곤충 Antennal 엽에 가스 크로마토 그래피 - 멀티 유닛 레코딩 (GCMR)를 사용하여 강한 휘발성 물질의 식별

요약

후각 신호는 곤충의 여러 가지 행동을 중재하고, 휘발성 화합물의 수백 수십 구성 종종 복합 혼합물이다. 곤충 antennal 엽의 멀티 채널 녹음과 가스 크로마토 그래피를 사용하여, 우리는 bioactive 화합물의 식별하는 방법을 설명합니다.

초록

모든 생물은 환경에 자신의 행동 및 생리적 반응을 결정하는 감각 자극으로 가득 찬 세상을 살고 있습니다. 후각은에 응답하고, 사이, 복잡한 냄새 자극을 차별하기 위해 후각 시스템을 사용 곤충에 특히 중요합니다. 이 냄새는 재생산 및 서식지 선택 ^1-3로 프로세스를 중재하는 행동을 이끌어내는. 또한, 수분 ^4-6 식품 작물 ⁷ herbivory, 질병 ^8,9의 전송을 포함하여 농업과 인간의 건강을 위해 매우 중요 곤충의 mediates 동작에 의한 화학 감지. 후각 신호와 곤충 행동에서의 역할 확인은 생태 학적 프로세스와 인간의 음식 자원과 웰빙을 모두 이해하는 따라서 중요합니다.

현재까지, 곤충의 행동을 유도 휘발성 물질의 식별이 어렵고 종종 지루한했다. 현재 기술은 다음과 같습니다가스 크로마토 그래피 결합 electroantennogram 기록 (GC-EAG) 및 가스 단일 sensillum 레코딩 (GC-SSR) ^10-12를 크로마토 그래피 - 커플 링. 이 기술은 bioactive 화합물의 식별에 중요한 것으로 판명. ^13,14, 우리는 antennal 엽에있는 뉴런 (곤충의 기본 후각 센터 AL)에서 멀티 채널 electrophysiological 레코딩 ( 'GCMR'이라고한다)에 커플 링 된 가스 크로마토 그래피를 사용하는 방법을 개발했습니다. 이 최신 기술은 우리가 냄새 정보가 곤충 뇌에 표시하는 방법을 조사 할 수 있습니다. 후각 처리의 수준 냄새에 신경 응답이 AL의 뉴런에 안테나의 수용체 뉴런의 수렴의 정도에 매우 민감 인하여 때문에 또한, AL 녹음은 자연 냄새 효율적이고 고감도로의 활성 성분의 검출을 할 수 있습니다. 여기 GCMR을 설명하고 사용 예를 제공합니다.

몇몇 일반적인 단계는 invol 아르bioactive 휘발성 물질과 곤충 응답의 검출에 ved. 휘발성 물질 먼저 관심 소스에서 수집 (이 예에서 우리는 속 Mimulus (Phyrmaceae)에서 꽃을 사용) 및 표준 GC-MS 기술에게 ^14-16를 사용하여 필요에 따라 특징해야합니다. 곤충은 기록 전극이 신경 녹음이 시작 antennal 엽 및 다중 채널에 삽입 된 후, 최소한의 절개를 사용하여 학습을위한 준비가되어 있습니다. 신경 데이터의 후 처리는 특정 odorants는 곤충 신경계에서 중요한 신경 반응의 원인이되는 드러내고있다.

우리가 여기에 제시 예는 수분 연구에 특정한이지만, GCMR는 연구 생물 및 휘발성 소스의 광범위한 확장 할 수 있습니다. 예를 들어,이 방법은 odorants 벡터 곤충, 농작물 해충을 끌거나 repelling의 식별에 사용할 수 있습니다. 또한, GCMR는 또한 PO 등의 유익 곤충에 대한 attractants를 식별하는 데 사용할 수 있습니다llinators. 기술은뿐만 아니라 비 곤충 분야로 확대 할 수 있습니다.

프로토콜

1. 휘발성 Follection

1. 이 예제에서, 우리는 M.에서 휘발성 샘플을 사용하여 lewisii 꽃 - 캘리포니아에 고산 야생화의 기본. 휘발성 물질이 Riffell 외에 따라 동적 흡착 방법을 사용하여 수집하고 있습니다. ^14. 간단히,이 방법은 꽃이 테플론 백에 동봉되는 폐 루프 트래핑 시스템을 사용합니다. 불활성 진공 펌프 사용하여 꽃 주변의 공기는 Porapak Q 행렬로 가득 파스퇴르 피펫으로 구성 "덫"을 통해 형편입니다. 펌프의 반환 공기는 활성탄에 의해 필터링됩니다. 소정의 기간 후에, 우리의 경우 24 H에, Porapak Q 행렬은 집중 추출물를 수집하기 위해, 비 극지 용매, 일반적으로 헥산으로 용출되어 있습니다. 추출물 그런 다음 -80 ° C에서 분석 될 때까지 저장됩니다. 필요한 경우, 샘플은 질소 가스의 흐름에 따라 사전 분석에 집중 할 수 있습니다. 샘플은 이미 잘 - 특징 않는 한,를 통해 그것을 나누어지는을 실행기체 크로마토 그래프 - 질량 분석기 (GC-MS)는 샘플을 사용하기 전에 휘발성 구성 요소를 식별합니다.

2. Electrophysiological 준비

1. 1000 μl 피펫 팁의 끝에서 약 1cm를 자른다. 피펫 팁의 기본에 범블비 (Bombus impatiens)를 놓고는 머리가 노출 될 때까지 부드럽게 끝의 반대쪽으로 밀어.
2. 치과 왁스를 녹여 및 보안에 대한 화합물 눈 위에와 왁스 준수는 꿀벌의 머리가 완전히 고정되어 만들 수 있는지 확인하기, 노출 된 머리 주위를 뜨는거야. 벌의 안테나에 어떤 왁스를하지 않도록주의하십시오.
3. 머리가 안전하면, 면도기 블레이드 - 차단기 나 큐티클을 잘라 할 메스 적절한 크기를 사용하여 헤드 캡슐로 광장, 윈도우 같은 절개를합니다. 블레이드 - 차단기를 사용하여 즉시 화합물 눈에 안테나와 인접 하나 뒤에, 머리 캡슐의 등 측면에서 시작합니다. 절단한 화합물 눈에서 contralateral 화합물 눈에 직선. 반대 화합물 눈에 직선을 절단 한 후, 그 가슴 근처의 헤드 캡슐 곡선과 끝날 때까지 dorsally 절개을 시작합니다. 이 시점에서, 머리 캡슐의 반대 끝 부분 절단하기 시작합니다. 마지막으로, 한 번 줄이 반대쪽으로 절단되었습니다 초기 절개의 시작 위치로 다시 줄을 잘라. 이 전극의 삽입을 방해하므로 그것은 안테나에 인접 해 있습니다 큐티클을 제거하는 것이 중요합니다.
4. 큐티클을 잘라되면 다음 벌의 뇌를 노출하고, 더 중요한 것은 antennal 엽해야 벌의 큐티클을 제거 포셉 한 쌍의를 사용합니다. 바로 뇌 dessicated이되지 않도록, 곤충 식염수 뇌를 superfusing 시작합니다. 뇌가 노출되면 조심스럽게 즉시 antennal 엽 위의 perineural 피복을 제거하는 아주 좋은 포셉 한 쌍의를 사용합니다. 정말 조심해야하지에포셉과 구멍 벌의 뇌를.

3. 멀티 채널 녹음과 가스 크로마토 그래피

1. 벌 "준비"- 뇌의 노출이있는 튜브에서 수정이 - 지금 electrophysiological 레코딩을위한 준비가되었습니다. 공기 테이블에 자리 잡고 있습니다 자기베이스에 고정 클램프의 벌을 배치합니다.
2. IV 가방, 흐름 컨트롤러, 그리고 생리가 계속 뇌를 superfuses 있도록 튜브를 (곤충 생리가 가득) 준비합니다.
3. 벌의 눈에, 텅스텐 와이어로 만든 micromanipulator, insertareference 전극을 사용합니다.
4. 별도의 micromanipulator를 사용, 이러한 코일 와이어 tetrode, 또는 실리콘 멀티 채널 전극 (Neuronexus 기술)로, 멀티 채널 전극을 삽입 벌의 antennal 엽에. 이 전극 등의 가열 치사 시스템의 Z-버스 bioamp 프로세서에 가열 치사 시스템의 S-3 Z 시리즈와 같은 사전 증폭기에 연결되어 있습니다. 가스 Chro의 출력차폐 된 BNC 케이블을 통해 matogram의 감지기가 모두 신경 및 GC 신호가 동기화되는 등의 증폭기 및 데이터 수집 시스템과 인터페이스 할 수 있습니다.
5. 안정화 할 수있는 신경 레코딩을위한 약 30~60분 기다립니다. 자연 활동 및 녹화 채널에 단위의 파형 모양이 일관성이되었습니다되면, 벌을 자극하고 냄새에 기록 채널의 반응을 관찰하는 악취 주사기를 사용합니다.
6. 에 의해 뉴런의 세포 스파이크를 기록 자동 임계 값 각 기록 채널에서 신호의 3.5-5 시그마하여 녹화 채널을. 수동 임계 값은 전기 노이즈의 오염을 방지하기 위해 일부 채널 필요할 수 있습니다. 뉴런의 활동 전위가 기록 채널에 전압 스파이크로 표시됩니다. 채널의 전압이 임계 값을 초과하면 시스템은이를 실려, 임계의 교차로 전후 몇 밀리 초 버퍼 및 저장GA는 파형의 스냅 샷, 또는 스파이크.
7. 바로이 공기 테이블 옆에있는 GC입니다. GC에 꽃 추출물을 주입하기 전에 GC 실행의 온도 램프를위한 방법이 올바른지 확인하십시오. 우리 예제에서, 우리는 10 ° C / 분의 속도로 온도의 증가에 이어 4 분 50에서 시작 온도 방법 ° C를 사용합니다. 220 ° 우리가 추가 6 분의 GC을 보유하고있는 시간에 C,. 우리는 캐리어 가스로 헬륨이있는 DB-5 GC 컬럼 (J & W 과학, Folsom, CA, USA)를 사용합니다. 입구는 200 ° C.로 설정 온도, splitless입니다 불꽃 이온화 검출기 온도는 230 ° C.로 설정되어 있습니다
8. GC 칼럼으로 adsorbed 휘발성 물질을 해제 할 수있는 GC의 온수 주입 포트에 꽃 천정 공간의 추출물 샘플을 주입. 열에서 유출 물은 불꽃 이온화 검출기 (FID) 및 유리 "Y"커넥터 (J & W 과학)를 사용하여 벌 안테나 사이에 1:1 분할되어 있습니다. REC를 시작당신은 GC에 샘플을 투입으로 전극에서 ording.
9. GC 실행 완료 후, 5 15 분을 위해 준비 나머지를 보자. 그런 다음 GC에 다른 샘플을 주입 또는 단일 휘발성 화합물 또는 화합물의 혼합물을 사용하여 준비를 자극한다. 준비를 자극이 후자의 방법에서는 일정한 공기 흐름에서 공기의 펄스는 화합물이 증착 된되는 필터 종이를 포함하는 유리 주사기를 통해 우회합니다. 냄새 자극은 소프트웨어에 의해 제어 솔레노이드가 활성화 된 밸브에 의해 펄스되었습니다.
10. 단위 활동이 갑자기 중단하거나 변경할 경우, 생리 똑을 확인하고 15 분 동안 준비 나머지를 보자. 자연 활동이 이전 수준을 회복하지 않으면 사용 가능한 경우 다음 준비는 폐기하고 다른 꿀벌이 사용되어야합니다.
11. 실험 후, 여전히 조직의 프로브와 20 분에 포르말린 5퍼센트으로 뇌를 해결할 수 있습니다. 다음, 소비세 뇌그리고 4 시간에 2 % 글 루타 알데히드에 배치하고, 이후 등급 에탄올 탈수 시리즈를 수행하고 살리실산 메틸과 뇌를 취소합니다. 조직, 전극의 조직은 공 촛점 현미경에 의해 명확하게 알아볼 수 있어야합니다 구멍을 AL에있는 위치의 고정과 개간을 기반으로합니다.

4. 데이터 분석

1. 분석은 기록 된 신경 단위를 분리하고 식별 할 수있는 실험 후 데이터를 수집했습니다. 이러한 피크 또는 계곡 진폭, 최대 반폭 등의 스파이크 모양, 또는 감소 조치에 따라 별도의 파형, 또는 "스파이크"(주요 구성 요소) ¹⁷ 일반적인 소프트웨어 프로그램을 (오프라인 정렬 기, MClust 및 SClust)를 사용 ¹⁸ (그림 2). 3 차원 공간에서 분리 (PC1-PC3)과 서로의 통계적 다른 것을 스파이크의 만 클러스터를 사용합니다 (변수 ANOVA, P <0.05) (그림 2) 추가 분석을 위해. 를 참조하십시오tetrode 기록과 스파이크 - 정렬 방법에 대한 자세한 설명을위한 인용 # S 17-19.
2. 시간 스탬프 각 클러스터에 스파이크하고, 래스터 플롯과 발사 속도 응답 (도 2, 3A)를 만들 MATLAB 또는 Neuroexplorer을 (Nex 기술, 윈스턴 세일럼, NC)를 사용하여 분석을 위해 이러한 데이터를 내보낼 수도 있습니다.
3. 동시에 기록 GC 데이터를 사용 휘발성 물질의 유지 시간을 확인합니다. 그 시간 지점에서 단위 반응을 검사 할 크로마토 그램의 피크의 꼭대기에 의해 결정 휘발성 물질의 보유 시간을 사용합니다.
4. GC 실행을 통해 각 단위 반응을 확인하려면, 100 밀리 초 간격으로 스파이크의 개수 및 bin 및 휘발성 물질을 용출의 보존 기간을 참조하여 속도 응답을 해고의 시간 과정을 검토합니다. 100 밀리 초 간격의 스파이크의 binning는 GC에서 용출 odorant에 neuronal 응답의 시간 코스에 대해, 충분히 상세하게, 또는 신호를 제공합니다.
5. EXA에다른 용출의 휘발성 물질에 인구 응답을 채굴, 전에 3 초 샘플링 창을 통해 1.5 초를 개별 단위의 발사 속도 응답을 통합하고, 1.5 초 후의 보존 기간 휘발성 (그림 3). 이 기간은 GC에서 휘발성 용출 기간의 전형적인 있습니다. 및 (열) GC 유출에 앙상블 응답을 나타내는 각 행과 활동 매트릭스로를 준비하고 (; 우리는이 색상 코딩을 (파란색은 낮은 응답입니다 빨간색이 높은 발사 속도 응답이다) 단위의 속도 응답을 발사 보여 그림 3).

결과

M.를 사용하여 GCMR 분석에서 lewisii 꽃 향기가, 우리는 GC에 추출물의 3 μl를 삽입. GC를 통해 용출 휘발성 물질의 총 수는 일반적으로 60-70 휘발성 물질입니다. M.의 향기 lewisii는 주로 여섯 탄소 등 2 헥산 올과 같은 휘발성 물질, 그리고 천정 공간의 <1 %를 구성하는 sesquiterpenoids로 구성된 향기의 나머지 부분과 함께, β-myrcene (acyclic)와 α-피넨 포함 monoterpenoids?...

토론

곤충 후각로 인한 행동이 복제, 호스트 사이트 선택, 적절한 음식 자원의 식별 등을 포함하여 다양한 프로세스를 운전합니다. 이러한 프로세스의 연구는 소스뿐만 아니라 행동을 중재 아르 이러한 화합물을 식별 할 수있는 능력에서 방출 된 휘발성 물질을 식별 할 수있는 능력이 필요합니다. 문제를 복잡하게하는 것은 냄새가 함께 각각의 성분 ^6,7,13,19,20 다르게 인식되고 독특한 향을 만?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
항목의 이름	회사	카탈로그 번호	코멘트
Porapak 타입 Q 80-100 메쉬	워터스	WAT027060
레이놀즈 오븐 가방	레이놀즈
GC	애질런트	7820A
GC 컬럼	J & W 과학, Folsom, CA, USA	DB-5 (30m, 0.25 mm, 0.25 μm)
분석 헬륨 캐리어 가스	Praxair	HE K	한 참조 / 분
16 채널 실리콘 전극	Neuronexus Technologies	a4x4-3mm50-177
정밀 와이어 NiCr, 0.012 mm 직경)	Sandvik Kanthal HP 리드	PX000004	사용자 정의 tetrodes 및 stereotrodes을 만들기위한
사전 증폭기	터커 - 데이비스 시스템	PZ-2
증폭기	터커 - 데이비스 시스템	RZ-2
데이터 수집 시스템 - OpenEx 스위트	터커 - 데이비스 시스템
온라인 스파이크 - 정렬 소프트웨어 - SpikePac	터커 - 데이비스 시스템
오프라인 스파이크 - 정렬 소프트웨어 - Mclust 스파이크 - 정렬 도구 상자	데이비드 Redish, 신경 과학, 대학학과미네소타	에서 무료로 다운로드 http://redishlab.neuroscience.umn.edu/MClust/MClust.html	MATLAB 도구 상자