Определение летучих Обонятельные с помощью газовой хроматографии-Multi-единицы Recordings (ГКХ) в усиков насекомого Lobe

Резюме

Обонятельные сигналы посредником много различных поведения у насекомых, и часто являются сложной смесью состоящей из десятков до сотен летучих соединений. Использование газовой хроматографии с многоканальной записи в усиков насекомого доли, мы опишем метод для определения биологически активных соединений.

Аннотация

All organisms inhabit a world full of sensory stimuli that determine their behavioral and physiological response to their environment. Olfaction is especially important in insects, which use their olfactory systems to respond to, and discriminate amongst, complex odor stimuli. These odors elicit behaviors that mediate processes such as reproduction and habitat selection^1-3. Additionally, chemical sensing by insects mediates behaviors that are highly significant for agriculture and human health, including pollination^4-6, herbivory of food crops⁷, and transmission of disease^8,9. Identification of olfactory signals and their role in insect behavior is thus important for understanding both ecological processes and human food resources and well-being.

To date, the identification of volatiles that drive insect behavior has been difficult and often tedious. Current techniques include gas chromatography-coupled electroantennogram recording (GC-EAG), and gas chromatography-coupled single sensillum recordings (GC-SSR)^10-12. These techniques proved to be vital in the identification of bioactive compounds. We have developed a method that uses gas chromatography coupled to multi-channel electrophysiological recordings (termed 'GCMR') from neurons in the antennal lobe (AL; the insect's primary olfactory center)^13,14. This state-of-the-art technique allows us to probe how odor information is represented in the insect brain. Moreover, because neural responses to odors at this level of olfactory processing are highly sensitive owing to the degree of convergence of the antenna's receptor neurons into AL neurons, AL recordings will allow the detection of active constituents of natural odors efficiently and with high sensitivity. Here we describe GCMR and give an example of its use.

Several general steps are involved in the detection of bioactive volatiles and insect response. Volatiles first need to be collected from sources of interest (in this example we use flowers from the genus Mimulus (Phyrmaceae)) and characterized as needed using standard GC-MS techniques^14-16. Insects are prepared for study using minimal dissection, after which a recording electrode is inserted into the antennal lobe and multi-channel neural recording begins. Post-processing of the neural data then reveals which particular odorants cause significant neural responses by the insect nervous system.

Although the example we present here is specific to pollination studies, GCMR can be expanded to a wide range of study organisms and volatile sources. For instance, this method can be used in the identification of odorants attracting or repelling vector insects and crop pests. Moreover, GCMR can also be used to identify attractants for beneficial insects, such as pollinators. The technique may be expanded to non-insect subjects as well.

протокол

1. Летучие Follection

1. В этом примере мы используем летучих образцов M. lewisii цветы - родной альпийских Уайлдфлауэр в Калифорнии. Летучие вещества собираются с использованием динамических методов сорбции в соответствии с Riffell и соавт. ^14. Короче говоря, этот метод используется закрытая система захвата цикл, в котором цветы заключены в сумке тефлона. Использование инертного вакуумных насосов, воздух вокруг цветов всасывается через "ловушки", состоящей из пипетки Пастера заполнены Porapak Q матрица. Возвратного воздуха из насоса фильтруется активированным углем. После определенного периода времени, в нашем случае 24 ч, Porapak Q матрица элюируют неполярных растворителей, обычно гексана, чтобы собрать концентрированного экстракта. Затем экстракт хранится в -80 ° С до анализа. При необходимости образцы могут быть сосредоточено до анализа в потоке газообразного азота. Если образец уже хорошо характеризуется, запустить аликвоты черезгазовый хроматограф-масс-спектрометр (ГХ-МС) для определения летучих компонентов перед использованием образца.

2. Электрофизиологические подготовка

1. Отрежьте примерно 1 см от конца 1.000 мкл кончика пипетки. Поместите шмель (Bombus недотроги) в основание кончиком пипетки и осторожно надавите в направлении противоположном конце наконечника, пока только голова подвергается.
2. Растопите воск и стоматологического формировать ее по всему подвергается голову, убедившись, что воск придерживается на сложные глаза для безопасности и чтобы голова пчелы полностью неподвижным. Будьте уверены, чтобы не получить любой воск на антенны пчел.
3. Как только голова находится в безопасности, чтобы площадь, окна-как, разрез в голову капсулы с помощью лезвия бритвы выключателя или соответствующего размера скальпелем вырезать кутикулу. С помощью лезвия выключателя, начиная с спинной стороне головной капсулы, сразу за антенны и прилегающих к одной из сложных глаз. Вырезатьпрямой линии, от одного соединения глазу на глаз контралатеральной соединения. После резки по прямой линии до противоположного глаза соединения, начать делать надрез сверху до головной капсулы кривые и заканчивается вблизи его грудной клетки. На данный момент, начинают вырезать к противоположному концу головной капсулы. Наконец, когда линия была сокращена до противоположного конца, сократить линию обратно в исходное положение начального разреза. Важно, чтобы удалить кутикулу, что находится рядом с антенной, так как это будет препятствовать вставки электрода.
4. После того, кутикула обрезается, используйте пару щипцов для удаления кутикулы пчелы, которые затем должны подвергать мозг пчелы и, что более важно, усиков долях. Сразу начинают superfusing мозга с насекомыми солевым раствором, так что мозг не станет осушенный. После того, как мозг подвергается, обязательно используйте пару очень тонкий пинцет, чтобы удалить периневральным оболочки непосредственно над усиков долях. Будьте очень осторожны, чтобы непроколу мозга пчелы с помощью пинцета.

3. Газовой хроматографии с многоканальной записи

1. Пчела "Подготовка", - зафиксировано в трубке с его мозг подвергается - готов к электрофизиологические записи. Поместите пчел в зажим, закрепленный на магнитной основе, который находится на воздухе таблице.
2. Организовать мешок IV, регулятор потока, и трубы (заполненные солевым насекомых), так что солевой непрерывно superfuses мозга.
3. Использование микроманипулятор, insertareference электрод, сделанный из вольфрамовой проволоки, в глаза пчелы.
4. Использование отдельной микроманипулятора, вставьте многоканальных электродов, таких как тетрод проволочных спиралей или кремния многоканального электрода (Neuronexus Technologies), в усиков долей пчел. Этот электрод соединен с предварительным усилителем, таких как S-3 системы ТДТ в Z серии Z-шины bioamp процессор ТДТ системы. Выход из газа ChroДетектор matogram автора через экранированный кабель BNC может быть сопряжена с системой усилителей и сбора данных, что оба нервные и GC сигнала будет синхронизирована.
5. Подождите примерно 30-60 минут для записи нейронной стабилизироваться. После того, спонтанная активность и форму волны единиц в записи каналов стали последовательно, использовать запах шприц, чтобы стимулировать пчел и наблюдать за реакцией записи каналов на запах.
6. Запись внеклеточной шипы от нейронов авто-пороговой записи каналов 3,5 до 5 сигма сигнала на отдельных каналах записи. Руководство порога может потребоваться для некоторых каналов, чтобы избежать загрязнения от электрических помех. Потенциалы действия от нейронов появится как скачков напряжения в канале регистрации. Когда напряжение канала превышает пороговое значение, система буферов и экономит несколько миллисекунд до и после пересечения порога, тем самым забираюга моментальный снимок формы сигнала, или шип.
7. Сразу рядом с воздуха таблице GC. Перед инъекционных цветочный экстракт в GC, убедитесь, что метод температура рампы выполнения GC является правильным. В нашем примере мы используем метод температуры, начиная с 50 ° C в течение 4 мин с последующим повышением температуры со скоростью 10 ° C / мин. до 220 ° C, в какое время мы проводим GC для дополнительных 6 мин. Мы используем DB-5 GC колонки (J & W Scientific, Фолсом, Калифорния, США), с гелием в качестве газа-носителя. Без деления потока на входе, с температурой, установленной до 200 ° C. Детектором ионизации пламени температура устанавливается до 230 ° C.
8. Инъекция экстракта образца цветочные свободное пространство в нагретую впрыска ГК выпустить адсорбированные летучие вещества в колонке GC. Выходящий из колонки разделен между 1:01 пламенно-ионизационный детектор (FID) и пчела антенну с помощью стеклянной "Y" соединитель (J & W Scientific). Начать записьОрдинг от электрода, как вы вводите образца в ГХ.
9. После запуска GC закончил, пусть подготовки остальные от 5 до 15 мин. Тогда либо вводят другого образца в ГХ или стимулировать подготовку с помощью одного летучие соединения или смеси соединений. В этом последнем методе стимулирования подготовки, импульсы воздуха от постоянного потока воздуха направляется через стеклянный шприц, содержащий кусочек фильтровальной бумаги, на котором соединения будут сданы на хранение. Запах стимул импульсные с помощью электромагнитного активированного клапан, управляемый с помощью программного обеспечения.
10. Если единица активности внезапно останавливается или изменения, проверьте солевой капельного и пусть подготовки остальных в течение 15 мин. Если спонтанной активности не восстановить свой прежний уровень, то подготовка должна быть отброшена, а другая пчела, если доступно.
11. После эксперимента исправить мозга с 5%-ного формалина в течение 20 минут с зондом еще в ткани. Далее, акцизы мозгаи поместить его в 2% глутаральдегида в течение 4 часов, а затем делать серии градуированных обезвоживанию этанола и очистить мозг с метилсалицилат. На основании фиксации и очистки ткани, мест в AL, где электроды проколот ткани должны быть четко различимы конфокальной микроскопии.

4. Анализ данных

1. Анализ собранных данных после эксперимента, чтобы отделить и идентифицировать записанные нейронных единиц. Использование типичных программ (Offline сортировщик, MClust, и SClust) в отдельные сигналы, или "шипы", основанный на шипованные формы, такие как пик или долина амплитуды, полушириной пика, и т.д., или сокращенные меры (основные компоненты) ^{17 , 18} (рис. 2). Используйте только те кластеры шипы, которые разделены на три-мерном пространстве (PC1-PC3) и статистически отличаются друг от друга (многомерного дисперсионного анализа, р <0,05) (рис. 2) для дальнейшего анализа. Пожалуйста, обратитесь кЦитата # S 17-19 для полного описания тетрод записи и шип-сортировочный методологии.
2. Тайм-штамп шипов в каждом кластере, а также экспортировать эти данные для анализа с использованием MATLAB или Neuroexplorer (Nex технологий, Winston-Salem, NC) для создания растровых участков и скорострельность ответов (рис. 2, 3А).
3. Определить время удерживания летучих использованием одновременно записывать GC данных. Используйте время удерживания летучих веществ, определяется вершине пика на хроматограмме, чтобы изучить устройство ответы на эти моменты времени.
4. Для изучения индивидуальных ответов устройство через перспективе GC, BIN число шипов в 100 мс интервалах и изучить времени хода скорострельность ответы со ссылками на время удержания элюируя летучих веществ. Биннинга шипов в 100 мс интервалах обеспечивает достаточно подробно, или сигнал, примерно в то время, конечно нейронных ответ на элюируя одоранта с GC.
5. Для EXAпомоему населения ответы на различные летучие элюирующие, интегрировать скорострельность ответов отдельных подразделений за 3 окна выборки сек, 1,5 сек до, и после 1,5 сек, время удерживания летучих (рис. 3). Этот период времени является типичной длительности выделяющих летучие от GC. Мы покажем, скорострельность ответы единиц цветового кодирования них (красный высокий отклик скорострельность, синий является низкий ответ) и расположив их как деятельность матрица с каждой строки представляют ансамбль ответ на GC стоков (столбцы) ( рис. 3).

Результаты

В ГКХ методом с использованием M. lewisii цветочный аромат, мы вводим 3 мкл экстракта в ГХ. Общее количество летучих элюирования через GC, как правило, 60-70 летучих веществ. Аромат M. lewisii преимущественно состоит из монотерпеноиды, в том числе β-мирцен (ациклические) и α-пинен, ?...

Обсуждение

Насекомых обонятельные-опосредованных поведения ездить много различных процессов, в том числе воспроизводство, принимающих выбор площадки, и выявления соответствующих продовольственных ресурсов. Изучение этих процессов требует способности идентифицировать летучих вылетающих из и...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Название пункта	Компания	Номер в каталоге	Комментарии
Porapak типа Q 80-100 меш	Воды	WAT027060
Сумки Рейнольдс печи	Рейнольдс
GC	Agilent	7820A
GC колонки	J & W Scientific, Фолсом, Калифорния, США	DB-5 (30 м, 0,25 мм, 0,25 мкм)
Аналитический носителя гелия	Praxair	Его K	1 мл / мин
16-канальный кремния электрод	Тех Neuronexusologies	a4x4-3mm50-177
Изобразительное NiCr провода, 0,012 мм в диаметре)	Sandvik Kanthal HP Reid	PX000004	Для создания пользовательских тетроды и stereotrodes
Предварительный усилитель	Такер-Davis системы	PZ-2
Усилитель	Такер-Davis системы	RZ-2
Система сбора данных - OpenEx люкс	Такер-Davis системы
Интернет-всплеска сортировка программного обеспечения - SpikePac	Такер-Davis системы
Offline шипованные сортировка программного обеспечения - Mclust Спайк-сортировочный инструментов	Дэвид Redish Департамента неврологии университетаМиннесота	Бесплатно скачать на http://redishlab.neuroscience.umn.edu/MClust/MClust.html	MATLAB инструментов