Identificazione dei volatili olfattive utilizzando la gas cromatografia-Multi-unit Recordings (GCMR) nel lobo antennale Insetto

Riepilogo

Spunti olfattivi mediare molti differenti comportamenti in insetti, e sono spesso miscele complesse costituite da decine a centinaia di composti volatili. Mediante gascromatografia con registrazione multicanale nel lobo insetto antennale, si descrive un metodo per l'identificazione di composti bioattivi.

Abstract

Tutti gli organismi vivono in un mondo pieno di stimoli sensoriali che determinano la loro risposta comportamentale e fisiologica al loro ambiente. Olfatto è particolarmente importante negli insetti, che utilizzano i loro sistemi olfattivi di rispondere, e discriminare tra odori, stimoli complessi. Questi odori sollecitare comportamenti che mediano i processi come la riproduzione e la selezione dell'habitat ^1-3. Inoltre, il rilevamento chimico di mediare insetti comportamenti che sono di grande importanza per l'agricoltura e la salute umana, compresa l'impollinazione ^4-6, erbivori delle colture alimentari ^7, e la trasmissione di malattie ^8,9. Identificazione dei segnali olfattivi e il loro ruolo nel comportamento degli insetti è quindi importante per capire sia i processi ecologici e le risorse di cibo umano e il benessere.

Ad oggi, l'identificazione di sostanze volatili che guidano il comportamento degli insetti è stato difficile e spesso noioso. Le tecniche attuali sonogas cromatografia-coupled registrazione electroantennogram (GC-EAG), e gas cromatografia accoppiata singole registrazioni sensillum (GC-SSR) ^10-12. Queste tecniche rivelato fondamentale per l'identificazione di composti bioattivi. Abbiamo messo a punto un metodo che utilizza la gascromatografia accoppiata a multicanale registrazioni elettrofisiologiche (definito 'GCMR') dai neuroni nel lobo antennale (AL; principale centro olfattivo degli insetti) ^13,14. Questo stato-of-the-art tecnica permette di sondare come informazioni odore viene rappresentata nel cervello insetto. Inoltre, poiché le risposte neurali agli odori a questo livello di elaborazione olfattiva sono causa molto sensibili al grado di convergenza dei neuroni recettori dell'antenna in neuroni AL, AL registrazioni permetterà di costituenti attivi di odori naturali efficiente e con elevata sensibilità. Qui descriviamo GCMR e dare un esempio del suo utilizzo.

Diversi passaggi generali sono coinved nella rilevazione di sostanze volatili bioattivi e risposta insetti. Volatili necessario prima di essere raccolti da fonti di interesse (in questo esempio si usa fiori dal genere Mimulus (Phyrmaceae)) e caratterizzata, se necessario utilizzando le normali tecniche di GC-MS ^14-16. Insetti sono preparati per studio utilizzando dissezione minima, dopo di che un elettrodo di registrazione viene inserito nel lobo antennale e multi-canale neurale inizia. Post-processing dei dati neurali poi rivela che odori particolari causare notevoli risposte neurali del sistema nervoso degli insetti.

Anche se l'esempio che presentiamo qui è specifico per gli studi di impollinazione, GCMR può essere estesa ad una vasta gamma di organismi di studio e fonti volatili. Per esempio, questo metodo può essere utilizzato per l'identificazione di odoranti attrarre o respingere insetti vettori ei parassiti delle piante. Inoltre, GCMR può anche essere utilizzato per identificare attrattivi per gli insetti benefici, come Pollinators. La tecnica può essere estesa a soggetti non-insetti pure.

Protocollo

1. Follection volatile

1. In questo esempio, usiamo campioni volatili da M. fiori lewisii - un nativo alpino wildflower in California. Volatili vengono raccolti con metodi dinamici di assorbimento secondo Riffell et al. ^14. In breve, questo metodo impiega un sistema di condensazione ad anello chiuso in cui sono racchiusi i fiori in un sacchetto di Teflon. Utilizzando una pompa a vuoto inerte, l'aria intorno ai fiori viene aspirata attraverso una "trappola" composto da una pipetta Pasteur riempito con Porapak Q matrice. L'aria di ritorno dalla pompa viene filtrata dal carbone attivo. Dopo un periodo di tempo prescritto, nel nostro caso 24 h, la Porapak Q matrice viene eluito con un solvente non polare, tipicamente esano, per raccogliere l'estratto concentrato. L'estratto viene quindi memorizzato in -80 ° C fino all'analisi. Se necessario, i campioni possono essere concentrato prima dell'analisi sotto flusso di azoto. A meno che il campione è già ben caratterizzata, eseguire una aliquota di esso attraverso unagas cromatografo-spettrometro di massa (GC-MS) per identificare i componenti volatili prima di utilizzare il campione.

2. Preparazione elettrofisiologica

1. Tagliare circa 1 cm dall'estremità di una punta di pipetta 1000 microlitri. Mettere un calabrone (Bombus impatiens) nella base della punta della pipetta e spingere delicatamente verso l'estremità opposta della punta fino a che solo la testa è esposta.
2. Fondere la cera dentale e plasmarlo intorno alla testa esposta, facendo in modo che aderisca cera sul occhi composti per la sicurezza e per rendere la testa dell'ape completamente immobile. Assicurarsi di non avere la cera sul antenna delle api.
3. Una volta che la testa è sicuro, fare una, piazza finestra tipo, incisione nella capsula testa con una lama di rasoio automatico o la dimensione appropriata bisturi per tagliare la cuticola. Utilizzando la lama dell'interruttore, partire dal lato dorsale della capsula testa, immediatamente dietro l'antenna e adiacente a uno degli occhi composti. Tagliouna linea retta, composto da un occhio all'occhio composto controlaterale. Dopo il taglio di una linea retta per l'occhio composto contrario, cominciare a fare un'incisione sul dorso fino a quando le curve capsula testa e finisce vicino al suo torace. A questo punto, comincia a tagliare verso l'estremità opposta della capsula testa. Infine, una volta che la linea è stata tagliata all'estremità opposta, tagliare una linea indietro fino alla posizione di partenza della incisione iniziale. È importante rimuovere la cuticola che è adiacente all'antenna, poiché ciò impedirà l'inserimento dell'elettrodo.
4. Una volta che la cuticola è tagliato, usare un paio di pinze per rimuovere la cuticola delle api, che dovrebbe quindi esporre il cervello delle api e, soprattutto, i lobi antennali. Iniziare immediatamente superfusing cervello con soluzione salina insetto, in modo che il cervello non diventa essiccato. Dopo il cervello è esposto, accuratamente usare un paio di pinze molto fini per rimuovere la guaina perineurale immediatamente sopra i lobi antennali. Fare molta attenzione a nonperforare il cervello dell'ape con le pinze.

3. Gascromatografia con Multi-channel di registrazione

1. La "preparazione" ape - fissata in un tubo con il suo cervello esposto - è ora pronto per la registrazione elettrofisiologica. Posizionare l'ape in un morsetto, fissati ad una base magnetica che si trova su un tavolo aria.
2. Organizzare una sacca IV, regolatore di flusso, e tubi (riempito con soluzione fisiologica insetto) in modo che la soluzione salina superfuses continuamente il cervello.
3. Utilizzando un micromanipolatore, elettrodo insertareference, fatto di filo di tungsteno, nell'occhio dell'ape.
4. Utilizzando un micromanipolatore separato, inserire l'elettrodo multicanale, ad esempio un tetrodo filo a spirale, o silicio multicanale elettrodo (NeuroNexus Technologies), nei lobi antennali delle api. Questo elettrodo è collegato ad un pre-amplificatore, come il sistema TDT S-3 serie Z alla Z-bus processore bioamp del sistema TDT. Uscita dal Chro GasRilevatore di matogram tramite un cavo schermato BNC può essere interfacciato con il sistema di acquisizione dati amplificatore e tale che sia il segnale neurale e GC è sincronizzato.
5. Attendere circa 30-60 minuti per le registrazioni neurali per stabilizzare. Una volta che l'attività spontanea e la forma d'onda delle quote dei canali di registrazione sono diventati coerente, utilizzare una siringa odore di stimolare l'ape ed osservare la risposta dei canali di registrazione per l'odore.
6. Registrare picchi extracellulari di neuroni da auto-sogliatura i canali di registrazione da 3,5-5 sigma del segnale sui canali di registrazione individuali. Soglia manuale può essere richiesto per alcuni canali per evitare la contaminazione da disturbi elettrici. I potenziali d'azione di neuroni appaiono come picchi di tensione nel canale di registrazione. Quando la tensione del canale supera la soglia, il sistema di buffer e salva i pochi millisecondi prima e dopo l'attraversamento della soglia, così takinga istantanea della forma d'onda, o di picco.
7. Immediatamente accanto al tavolo aria è il GC. Prima di iniettare l'estratto floreale nel GC, assicurarsi che il metodo per la rampa di temperatura della corsa GC è corretto. Nel nostro esempio, si utilizza un metodo di temperatura iniziale a 50 ° C per 4 min seguita da un aumento di temperatura ad una velocità di 10 ° C / min. a 220 ° C, momento in cui teniamo la GC per altri 6 min. Usiamo una colonna DB-5 GC (J & W Scientific, Folsom, CA, USA), con elio come gas di trasporto. L'ingresso è splitless, con una temperatura impostata a 200 ° C. Il rilevatore a ionizzazione di fiamma temperatura è impostato a 230 ° C.
8. Iniettare il campione estratto lo spazio di testa floreale nella porta di iniezione riscaldata del GC per rilasciare le sostanze volatili adsorbiti nella colonna GC. L'effluente dalla colonna è divisa 1:1 tra il Rivelatore a ionizzazione di fiamma (FID) e l'antenna ape con una lente di "Y" (J & W Scientific). Inizia recording dall'elettrodo durante l'iniezione di un campione nel GC.
9. Al termine della corsa GC ha finito, lasciate riposare la preparazione per 5 a 15 minuti. Allora o somministrazione di un altro campione nel GC o stimolare la preparazione con singoli composti volatili o miscele di composti. In questo secondo metodo di stimolare la preparazione, impulsi di aria da un flusso d'aria costante vengono deviati attraverso una siringa di vetro contenente un pezzo di carta da filtro in cui i composti sono stati depositati. Lo stimolo odore era impulsi mediante un solenoide attivato valvola controllata dal software.
10. Se l'attività unità si ferma improvvisamente o modifiche, consultare il fleboclisi e lasciate riposare la preparazione per 15 minuti. Se l'attività spontanea non ritrovare il suo livello precedente il preparato deve essere eliminato e un'altra ape utilizzata, se disponibile.
11. Dopo l'esperimento, fissare il cervello con formalina al 5% per 20 minuti con la sonda ancora nel tessuto. Avanti, accisa il cervelloe metterlo in glutaraldeide al 2% per 4 ore, e successivamente fare una serie graduata di etanolo disidratazione e cancellare il cervello con salicilato di metile. In base alla fissazione e di compensazione del tessuto, le posizioni nel AL cui gli elettrodi perforato il tessuto deve essere chiaramente distinguibile mediante microscopia confocale.

4. Analisi dei dati

1. Analizzare i dati raccolti dopo l'esperimento di separare e identificare le unità registrate neurali. Utilizzare programmi software tipici (Sorter Offline, MClust e SClust) per forme d'onda separate, o "picchi", basata su forme a spillo, come picco o valle ampiezza picco a metà larghezza, ecc, o misure ridotte (componenti principali) ^{17 , 18} (Figura 2). Utilizzare solo quei cluster di picchi che separati in uno spazio tridimensionale (PC1-PC3) e sono statisticamente diversi tra loro (ANOVA multivariata; p <0,05) (Figura 2) per ulteriori analisi. Si prega di fare riferimento alcitazione # s 17-19 per la descrizione completa di registrazione tetrodo e spike-ordinamento metodologie.
2. Time-stamp picchi di ciascun cluster, ed esportare questi dati per l'analisi utilizzando MATLAB o Neuroexplorer (Nex Technologies, Winston-Salem, NC) per creare grafici raster e le risposte dei tassi di cottura (figure 2, 3A).
3. Identificare i tempi di ritenzione dei volatili utilizzando i dati simultaneamente registrati GC. Utilizzare i tempi di ritenzione dei volatili, determinate dal vertice del picco del cromatogramma, per esaminare i unitari a quei punti temporali.
4. Per esaminare le risposte per singola unità attraverso la corsa GC, bin il numero di punte in 100 msec ed esaminare il time-course di sparare risposte a tasso con riferimento al tempo di ritenzione di eluizione volatili. Il binning dei picchi in 100 msec fornisce dettagli sufficienti, o segnale, in merito ai tempi corso della risposta neuronale a un odorizzante eluizione dal GC.
5. Per exaestrarre le risposte della popolazione al volatiles eluizione differenti, introdurre le risposte di frequenza di attivazione di singole unità su una finestra di campionamento 3 sec, 1.5 sec prima e dopo 1,5 secondi, il tempo di ritenzione del volatile (Figura 3). Questo periodo di tempo è tipico della durata di un eluizione volatile dalla GC. Mostriamo sparare risposte a tasso delle unità di codifica a colori delle loro (il rosso è un alto tasso di risposta fuoco, blu, è una risposta bassa) e l'organizzazione come una matrice attività con ogni riga che rappresenta la risposta insieme al effluente GC (colonne) ( figura 3).

Risultati

Nel saggio GCMR utilizzando il M. lewisii profumo floreale, abbiamo iniettare 3 ml di estratto nel GC. Il numero totale di sostanze volatili di eluizione attraverso il GC è in genere 60-70 volatili. Il profumo di M. lewisii è prevalentemente composta monoterpenoids, compresi β-mircene (aciclico) e α-pinene, con il resto del profumo composto di sei atomi di carbonio volatili, come 2-esanolo e sesquiterpenoidi che compongono <1% di spazio di testa.

GC...

Discussione

Insetti olfatto-mediate comportamenti guidare molti processi diversi, tra cui la riproduzione, host-selezione del sito, e l'individuazione di risorse alimentari adeguate. Lo studio di questi processi richiede la capacità di identificare i composti volatili emessi dalla sorgente, così come la capacità di identificare i composti che vengono mediano i comportamenti. A complicare le cose è che gli odori sono costituiti da decine a centinaia di singoli composti che insieme creano un profumo unico che viene percepito ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome della voce	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Porapak Tipo Q 80-100 maglia	Waters	WAT027060
Reynolds Forno Borse	Reynolds
GC	Agilent	7820A
GC colonna	J & W Scientific, Folsom, CA, USA	DB-5 (30 m, 0,25 mm, 0,25 micron)
Analitica elio gas di trasporto	Praxair	HE K	1 cc / min
16-canale di silicio elettrodo	NeuroNexus Techndologie	a4x4-3mm50-177
Filo NiCr Bene, 0,012 mm di diametro)	Sandvik Kanthal HP Reid	PX000004	Per fare tetrodi personalizzati e stereotrodes
Pre-amplificatore	Tucker-Davis sistema	PZ-2
Amplificatore	Tucker-Davis sistema	RZ-2
Sistema di acquisizione dati - OpenEx Suite	Tucker-Davis sistema
Online spike-ordinamento software - SpikePac	Tucker-Davis sistema
Offline spike-ordinamento software - Mclust Spike-ordinamento toolbox	David Redish, Dipartimento di Neuroscienze, Universitàdel Minnesota	Download gratuito a http://redishlab.neuroscience.umn.edu/MClust/MClust.html	Toolbox MATLAB