L'identification des composés volatils olfactifs chromatographie en phase gazeuse-à logements multiples enregistrements (GCMR) dans le lobe antennaire des insectes

Résumé

Signaux olfactifs médiation de nombreux comportements différents chez les insectes, et sont des mélanges souvent complexes composées de quelques dizaines à quelques centaines de composés volatils. Chromatographie en phase gazeuse avec multi-canal d'enregistrement dans le lobe antennaire des insectes, nous décrivons une méthode pour l'identification de composés bioactifs.

Résumé

Tous les organismes vivent dans un monde plein de stimuli sensoriels qui déterminent leur réponse comportementale et physiologique à leur environnement. L'olfaction est particulièrement important chez les insectes, qui utilisent leurs systèmes olfactifs à répondre et à discriminer entre les stimuli, d'odeurs complexes. Ces odeurs susciter des comportements qui interviennent dans des processus tels que la reproduction et la sélection de l'habitat ^1-3. En outre, la détection chimique par la médiation des comportements des insectes qui sont très importants pour l'agriculture et la santé humaine, y compris la pollinisation ^4-6, herbivores de ⁷ cultures vivrières, et la transmission de la maladie de ^8,9. Identification des signaux olfactifs et leur rôle dans le comportement des insectes est donc important de comprendre les processus écologiques et les ressources alimentaires de l'homme et du bien-être.

À ce jour, l'identification des substances volatiles qui animent le comportement des insectes a été difficile et souvent fastidieux. Les techniques actuelles comprennentd'enregistrement gaz électroantennogramme chromatographie couplée (GC-EAG) et chromatographie en phase gazeuse couplée simples enregistrements sensille (GC-SSR) ^10-12. Ces techniques s'est avéré crucial dans l'identification de composés bioactifs. Nous avons développé une méthode qui utilise la chromatographie gazeuse couplée à canaux multiples enregistrements électrophysiologiques (appelé «GCMR ') de neurones dans le lobe antennaire (AL; primaire de l'insecte centre olfactif) ^13,14. Cette technique state-of-the-art nous permet d'explorer la manière dont l'information odeur est représenté dans le cerveau des insectes. En outre, parce que les réponses neuronales aux odeurs à ce niveau de traitement en raison olfactive sont très sensibles au degré de convergence des neurones récepteurs de l'antenne en neurones AL, AL enregistrements permettra la détection des constituants actifs des odeurs naturelles de manière efficace et avec une grande sensibilité. Nous décrivons ici GCMR et donner un exemple de son utilisation.

Plusieurs étapes générales sont impliqués dans la détection des substances volatiles bioactives et de réponse aux insectes. Volatiles doivent d'abord être recueillies auprès de sources d'intérêt (dans cet exemple, nous utilisons des fleurs du genre Mimulus (Phyrmaceae)) et caractérisé, au besoin en utilisant des techniques de GC-MS ^14-16. Les insectes sont préparés pour l'étude en utilisant un minimum de dissection, après quoi, une électrode d'enregistrement est inséré dans le lobe antennaire multi-canal et l'enregistrement commence neuronal. Post-traitement des données neuronales qui révèle alors odorants particuliers entraîner des réactions neurales par le système nerveux des insectes.

Bien que l'exemple que nous présentons ici est spécifique aux études de pollinisation, GCMR peut être étendu à un large éventail d'organismes d'étude et des sources volatiles. Par exemple, cette méthode peut être utilisée pour l'identification de substances odorantes attirant ou repoussant les insectes vecteurs et les ravageurs des cultures. En outre, GCMR peut également être utilisé pour identifier attractifs pour les insectes bénéfiques, tels que pollinators. La technique peut être étendue à des non-sujets insectes ainsi.

Protocole

1. Follection volatile

1. Dans cet exemple, nous utilisons les échantillons volatils de M. fleurs lewisii - un natif de fleurs sauvages alpines en Californie. Volatils sont recueillis à l'aide des méthodes dynamiques de sorption selon Riffell et al. ^14. En bref, cette méthode utilise un système en boucle fermée piégeage où les fleurs sont enfermées dans un sac en téflon. En utilisant une pompe à vide inerte, l'air autour des fleurs est aspiré à travers un «piège» composé d'une pipette Pasteur rempli de Porapak Q matrice. L'air de retour de la pompe est filtrée par le charbon actif. Après une période de temps prescrite, dans notre cas, 24 h, le Porapak Q matrice est éluée avec un solvant non polaire, généralement hexane, pour recueillir l'extrait concentré. L'extrait est ensuite stocké dans -80 ° C jusqu'à l'analyse. Si nécessaire, les échantillons peuvent être concentrée avant l'analyse sous un courant d'azote gazeux. Sauf si l'échantillon est déjà bien caractérisé, exécutez une aliquote de l'un parchromatographie en phase gazeuse-spectrométrie de masse (GC-MS) pour identifier les composants volatils avant d'utiliser l'échantillon.

2. Préparation électrophysiologique

1. Couper environ 1 cm de l'extrémité d'une pointe de pipette 1000 pi. Placez un bourdon (Bombus impatiens) dans la base de la pointe de pipette et poussez doucement vers l'extrémité opposée de la pointe jusqu'à ce que la tête est exposée.
2. Faire fondre la cire dentaire et la façonner autour de la tête exposée, en s'assurant que les adhère cire sur les yeux composés de sécurité et de faire la tête de l'abeille complètement immobile. Soyez sûr de ne pas obtenir la cire sur l'antenne de l'abeille.
3. Une fois que la tête est sûr, faire un carré, en forme de fenêtre, incision dans la capsule tête à l'aide d'un rasoir à lame coupe-circuit ou la taille adéquate scalpel pour couper les cuticules. Avec la lame de coupe-, à partir de la face dorsale de la tête de capsule, immédiatement derrière l'antenne et une adjacente à des yeux à facettes. Couperune ligne droite et d'un composé oeil à l'oeil controlatéral composé. Après avoir coupé une ligne droite à l'œil composé contraire, commencer à faire une incision dorsale jusqu'à ce que les courbes de la capsule céphalique et se termine près de son thorax. À ce stade, commencer à couper vers l'extrémité opposée de la capsule céphalique. Enfin, une fois qu'une ligne a été coupée à l'extrémité opposée, couper une ligne de retour à la position de départ de l'incision initiale. Il est important de supprimer la cuticule qui est adjacente à l'antenne, car cela empêcher l'insertion de l'électrode.
4. Une fois que la cuticule est coupé, utiliser une paire de pinces pour enlever la cuticule des abeilles, qui devrait ensuite exposer le cerveau de l'abeille et, plus important encore, les lobes antennaires. Commencer immédiatement superfusing le cerveau des insectes avec une solution saline, de sorte que le cerveau ne soit pas desséché. Après le cerveau est exposé, soigneusement d'utiliser une paire de pinces très fines pour retirer la gaine périneurale immédiatement au-dessus des lobes antennaires. Soyez très prudent de ne pasperforation du cerveau de l'abeille avec la pince.

3. Chromatographie en phase gazeuse avec Multi-canal d'enregistrement

1. L'abeille "préparation" - fixé dans un tube avec son cerveau exposé - est maintenant prêt pour l'enregistrement électrophysiologique. Placer l'abeille dans une pince, fixé sur un support magnétique qui se trouve sur une table pneumatique.
2. Fixer une poche de perfusion, régulateur de débit et un tube (rempli d'une solution saline d'insecte), de sorte que la solution saline superfuses continu du cerveau.
3. L'aide d'un micromanipulateur, insertareference électrode, faite de fil de tungstène, dans l'œil de l'abeille.
4. À l'aide d'un micromanipulateur séparée, insérer le électrode à canaux multiples, par exemple un fil enroulé tétrode, ou de silicium multi-canaux d'électrode (Technologies NeuroNexus), dans les lobes antennaires de l'abeille. Cette électrode est reliée à un pré-amplificateur tel que le S-3 TDT système de série au processeur Z BioAmp Z-bus du système TDT. La sortie de la Chro gazdétecteur matogram par l'intermédiaire d'un câble blindé BNC peut être interfacé avec le système d'acquisition de données et amplificateur de telle sorte que le signal à la fois nerveuse et GC est synchronisé.
5. Attendre environ 30-60 minutes pour les enregistrements de neurones pour se stabiliser. Une fois l'activité spontanée et de la forme d'onde d'unités dans les canaux d'enregistrement sont devenues compatibles, utilisez une seringue odeur de stimuler l'abeille et observer la réponse des canaux d'enregistrement à l'odeur.
6. Enregistrer des pointes extracellulaires de neurones auto-seuillage par les canaux d'enregistrement par 3,5 à 5 sigma du signal sur les canaux d'enregistrement individuels. Seuillage manuel ne peut être exigée pour certains canaux pour éviter toute contamination du bruit électrique. Les potentiels d'action des neurones apparaissent comme des pointes de tension dans le canal d'enregistrement. Lorsque la tension de la chaîne dépasse le seuil, le système de mémoire tampon et permet d'économiser les quelques millisecondes avant et après le franchissement du seuil, ce qui takinga instantané de la forme d'onde, ou une pointe.
7. Juste à côté de la table de l'air est le GC. Avant d'injecter l'extrait floral dans la GC, assurez-vous que la méthode de la rampe de température de la piste de GC est correcte. Dans notre exemple, nous utilisons une méthode de la température de départ à 50 ° C pendant 4 min suivie d'une augmentation de la température à une vitesse de 10 ° C / min. à 220 ° C, à laquelle nous tenons la GC pour un autre 6 min. Nous utilisons une colonne DB-5 GC (J & W Scientific, Folsom, CA, USA), avec l'hélium comme gaz porteur. L'entrée est sans division, avec une température réglée à 200 ° C. La température du détecteur à ionisation de flamme est réglée à 230 ° C.
8. Injecter l'échantillon extrait de l'espace de tête florale dans le port d'injection chauffée de la GC pour libérer les composés volatils adsorbés dans la colonne GC. L'effluent de la colonne est divisée 1:1 entre le détecteur à ionisation de flamme (FID) et l'antenne d'abeille à l'aide d'un verre "Y" (J & W Scientific). Commencez recording de l'électrode comme vous injecter un échantillon dans la GC.
9. Après la course GC est terminée, laisser reposer la préparation pendant 5 à 15 min. Ensuite, soit injecter un autre échantillon dans la GC ou de stimuler la préparation à l'aide simples composés volatils ou mélanges de composés. Dans ce dernier mode de stimulation de la préparation, des impulsions d'air à partir d'un flux d'air constant est dévié à travers une seringue en verre contenant un morceau de papier filtre sur laquelle les composés ont été déposés. Le stimulus d'odeur a été puisées au moyen d'une électrovanne à commande contrôlée par le logiciel.
10. Si l'activité de l'unité s'arrête soudainement ou modifications, consultez le goutte à goutte une solution saline et laissez reposer la préparation pendant 15 min. Si l'activité spontanée ne retrouve pas son niveau précédent, puis la préparation doit être jeté et une autre abeille utilisés s'ils sont disponibles.
11. Après l'expérience, le cerveau fixer avec 5% de formol pendant 20 min avec la sonde reste dans le tissu. Ensuite, le cerveau d'acciseet placez-le dans du glutaraldéhyde à 2% pendant 4 heures, puis faire une série d'éthanol à la déshydratation et effacer le cerveau avec du salicylate de méthyle. Sur la base de la fixation et de la compensation du tissu, les emplacements de la AL où les électrodes perforé le tissu doit être clairement visible par microscopie confocale.

4. Analyse des données

1. Analyser les données recueillies après l'expérience pour séparer et identifier les unités de disques de neurones. Utiliser des logiciels typiques (trieuse Hors ligne, MClust et SClust) aux formes d'onde distincte, ou «pointes», basé sur des formes pointe, tels que l'amplitude crête ou de vallée, pic demi-largeur, etc, ou des mesures réduites (composantes principales) ^{17 , 18} (figure 2). Utilisez uniquement les grappes de pointes qui se sont séparés dans l'espace tridimensionnel (PC1-PC3) et sont statistiquement différents entre eux (ANOVA multivariée, p <0,05) (figure 2) pour une analyse plus approfondie. S'il vous plaît se référer àcitation # s 17-19 pour une description complète de l'enregistrement tétrode et pointes de tri des méthodologies.
2. Horodater les pointes dans chaque grappe, et d'exporter ces données pour l'analyse en utilisant MATLAB ou Neuroexplorer (Technologies Nex, Winston-Salem, Caroline du Nord) pour créer des parcelles de trame et les réponses cadence de tir (figures 2, 3A).
3. Identifier les temps de rétention des composés volatils à partir des données enregistrées simultanément GC. Utiliser les temps de rétention des substances volatiles, déterminées par le sommet du pic du chromatogramme, pour examiner les réponses unitaires à ces points dans le temps.
4. Pour examiner les réponses des unités individuelles à travers la course GC, ben le nombre de pics dans les intervalles 100 ms et d'examiner l'évolution temporelle de tirer des réponses de taux par rapport à la durée de rétention d'élution volatiles. Le regroupement des pointes à 100 ms intervalles fournit suffisamment de détails, ou signal, à propos de l'évolution temporelle de la réponse neuronale à une substance odorante éluant de la GC.
5. Pour exaextraire les réactions des populations aux substances volatiles élution différents, intégrer les réponses de fréquence de décharge des unités individuelles au cours d'une fenêtre d'échantillonnage 3 sec, 1,5 sec avant et après 1,5 secondes, le temps de rétention du volatile (figure 3). Cette période de temps est typique de la durée d'une élution volatile de la GC. Nous montrons tir réponses tarifaires des unités de codage couleur entre eux (le rouge est une réponse tir à haut débit, le bleu est une réponse faible) et en les disposant comme une matrice des activités à chaque ligne représentant la réponse d'ensemble à l'effluent GC (colonnes) ( Figure 3).

Résultats

Dans l'essai à l'aide du GCMR M. lewisii parfum floral, nous injectons 3 pi de l'extrait dans le CG. Le nombre total de substances volatiles élution à travers la GC est généralement 60-70 volatiles. Le parfum de M. lewisii est constitué en majorité de monoterpenoids, y compris β-myrcène (acyclique) et α-pinène, le reste de l'odeur composée de six-carbone volatiles, tels que le 2-hexanol, et qui comprennent des sesquiterpénoïdes <1% de l'espace de t...

Discussion

Olfactif des insectes à médiation comportements conduire de nombreux processus différents, y compris la reproduction, la sélection du site d'accueil, et l'identification des ressources alimentaires appropriées. L'étude de ces processus nécessite la capacité d'identifier les composés volatils émis par la source, ainsi que la capacité d'identifier les composés qui sont médiatrices les comportements. Pour compliquer les choses, c'est que les odeurs sont composées de quelques dizaines ?...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nom de l'objet	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Porapak Q Type 80-100 mesh	Eaux	WAT027060
Sacs Four Reynolds	Reynolds
GC	Agilent	7820A
Colonne GC	J & W Scientific, Folsom, CA, USA	DB-5 (30 m, 0,25 mm, 0,25 um)
D'analyse de gaz vecteur hélium	Praxair	HE K	1 cc / min
16-canal électrode de silicium	NeuroNexus Technologies	a4x4-3mm50-177
NiCr fil fin, 0,012 mm de diamètre)	Sandvik Kanthal HP Reid	PX000004	Pour faire tétrodes personnalisés et stereotrodes
Pré-amplificateur	Tucker-Davis Système	PZ-2
Amplificateur	Tucker-Davis Système	RZ-2
L'acquisition de données système - OpenEx Suite	Tucker-Davis Système
En ligne spike-tri logiciels - SpikePac	Tucker-Davis Système
Hors ligne spike-tri logiciels - Mclust Spike-tri boîte à outils	David Redish, Department of Neuroscience, Universitédu Minnesota	Téléchargement gratuit à http://redishlab.neuroscience.umn.edu/MClust/MClust.html	MATLAB boîte à outils