定時間後、私たちの場合24時間で、Porapak Q行列は、濃縮された抽出物を収集するために、非極性溶媒、典型的にはヘキサンで溶出させる。抽出液を-80℃·分析まで保存されます。必要であれば、サンプルが窒素ガス気流下で、分析の前に濃縮することができる。サンプルは、既に十分に特徴付けられていない限り、それを介してのアリコートを実行サンプルを使用する前に、揮発性成分を識別するために、ガスクロマトグラフ質量分析計（GC-MS）。

2。電気生理学的準備

1. 千μlのピペットチップの先端から約1cmを切った。ピペットチップのベースにマルハナバチ（ マルハナバチインパチェンス ） を配置し、頭だけが露出するまでそっと先端の反対側の端に向かって押します。
2. 歯科用ワックスを溶かすとセキュリティのための複眼の上にワックスが付着していることを確認して、露出した頭部のまわりでそれを成形し、完全に不動ハチの頭を作るために。ハチのアンテナの上に任意のワックスを取得しないようにしてください。
3. ヘッドが固定されたら、カミソリの刃ブレーカまたはキューティクルをカットするメス適切なサイズを使用し、頭部カプセルに角、窓状、切り込みを入れる。ブレードブレーカを使用して、直ちにアンテナと複眼の1つに隣接後ろ、頭部カプセルの背側から開始します。カット1複眼から反対側の複眼に直線。反対複眼に直線をカットした後、その胸部に近い頭部カプセルカーブと終了するまで背側切開を作り始める。この時点で、頭部カプセルの反対側の端に向かってカットし始める。最後に、一度ラインが反対側の端にカットされており、初期の切開の開始位置に戻ってラインをカット。これは電極の挿入が妨げになるとして、それは、アンテナに隣接しているキューティクルを除去することが重要である。
4. キューティクルがカットされたら、その後蜂の脳と、もっと重要なのは、触角葉を公開する必要があります蜂のキューティクルを除去するためにピンセットを使用しています。直ちに脳がdessicatedにならないように、昆虫生理食塩水で脳をsuperfusing始める。脳が露出した後、慎重に直ちに触角ローブの上に神経周囲シースを除去するために、非常に微細なピンセットを使用しています。非常に慎重にされないように鉗子で穿刺蜂の脳を。

3。マルチチャンネル録音付きガスクロマトグラフィ

1. 蜂 "準備" - その脳が露出してチューブ内に固定 - 今電気生理学的記録の準備ができています。エアテーブル上に配置された磁気ベースに固定し、クランプで蜂を置きます。
2. 生理食塩水が継続的に脳をsuperfusesように、IVバッグ、フローコントローラ、チューブ（昆虫生理食塩水で満たされた）に配置します。
3. 蜂の目に、タングステン線で作られたマイクロマニピュレータ、insertareference電極を使用。
4. 独立したマイクロマニピュレータを使用して、このようなコイル状のワイヤーテトロード、またはシリコンマルチチャネル電極（Neuronexusテクノロジーズ）として、多チャンネル電極を挿入 ハチの触角葉に。この電極は、TDT系のZバスbioampプロセッサへのTDTのシステムのS-3のZシリーズのように、前置増幅器に接続されています。ガスクロマトからの出力シールドBNCケーブルを経由してクロマトグラムの検出器は、神経とGC信号の両方が同期されているアンプやデータ·アクイジション·システムと接続することができます。
5. 安定させるための神経録音の約30〜60分待ちます。自発的な活動と記録チャネルの単位の波形の形状が一貫になったら、蜂を刺激し、臭気に録音チャンネルの応答を観察するために臭気のシリンジを使用しています。
6. 個々の記録チャンネル上の信号の3.5から5シグマによる自動しきい値記録チャネルによってニューロンから細胞外スパイクを記録します。マニュアルしきい値処理は、電気的ノイズからの汚染を避けるために、いくつかのチャネルが必要な場合があります。ニューロンからの活動電位は記録チャネルの電圧スパイクとして表示されます。チャネルの電圧がしきい値を超えると、システムはそれによってターキン、しきい値への到達前と後数ミリ秒をバッファし、保存しますgaは波形のスナップショット、またはスパイク。
7. 直ちに空気テーブルの隣には、GCです。 GCに花のエキスを注入する前に、GC分析の温度上昇のための方法が正しいことを確認します。私たちの例では、10℃/分の速度で温度上昇が続く4分間50から始まる温度法°Cを使用します。 220℃我々は追加の6分のGCを保持し、その時点で、C。我々は、キャリアガスとしてヘリウムを、DB-5のGCカラム（J＆Wサイエンティフィック、フォルサム、カリフォルニア州、米国）を使用します。入口は、200℃に設定した温度と、スプリットレスです水素炎イオン化検出器の温度を230℃に設定されている
8. GCカラムに吸着した揮発性物質を解放するために、GCの加熱された注入口に花のヘッドスペースの抽出サンプルを注入します。カラムからの流出液は水素炎イオン化検出器（FID）とガラスの "Y"コネクター（J＆W Scientific）を用いたミツバチアンテナとの間に1:1に分割されます。 RECを開始は、GCにサンプルを注入するように電極からディング。
9. GCの実行が終了した後、5〜15分間準備休止してください。次に、いずれかGCに別のサンプルを注入したり、単一の揮発性化合物又は化合物の混合物を使用して準備を刺激する。準備を刺激するこの後者の方法では、一定の空気の流れから空気のパルスは、化合物が堆積されている上に濾紙を入れたガラスシリンジを介して転送されます。匂い刺激は、ソフトウェアによって制御ソレノイド活性化バルブによってパルスした。
10. ユニット活動が突然停止し、または変更された場合は、生理的食塩水の点滴をチェックして、15分間の準備休止してください。自発的な活動はその前のレベルを回復しない場合は可能であればその後の準備は破棄され、別の蜂が使用されるべきである。
11. 実験後、まだ組織内プローブを用いた20分間5％ホルマリンで脳を固定します。次に、消費税の脳そして4時間2％グルタルアルデヒドに置き、その後、段階的なエタノール脱水系列を行うとサリチル酸メチルと脳をクリアします。固定に基づいており、組織のクリア、電極が組織を穿刺アラバマ州の場所は、共焦点顕微鏡によって明確に識別する必要があります。

4。データ解析

1. 記録された神経単位を分離し、同定するための実験の後に収集されたデータを分析します。このようなピークまたは谷振幅、ピーク半値幅などのスパイク形状、または減圧措置に基づいて別々の波形、または"スパイク"（主成分^）17に代表的なソフトウェアプログラムを（オフラインソーター、MClust、そしてSClust）を使用し^、18（ 図2）。三次元空間で分離された（PC1〜PC3）と、互いに統計的に異なっているスパイクのだけそれらのクラスタを使用して（多変量ANOVA、P <0.05）（ 図2）、さらなる分析のため。を参照してくださいテトロード記録とスパイクソーティング方法論の完全な説明については、引用＃S 17から19。
2. 各クラスタ内のタイム·スタンプスパイク、ラスタープロットと発火率応答（ 図2、図3（a））を作成するためのMATLABまたはNeuroexplorer（NEXテクノロジーズウィンストンセーラム、ノースカロライナ州）を用いて、分析のためにこれらのデータをエクスポートします。
3. 同時に記録GCデータを用いて揮発性成分の保持時間を特定します。それらの時点でユニットの応答を調べるために、クロマトグラムからピークの頂点によって決定揮発性物質の保持時間を使用します。
4. GC分析を介して個々のユニットの応答を調べるために、100ミリ秒間隔でスパイクの数をbinおよび揮発性物質を溶出する保持時間を参照して、速度応答を焼成の時間経過を調べる。 100ミリ秒間隔でスパイクのビニングは、GCから溶出​​する匂い物質への神経応答の時間経過について、十分な詳細、または信号を提供します。
5. EXAに異なる溶出揮発性物質への人口応答を採掘、前、3秒のサンプリング·ウィンドウの上に1.5秒を個々のユニットの発火率応答を統合し、1.5秒後の保持時間揮発性（ 図3）。この期間は、GCから揮発性溶出の期間の典型です。我々は、色分けして（赤が高発射レート応答であり、青は低い応答です）によってユニットの速度応答を発射示し、（列）のGC排水にアンサンブル応答を表す各行が活性マトリックスとして、それらを配置する（ 図3）。

結果

Mを使用GCMRアッセイでlewisiiフローラルの香りは、GCに抽出物の3μlを注入します。 GCを介して溶出する揮発性物質の総数は、一般的に60から70揮発性物質である。 Mの香りlewisiiは、主に 6 -炭素例えば、2 -ヘキサノールなどの揮発性物質、およびヘッドスペースの<1％を含むセスキテルから成る香りの残りの部分とは、β-ミルセン（非環式）およびα-<...

ディスカッション

昆虫嗅覚媒介行動は、再生、ホストサイトの選択、適切な食糧資源の識別を含む多くの異なるプロセスを駆動する。これらのプロセスの研究では、光源から出射された揮発性物質と同様に、行動を媒介されるそれらの化合物を同定するための能力を識別する能力を必要とします。ややこしいことは臭いが一緒に個々の成分^6,7,13,19,20とは異なる知覚される独特の香りを作成し、個々の?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
アイテムの名前	会社	カタログ番号	注釈
PorapakタイプQ 80から100メッシュ	ウォーターズ	WAT027060
レイノルズ·オーブンバッグ	レイノルズ
GC	アジレント	7820A
GCカラム	J＆Wサイエンティフィック、フォルサム、カリフォルニア州、米国	DB-5（30メートル、0.25ミリメートル、0.25μm）を
分析ヘリウムキャリアガス	Praxair社	HE K	1 cc /分
16チャネルシリコン電極	Neuronexus Technologies	a4x4-3mm50-177
細線たNiCr、0.012ミリメートルの直径）	サンドビックカンタルのHPリード	PX000004	カスタム極管とstereotrodesを作るための
前置増幅器	タッカー·デイビスシステム	PZ-2
アンプ	タッカー·デイビスシステム	RZ-2
データ取得システム - OpenExのスイート	タッカー·デイビスシステム
オンラインスパイクソーティングソフトウェア - SpikePac	タッカー·デイビスシステム
オフラインスパイクソーティングソフトウェア - Mclustスパイクソーティングツールボックス	デビッドRedish、神経科学、大学の学科ミネソタ州の	無料でダウンロードできますhttp://redishlab.neuroscience.umn.edu/MClust/MClust.html	MATLABのツールボックス