用气相色谱 - 多单元的录音（GCMR）昆虫触角叶嗅觉挥发物的鉴定

摘要

嗅觉介导许多不同的昆虫的行为，并经常由数十至数百种挥发性化合物组成的复杂混合物。气相色谱法与多通道记录在昆虫触角叶中，我们描述的生物活性化合物的鉴定方法。

摘要

所有的生物体生活在一个世界充满感官刺激，确定其所处的环境行为和生理反应。嗅觉是特别重要的昆虫，它用自己的嗅觉系统响应和歧视之中，复杂的刺激气味。这些气味引起的行为，调解过程，如繁殖和栖息地选择^1-3。此外，化学传感由昆虫介导的行为，农业和人类健康是非常重要的，其中包括^4-6，草食动物的粮食作物^7，授粉和传播疾病^8,9。因此，在昆虫行为的嗅觉信号，其作用是识别重要的，了解生态过程和人类的食物资源和福祉。

至目前为止，已经难以识别驱动昆虫行为的挥发性物质，往往是乏味。目前的技术包括:气相色谱耦合电生理记录（GC-EAG）和气相色谱耦合的单感器录音^{（GC-SSR）10-12。}这些技术被证明是重要的生物活性化合物的鉴定。我们已经开发出一种方法，使用气相色谱多通道电生理的录音（称为"GCMR"）的神经元在触角叶（AL;昆虫的嗅觉中枢^）13,14。这个国家的最先进的技术使我们能够探测气味信息是如何表示的昆虫的大脑。此外，因为在这个级别的嗅觉处理神经元对气味的反应是非常敏感的，因为天线AL神经元的受体神经元到收敛的程度，AL录音可以让活性成分自然的​​气味，高效和高灵敏度的检测。在这里，我们描述GCMR举一个例子，它的使用。

一些一般的步骤是国际富豪的ved检测生物活性挥发物和昆虫响应。挥发物，首先需要收集的利益来源（在这个例子中，我们使用花沟酸浆属 （属Phyrmaceae）），其特征为需要使用标准的GC-MS技术^14-16。昆虫准备用最小的解剖研究，之后记录电极插入触角叶，多渠道的神经开始录制的。处理后的神经数据，然后显示特定的气味分子的昆虫的神经系统造成显着的神经反应。

虽然我们在这里给出的例子中特定授粉研究，GCMR可以扩大到范围广泛的研究生物和挥发性来源。例如，此方法可用于在吸引或排斥矢量昆虫和作物害虫的加臭剂的识别。此外，GCMR也可以被用来识别有益昆虫的引诱剂，如婆llinators。该技术可以扩展到非昆虫科目以及。

研究方案

1。挥发性Follection

1. 在这个例子中，我们使用挥发性样品M. lewisii花-高山野花原产于美国加州。收集挥发物，采用动态吸附方法，根据到Riffell 等^。14。简单地说，该方法采用一个闭环特氟隆包括在花捕集系统。使用的惰性的真空泵，花的周围空气被吸入，通过一个"陷阱"巴斯德吸管包括充满PORAPAK Q矩阵。从泵的返回空气通过活性炭过滤。一规定时间周期之后，在我们的情况下24小时，PORAPAK Q矩阵，用一种非极性溶剂中，典型的己烷洗脱，收集的浓缩提取物。的提取物，然后储存于-80℃直至分析。如果有必要，样品可以被集中在分析之前，下的氮气流。除非样品良好的特点，运行等分，它通过一个气相色谱 - 质谱（GC-MS）使用样品之前确定挥发性成分。

2。电准备

1. 剪切约1厘米，从1,000微升的移液管尖的末尾。放置一个熊蜂（ 熊蜂的凤仙花 ）到移液管尖端部的基础上，并轻轻推向相对端的前端，直到只有头部露出。
2. 牙科用蜡融化，并在外露的头，模具的蜡附着在安全的复眼，使蜜蜂的头部完全不动。请务必不要让任何到天线的蜜蜂蜡。
3. 一旦头是安全的，做成正方形，窗口等，切口进入头部胶囊用剃刀刀片断路器或适当大小的手术刀切角质层。使用刀片的断路器，从背侧的头壳，紧接后面的天线和相邻的一个的化合物眼。切一条直线上，从一个复眼对侧复眼。直线切割后到对面的复眼，开始做一个切口，背部，直到头壳曲线和其胸部两端附近。在这一点上，朝向头部胶囊的相对端开始削减。最后，一​​旦一条线被切断的相对端，切断回线的初始切口到起始位置。重要的是要除去角质层是相邻天线，因为这会妨碍插入电极。
4. 的角质层被切断后，使用钳子删除蜂角质层，然后公开蜜蜂的大脑，更重要的是，在触角叶。立即开始与昆虫盐水，superfusing大脑，使大脑不成为dessicated的。后大脑暴露出来，仔细一对非常细小的镊子以上的触角叶外周神经鞘立即删除。要非常小心，不蜜蜂的大脑穿刺的镊子。

3。气相色谱与多声道录音

1. 蜜蜂"准备" - 管固定在它的大脑暴露 - 现在是准备好电生理记录。将蜜蜂，固定在夹具的磁基地，位于空气表。
2. 安排的输液袋，流量控制器，和油管（充满昆虫盐水），以便，盐水连续superfuses大脑。
3. 使用一台显微操作，insertareference电极，钨丝，到蜜蜂的眼睛。
4. 使用一个单独的微操纵器，如一个螺旋线的四极管，或硅的多通道电极（Neuronexus技术），插入的多通道电极， 到的蜜蜂触角叶。此电极被连接到一个预放大器，如的TDT系统的S-3 Z系列的TDT系统的Z-的总线bioamp处理器。气相色谱输出matogram经由屏蔽BNC电缆的探测器可以是接口与放大器和数据采集系统，使得两个神经和GC的信号是同步的。
5. 等待约30-60分钟，以稳定的神经录音。一旦在记录信道为单位的自发活动和波形形状已成为一致，使用的气味刺激的蜜蜂的注射器，并观察响应的记录信道的气味。
6. 记录神经元的细胞外尖峰通过自动阈值由3.5至5西格玛各个记录通道上的信号的记录信道。手动阈值，可能需要一些渠道，以避免电气噪声污染。从神经元的动作电位，会出现作为在记录通道的电压尖峰。当通道的电压超过阈值时，系统缓冲器并保存阈值交叉之前和之后的几毫秒，从而羚牛GA管理单元拍摄的波形，或尖峰。
7. 立即到空气表旁边是GC。花的提取物注射到GC之前，请务必升温的GC运行，该方法是正确的。在我们的例子中，我们使用一个开始温度的方法，在50℃，4分钟，随后在10℃/分钟的速率由一个增加的温度。至220°C，届时我们举办的GC 6分钟。我们使用DB-5气相色谱柱（J＆W科学，福尔瑟姆，CA，USA），用氦气作为载气。的入口是不分流，与设定为200℃的温度下火焰离子化检测器的温度被设定为230℃。
8. 的提取物样品的花香顶空进样到被加热的注射端口的GC释放到GC柱吸附的挥发物。列的污水分裂1:1之间火焰离子化检测器（FID）和蜜蜂天线使用玻璃"Y"型连接器（J＆W科学）。开始记录奥尔丁从电极注入到GC中的样本。
9. GC运行完成后，让制备5〜15分钟的休息。然后或者另一个样品注入到GC或刺激使用单一挥发性化合物或化合物的混合物的制剂。在这后者的刺激的制备方法，从一个恒定的空气流的空气的脉冲改道通过含有该化合物已经沉积的一片滤纸的玻璃注射器。由一个螺线管激活的阀，由软件控制的装置，脉冲刺激气味。
10. 如果单位活动突然停止或更改，请检查吊盐水，让准备休息了15分钟。如果自发活动不恢复以前的水平，然后准备应被丢弃和另外一只蜜蜂（如果可用）。
11. 实验结束后，用5％福尔马林20分钟的探头还组织修复大脑。其次，消费的大脑并将其放置在2％的戊二醛，4小时，并随后做一个梯度乙醇脱水系列和清除与水杨酸甲酯的脑。基于的组织，其中电极刺破组织应该是清晰可辨的，通过共聚焦显微镜在AL的位置上的固定和结算。

4。数据分析

1. 分析所收集的数据，实验后的分离和识别所记录的神经单位。使用典型的软件程序（离线的分拣，MClust，并SClust）独立波形，或"尖峰"，根据穗的形状，如峰值或谷值振幅，半峰宽等，或减少的措施（主要成分^{）17 ，18（} 图2）。只有那些使用集群的尖峰，在 ​​三维空间中分离（PC1-PC3），在统计学上彼此不同的（多元方差分析，P <0.05）（ 图2），以供进一步分析。请参阅引用＃S 17-19的四极记录和穗排序方法的完整描述。
2. 在每个群集高峰时间戳记，并导出这些数据进行分析，使用MATLAB或Neuroexplorer的（NEX），北卡罗来纳州温斯顿-塞勒姆，创建栅格图和射击频率响应（ 图2，图3A）。
3. 识别使用同时记录GC数据的挥发物的保留时间。使用的挥发物的保留时间，确定从色谱图中的峰的顶点，在这些时间点检查单元响应。
4. 要检查个别单位的反应，通过GC运行，BIN数的峰值在100毫秒的间隔和检查过程中，发射率参考洗脱挥发物的保留时间。在100毫秒的时间间隔的像素合并的尖峰提供足够的细节，或信号，有关的时间过程中神经元的响应于从GC洗脱加臭剂。
5. 要EXA开采的人口不同洗脱挥发物的反应，集成的单个的单元的发射率响应超过3秒的采样窗口，1.5秒前，和1.5秒后，在保留时间为易失性的（ 图3）。此时间段典型的洗脱挥发性从GC的持续时间。我们发射率响应的单位按颜色编码（红色的是射速高，反应，蓝色是一种低响应），并安排他们的活动矩阵，每一行代表合奏GC污水（列）（ 图3）。

结果

在使用M. GCMR分析的lewisii花香的味道，我们3微升提取物注入到GC。挥发物的纯化，通过GC的总数通常为60-70挥发物。香味M. lewisii是主要组成的单萜类化合物，包括β-月桂烯（非周期性）和α-蒎烯，用剩余六碳挥发物，如2 -己醇，倍半萜类化合物，包括<1％的顶空组成的气味。

GCMR利用触角叶神经元的敏感性，以及神经元的处理用的重要的生物...

讨论

昆虫的嗅觉介导的行为驱动许多不同的流程，包括复制，主机选址，并确定适当的食物资源。这些过程的研究需要从源头抓起，以及识别能力，调解行为的化合物，这些化合物的挥发物排放的识别能力。复杂的问题是，气味是由几十到几百，共同创造一个独特的气味，被认为比单个的成分^6,7,13,19,20不同的单个化合物。 ，最初研究中的性信息素系统¹²进行的，最近更是在食品和产卵...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
项目名称	公司	目录编号	评论
PORAPAK Q型80-100目	沃特斯	WAT027060
雷诺烤箱袋	雷诺
GC	安捷伦	7820A
GC柱	J＆W科学，福尔瑟姆，CA，USA	DB-5（30米，0.25毫米，0.25微米）
分析氦载气	普莱克斯	HE K表	1毫升/分钟
16通道硅电极	Neuronexus技术部历史ologies	a4x4-3mm50-177
细金属丝镍铬，0.012毫米直径）	山特维克山特维克HP里德	PX000004	为了使自定义的四极管和stereotrodes
前置放大器	塔克 - 戴维斯系统	PZ-2的
扩音器	塔克 - 戴维斯系统	RZ-2
数据采集​​系统 - OpenEx套件	塔克 - 戴维斯系统
在线穗排序软件 - SpikePac	塔克 - 戴维斯系统
离线穗排序软件 - Mclust穗排序工具箱	大卫雷迪希，大学神经科学系美国明尼苏达州	免费在http://redishlab.neuroscience.umn.edu/MClust/MClust.html下载	MATLAB工具箱