זיהוי נדיפים חוש ריח באמצעות קלטות כרומטוגרפיה-Multi-יחידת גז (GCMR) באונת מחושי החרקים

Summary

רמזי ריח לתווך התנהגויות רבות ושונות בחרקים, ולעתים קרובות הם תערובות מורכבות מורכבות מעשרות עד מאה תרכובות נדיפות. שימוש בגז כרומטוגרפיה עם הקלטה רבה ערוצית באונת מחושי החרקים, אנו מתארים שיטה לזיהוי של תרכובות ביו.

Abstract

כל היצורים חיים בעולם מלא בגירויים חושיים שקובעים התגובה התנהגותית ופיזיולוגית שלהם לסביבתם. Olfaction חשוב במיוחד בחרקים, המשתמשים במערכות חוש הריח שלהם כדי להגיב, ולהפלות בין גירויי ריח, מורכבים. ריחות אלה לעורר התנהגויות אשר מתווכים תהליכים כגון רבייה ובית גידול בחירת ^1-3. בנוסף, חישה כימית על ידי חרקי התנהגויות מתווכות שהם משמעותיים ביותר לחקלאות ולבריאותו של אדם, כוללים האבקה ^4-6, תזונה צמחונית של גידולי מזון ^7, והעברת מחל ^8,9. זיהוי אותות ריח ותפקידם בהתנהגות חרקים כן חשוב להבנת שני תהליכים אקולוגיים ומשאבי מזון אדם ורווחתו.

עד כה, זיהוי נדיפים המניעים את התנהגות חרקים כבר קשה ולעתים מייגע. טכניקות שוטפות כוללותהקלטת גז כרומטוגרפיה מצמידי electroantennogram (GC-EAG), וגז כרומטוגרפיה שילוב הקלטות sensillum יחידות (GC-SSR) ^10-12. טכניקות אלה הוכחו כחיוניים בזיהוי של תרכובות ביו. אנחנו פתחנו שיטה שמשתמשת בגז כרומטוגרפיה מצמידה להקלטות אלקטרו מרובים ערוצים (מכונה 'GCMR') מתא העצב באונת המחושים (AL; מרכז ההרחה הראשוני של החרק) ^13,14. טכניקה זו מדינה-of-the-art מאפשרת לנו לחקור כיצד מידע ריח מיוצג במוח החרק. יתר על כן, בגלל תגובות עצביות לריחות ברמה זו של עיבוד חוש ריח הן בגלל רגישות גבוהה למידת ההתכנסות של נוירונים הקולטן של האנטנה לנוירונים AL, הקלטות AL תאפשרנה זיהוי של רכיבים פעילים של ריחות טבעיים ביעילות וברגישות גבוהה. כאן אנו מתארים GCMR ולתת דוגמה לשימוש בו.

כמה צעדים כלליים הם involVED בזיהוי של ביו נדיפים ותגובה של חרקים. נדיפים ראשונים צריכים להיות שנאספו ממקורות העניין (בדוגמה זו אנו משתמשים בפרחים מסוג פרח הקוף (Phyrmaceae)) ומאופיין במידת הצורך באמצעות טכניקות הסטנדרטיות GC-MS ^14-16. חרקים מוכנים למחקר באמצעות נתיחה מינימאלית, לאחר שחוט רושם מוכנס לתוך אונת מחושים ורבי ערוצי הקלטה עצבית מתחילה. לאחר העיבוד של הנתונים העצביים ואז מגלה שodorants מסוים לגרום לתגובות עצביות משמעותיות על ידי מערכת העצבים של החרקים.

למרות הדוגמא שנציג כאן היא ספציפית למחקרי האבקה, GCMR ניתן להרחיב למגוון רחב של אורגניזמים לימוד ומקורות נדיפים. לדוגמה, בשיטה זו ניתן להשתמש בזיהוי odorants מושך או דוחה חרקים ומזיקי וקטור צומח. יתר על כן, GCMR יכול לשמש גם כדי לזהות משיכה לחרקים מועילים, כגון פוllinators. הטכניקה עשויה להיות מורחבת לנושאים שאינם חרקים, כמו גם.

Protocol

1. Follection ההפכפך

1. בדוגמה זו, אנו משתמשים בדגימות נדיפים ממ ' פרחי lewisii - יליד אלפיני פרחי בר בקליפורניה. נדיפים נאספים באמצעות שיטות ספיחה דינמיות לפי Riffell et al. ^14. בקצרה, שיטה זו מעסיקה מערכת השמנת לולאה סגורה שבו פרחים מוקפים בשקית טפלון. שימוש במשאבת ואקום אינרטי, האוויר סביב הפרחים נשאב באמצעות "מלכודת" המורכבת מפסטר פיפטה מלאה Porapak Q מטריצה. אוויר ההחזרה מהמשאבה מסונן על ידי פחם פעיל. לאחר פרק זמן שנקבע, במקרה שלנו 24 השעות, Porapak Q מטריצת eluted עם הלא קוטבי ממס, בדרך כלל הקסאן, לאסוף את התמצית המרוכזת. אז התמצית מאוחסנת ב-80 ° C עד ניתוח. במידת צורך, דגימות יכולות להיות מרוכזות לקראת ניתוח תחת זרם של גז חנקן. אם המדגם הוא גם מאופיין כבר, לרוץ aliquot שלו דרךגז כרומטוגרף מסת ספקטרומטר (GC-MS) כדי לזהות רכיבים תנודתיים לפני שימוש במדגם.

2. הכנת אלקטרו

1. חותך כ 1 סנטימטר מהקצה של קצה פיפטה 1000 μl. הנח דבורה (רקפת Bombus) לבסיס של קצה פיפטה ודחף בעדינות לכיוון הקצה השני של הקצה עד שרק ראשו חשוף.
2. ממס שעוות שיניים ולעצב אותו סביב ראשו החשוף, ולוודא כי נדבק השעווה על העיניים המתחמות לביטחון וכדי שהראש של הדבורה נייחת לחלוטין. הקפד שלא לקבל כל שעווה על האנטנה של הדבורה.
3. ברגע שראשו כבר מובטח, להפוך את הכיכר, חתך, חלון דמוי לתוך כמוסת הראש באמצעות תער להב מפסק או בגודל מתאים אזמל כדי לחתוך את הציפורן. שימוש בלהב המפסק, להתחיל מהצד הגבי של כמוסת הראש, מייד מאחורי אחד האנטנה וסמוך לעיניים המורכבות. חותךקו ישר, מעין אחת למתחם העין המתחמת הנגדית. לאחר חיתוך קו ישר לעין המורכבת ההפוכה, להתחיל לבצע חתך dorsally עד עקומות ראש הקפסולה ומסתיימת באזור בית החזה שלה. בשלב זה, מתחיל לחתוך לכיוון הקצה השני של הקפסולה בראש. לבסוף, לאחר השורה נחתכה לקצה השני, לחתוך קו בחזרה למצב ההתחלתי של החתך הראשוני. חשוב להסיר את הציפורן שנמצאה בסמוך לאנטנה, כפי שזה יעכב את הכניסה של האלקטרודה.
4. ברגע שהציפורן היא לחתוך, השתמש זוג מלקחיים כדי להסיר את ציפורן הדבורה, שאמור לחשוף ואז המוח של הדבורה, וחשוב יותר, את אונות מחושים. מייד מתחיל superfusing המוח עם מלח חרקים, כך שהמוח אינו הופך מיובש. אחרי המוח חשוף, להשתמש בזהירות זוג מלקחיים עדינים מאוד כדי להסיר את נדן perineural מייד מעל אונות מחושים. להיות זהיר מאוד שלאלנקב המוח של הדבורה עם המלקחיים.

3. כרומטוגרפיה של גז עם הקלטה מרובים ערוצים

1. הדבורה "ההכנה" - קבועה בצינור עם המוח שלה נחשף - עכשיו הוא מוכן להקלטת אלקטרו. הנח את הדבורה במלחציים, מחובר לבסיס מגנטי שנמצא על שולחן אוויר.
2. סדר שקית האינפוזיה, בקר זרימה, וצינור (מלא בתמיסת מלח חרקים) כך שמלוח ברציפות superfuses המוח.
3. שימוש micromanipulator, אלקטרודה insertareference, עשוי חוטי טונגסטן, לתוך העין של הדבורה.
4. שימוש micromanipulator נפרד, הכנס אלקטרודה ערוץ רב, כגון tetrode מפותל תיל, או האלקטרודה רבה ערוצי סיליקון (טכנולוגיות Neuronexus), לאונות המחושים של הדבורה. אלקטרודה זו מחוברת למגבר מראש כגון סדרה של מערכת TDT S-3 Z למעבד bioamp Z-אוטובוס של מערכת TDT. פלט מהגז Chroהגלאי של matogram באמצעות כבל BNC מסוכך יכול להיות ממשק עם מערכת רכישת המגבר ונתונים כגון ששניהם אות העצבית ומסונכרנת GC.
5. יש להמתין כ 30-60 דקות להקלטות העצביות לייצוב. ברגע שהפעילות ספונטנית ובצורת גל של יחידות בערוצי ההקלטה הפכו עקבית, השתמש במזרק ריח כדי לעורר את הדבורה ולבחון את התגובה של ערוצי ההקלטה לריח.
6. הקלט קוצים תאיים מתאי עצב על ידי קביעת ערכי סף אוטומטי את ערוצי ההקלטה של ​​3.5-5 סיגמא של האות בערוצי ההקלטה הבודדים. thresholding הידני עשוי להידרש לערוצים מסוימים, כדי למנוע זיהום מרעש חשמלי. את פוטנציאל הפעולה מהנוירונים יופיע כקוצי מתח בערוץ ההקלטה. כאשר המתח של הערוץ עולה על הסף, המערכת אוגרת וחוסכת את כמה אלפית לפני ואחרי חציית הסף, ובכך לוקחתga Snap-זריקה של הגל, או ספייק.
7. מייד בסמוך לשולחן האוויר הוא GC. לפני הזרקת התמצית הפרחונית לGC, לוודא שהשיטה לרמפת הטמפרטורה של ריצת GC היא נכונה. בדוגמא שלנו, אנו משתמשים בשיטת הטמפרטורה מתחילה ב 50 מעלות צלזיוס למשך 4 דקות אחרי עלייה של טמפרטורה בשיעור של 10 מעלות צלזיוס / דקה. עד 220 מעלות צלזיוס, שבזמן שאנו מחזיקים GC ל6 דקות נוספות. אנו משתמשים DB-5 עמודת GC (J & W מדעי, פולסום, קליפורניה, ארה"ב), עם הליום כגז המוביל. הכניסה היא splitless, עם טמפרטורה להגדיר עד 200 ° C. טמפרטורת גלאי להבת היינון מוגדרת עד 230 ° C.
8. הזרק מדגם התמצית של אמיץ הפרחוני ליציאת ההזרקה המחוממת של GC לשחרר את נדיפים adsorbed לעמודת GC. השפכים מהעמודה מפוצלים 01:01 בין גלאי להבת היינון (FID) ואנטנת הדבורים באמצעות זכוכית "Y" מחבר (J & W מדעי). בגין recציוד רפואי ומדעי מאלקטרודה כפי שאתה מזריק לתוך מדגם GC.
9. לאחר ריצת GC סיימה, הניח להכנה במשך 5 עד 15 דקות. אז או להזריק דוגמה נוספת לGC או לעורר באמצעות הכנת תרכובות נדיפות בודדות או תערובות של תרכובות. בשיטה שנייה זה של גירוי ההכנה, פולסים של אוויר מזרם אוויר קבוע מופנים באמצעות מזרק זכוכית המכיל פיסת נייר מסנן שבו התרכובות הופקדו. גירוי הריח היה פעם באמצעות שסתום סולנואיד הופעל נשלט על ידי התוכנה.
10. אם פעילות של יחידה מפסיקה לפתע או שינויים, בדוק את עירוי תמיסת המלח ולהניח להכנה במשך 15 דקות. אם הפעילות הספונטנית אינה להשיב את רמתה הקודמת ולאחר מכן את ההכנה אמורה להיות מושלכת ועוד דבורה בשימוש אם הוא זמין.
11. לאחר הניסוי, לתקן את המוח עם 5% פורמלין למשך 20 דקות עם הבדיקה עדיין ברקמה. בשלב הבא, בלו המוחולמקם אותו בglutaraldehyde 2% ל 4 שעות, ולאחר מכן לעשות סדרת התייבשות אתנול מדורגת ולנקות את המוח עם סליצילט תיל. בהתבסס על התיקון והניקוי של רקמות, מקומות בAL בי האלקטרודות נקבה את הרקמה צריכה להיות ניכרת היטב על ידי מיקרוסקופיה confocal.

4. ניתוח נתונים

1. לנתח נתונים שנאספו לאחר הניסוי להפריד ולזהות את היחידות העצביות המוקלטות. השתמש בתוכנות טיפוסיות (סדרן מנותק, MClust, וSClust) לגל נפרד, או "קוצים", המבוסס על צורות ספייק, כמו שיא או העמק אמפליטודה, חץ רוחב שיא, וכו ', או באמצעים מופחתים (רכיבים עיקריים) ^{17 , 18} (איור 2). השתמש רק בצבירים אלה של קוצים שהפרידו במרחב תלת ממדי (PC1-PC3) ובחינה סטטיסטית שונה אחד מהשני (ANOVA הרב המשתנה, p <0.05) (איור 2) לניתוח נוסף. עייןצל"ש # של 17-19 לתיאור מלא של הקלטת tetrode ומתודולוגיות ספייק מיון-.
2. קוצי חותמת זמן בכל אשכול, ולייצא נתונים אלה לניתוח באמצעות MATLAB או Neuroexplorer (טכנולוגיות Nex, ווינסטון סאלם, צפון קרוליינה) ליצירת חלקות רסטר ותגובות קצב ירי (איורים 2, 3 א).
3. זהה את זמני השמירה של נדיפים תוך שימוש בנתוני GC נרשם בו זמנית. השתמש בזמני השימור של נדיפים, שנקבעו על ידי השיא של השיא מהכרומתוגרמה, לבחון תגובות יחידה בנקודתי הזמן אלה.
4. כדי לבחון תגובות יחידה בודדות באמצעות הפעלת GC, ייפטר מספר הקוצים במרווחי 100 msec ולבחון את הזמן במהלך ירי תגובת שיעור תוך התייחסות לזמן השמירה של משחררי נדיפים. Binning שיבולים במרווחי 100 msec מספק מספיק פרטים, או אות, על הזמן כמובן של התגובה העצבית לodorant משחררים מGC.
5. לExaלכרות את תגובות אוכלוסייה לנדיפים המשחררים השונים, לשלב את תגובות קצב הירי של יחידות בודדות מעל חלון 3 שניות דגימה, 1.5 שניות לפני, ו -1.5 שניות אחרי, זמן השמירה של נדיף (איור 3). פרק זמן זה הוא אופייני לתקופת משחררים הפכפכים מGC. אנחנו מראים ירי תגובות תעריפים, ביחידות על ידי קידוד צבעיהם (אדום הוא תגובת קצב ירי גבוהה; הכחול הוא תגובה נמוכה) וסידורם כמטריצת פעילות עם כל שורה מייצגת את התגובה להרכב שפכי GC (עמודות) ( איור 3).

תוצאות

בבדיקה באמצעות GCMR מ ' ניחוח פרחוני lewisii, אנחנו מזריקים 3 μl של התמצית לGC. המספר הכולל של נדיפים משחררים דרך GC הוא בדרך כלל 60-70 נדיפים. הריח של מ ' lewisii מורכב בעיקר מmonoterpenoids, כולל myrcene β (אציקליים) וα-pinene, יחד עם שארית הריח המורכב מנדיפים שש פחמן, כ?...

Discussion

התנהגויות חרקי חוש ריח בתיווך לנהוג תהליכים רבים ושונים, כולל רבייה, בחירת מארח אתר, וזיהוי משאבי מזון המתאימים. חקר התהליכים הללו מחייב את היכולת לזהות את נדיפים הנפלטים מהמקור, כמו גם את היכולת לזהות תרכובות אלו המתווכים את ההתנהגויות. מסבך עניינים הוא שריחות מורכב...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
שמו של פריט	חברה	מספר קטלוגים	תגובות
Porapak סוג ש 80-100 רשת	ווטרס	WAT027060
שקיות תנור ריינולדס	ריינולדס
GC	Agilent	7820A
טור GC	J & W מדעי, פולסום, קליפורניה, ארה"ב	DB-5 (30 מ ', 0.25 מ"מ, 0.25 מיקרומטר)
גז מוביל הליום אנליטי	Praxair	הוא K	1 סמ"ק / דקה
האלקטרודה 16-ערוץ סיליקון	Neuronexus technologies	a4x4-3mm50-177
NiCr פיין תיל, קוטר מ"מ 0.012)	Sandvik Kanthal HP ריד	PX000004	להכנת tetrodes וstereotrodes מותאם אישית
קדם מגבר	טאקר-דייוויס מערכת	PZ-2
מגבר	טאקר-דייוויס מערכת	RZ-2
נתוני רכישת מערכה - OpenEx חבילה	טאקר-דייוויס מערכת
תוכנה מקוונת מחודד מיון - SpikePac	טאקר-דייוויס מערכת
תוכנה מנותקת מחודד מיון - ארגז כלי Mclust ספייק מיון-	הדוד Redish, מחלקה למדעי המוח, האוניברסיטהמינסוטה	הורדה חינם בhttp://redishlab.neuroscience.umn.edu/MClust/MClust.html	MATLAB ארגז כלים