JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Olfaktör ipuçları böcekler birçok farklı davranışlar arabuluculuk, bileşikler ve uçucu yüzlerce onlarca oluşan genellikle kompleks karışımlarıdır. Böcek anten lob çok kanallı bir kayıt ile gaz kromatografisi kullanarak, biyolojik olarak aktif bileşiklerin belirlenmesi için bir yöntem açıklanmaktadır.

Özet

Tüm organizmalar çevreleriyle kendi davranışsal ve fizyolojik yanıtı belirlemek uyarıcılardır dolu bir dünya yaşamaktadır. Koklama yanıt, ve aralarında, karmaşık koku uyaranlara ayrımcılık onların koku sistemleri kullanmak böcekler, özellikle önemlidir. Bu kokular gibi üreme ve yaşam alanı seçimi 1-3 gibi süreçlerin aracılık davranışları ortaya çıkarmak. Ayrıca, tozlanma 4-6, gıda bitkileri 7 otyeme, ve hastalık 8,9 iletim dahil olmak üzere, tarım ve insan sağlığı açısından son derece önemli olan böcekler aracılık davranışları ile kimyasal algılama. Koku sinyalleri ve böcek davranışları rollerinin tanımlanması ekolojik süreçleri ve insan gıda kaynakları ve refahı hem de anlamak için bu nedenle önemlidir.

Bugüne kadar, böcek davranış sürücü Uçucu maddelerin tanımlanması zor ve yorucu sık sık olmuştur. Güncel tekniklergaz kromatografisi-çiftli electroantennogram kayıt (GC-EAG), ve gaz tek sensillum kayıtları (GC-SSR) 10-12 kromatografisi-birleştiğinde. Bu teknikler, biyoaktif bileşiklerin saptanmasında önemli olduğu kanıtlanmıştır. 13,14; Biz anten lobdaki nöronların (böcek birincil koku merkezi AL) gelen çok kanallı elektrofizyolojik kayıtlar ('GCMR' olarak adlandırılır) bağlanmıştır gaz kromatografi kullanan bir yöntem geliştirdik. Bu state-of-the-art tekniği bize koku bilgilerin böcek beyinde nasıl temsil edildiğini soruşturma için izin verir. Olfaktör işleme bu düzeyde kokulara sinir tepkiler AL nöronlarca anten reseptör nöronları yakınsama derecesi duyarlı nedeniyle çünkü Ayrıca, AL kayıtları doğal kokuları verimli ve yüksek hassasiyet ile aktif bileşenlerin tespiti sağlayacaktır. Burada GCMR açıklamak ve onun kullanımıyla ilgili bir örnek vermek.

Birkaç genel adımlar invol vardırBiyolojik olarak aktif böcek ve uçucular tepki tespit fraksiyonel. Uçucu ilk faiz kaynaklardan toplanan (bu örnekte biz cinsinin Mimulus (Phyrmaceae) çiçek kullanın) ve standart GC-MS teknikleri 14-16 kullanılarak gerektiğinde karakterize gerekir. Böcekler bir kayıt elektrot sinir kayıt başlar anten lob ve multi-kanal içine yerleştirilir, bunun ardından, en az diseksiyon kullanılarak çalışma için hazırlanmıştır. Nöral verilerin post-processing ardından özellikle koku böcek sinir sistemi tarafından ciddi nöral yanıtların neden olduğu görülmektedir.

Burada mevcut örnek, tozlaşma çalışmalar için belirli olsa da, GCMR çalışma organizmalar ve uçucu kaynaklardan geniş bir şekilde genişletilebilir. Örneğin, bu yöntem, koku maddesi vektör böcek ve bitki haşere kovucu çekme ya da tanımlanmasında kullanılabilir. Ayrıca, aynı zamanda, GCMR po olarak yararlı böceklere için cezbedici belirlemek için kullanılabilirllinators. Tekniği yanı olmayan böcek konulara genişletilebilir.

Protokol

1. Uçucu Follection

  1. Bu örnekte, M. uçucu numuneleri kullanmak lewisii çiçek - California'ya bir dağ kır çiçeği yerli. Uçucu Riffell ve arkadaşlarına göre dinamik emme yöntemler kullanılarak elde edilmektedir. 14. Kısaca, bu yöntem çiçekler teflon torba içine alınır bir kapalı döngü yakalama sistemi kullanır. Inert bir vakum pompası kullanılarak, çiçekler etrafında hava Porapak Q matris ile dolu bir Pasteur pipeti oluşan bir "tuzak" aracılığıyla emilir. Pompadan gelen dönüş hava aktifleştirilmiş odun kömürü ile filtre edilir. Önceden belirlenmiş bir süre sonra, olgu 24 saat içinde, Porapak Q matris konsantre ekstreye toplamak için, bir polar olmayan bir çözücü, tipik olarak heksan ile elüt edilmiştir. Özüt daha sonra -80 ° C'de analize kadar saklanır. Eğer gerekirse, numuneler azot gazı akışı altında analiz öncesi konsantre edilebilir. Örnek zaten iyi karakterize edilmediği sürece, bir aracılığıyla bir kısım çalıştırınGaz kromatografisi-kütle spektrometresi (GC-MS) Örnek kullanmadan önce, uçucu bileşenleri tanımlamak için.

2. Elektrofizyolojik Hazırlık

  1. 1.000 ul pipet sonundan itibaren yaklaşık 1 cm kesin. Pipet tabanına bir bombus arısı (Bombus impatiens) yerleştirin ve sadece baş ortaya çıkıncaya kadar hafifçe ucunun tersi sonuna doğru itin.
  2. Dişçilik mumları eritin ve güvenlik için bileşik gözleri üzerine ve balmumu yapışır arının kafasını tamamen hareketsiz hale getirmek için emin, maruz başının etrafında kalıp. Arı anteni üzerine herhangi bir balmumu elde etmek için değil emin olun.
  3. Kafası güvenli sonra, bir jilet-kesici veya manikür kesmek için neşter uygun büyüklükte kullanarak baş kapsülü içine bir kare, pencere gibi kesi yapmak. Bıçak kesici kullanarak, hemen bileşik gözler için anten ve bitişik birinin arkasında, başının kapsül sırt tarafında başlar. Kesmekbir bileşik gözü, kontralateral bileşik göz için düz bir çizgi. Tersi bileşik göz için düz bir çizgi kestikten sonra, onun göğüs yakın baş kapsülü eğrileri ve bitene kadar dorsal bir kesi yaparak başlar. Bu noktada, baş kapsül karşı ucuna doğru kesme başlar. Son olarak, bir kez bir çizgi ucunu kesmek olmuştur, ilk kesi başlangıç ​​pozisyonuna geri hattı kesti. Bu, elektrot ekleme zarar vereceği gibi, anten bitişik kütikül kaldırmak için önemlidir.
  4. Manikür kesilir sonra, o arı beyni açığa ve daha da önemlisi, anten lobları olmalıdır arı manikür, çıkarmak için forseps bir çift kullanın. Hemen beyin kurutulmuş haline gelmez, böylece böcek tuzlu su ile beyin superfusing başlar. Beynin maruz sonra, dikkatlice hemen anten lobları Yukarıdaki perinöral kılıfı kaldırmak için çok ince forseps bir çift kullanın. Çok dikkatli olun değilforseps ile ponksiyon arı beyni.

3. Çok kanallı kayıt ile Gaz Kromatografi

  1. Arı "hazırlık" - onun beyin maruz bir tüp içinde sabit - Şimdi elektrofizyolojik kayıt için hazırdır. Bir hava tabloda bulunan bir manyetik taban sabitlenmiş bir kelepçe içinde arı, yerleştirin.
  2. IV torba, akış kontrol ve salin sürekli beyin superfuses böylece tüp (böcek tuzlu su ile doldurulur) düzenleyin.
  3. Arı gözüne, tungsten telden yapılmış mikromanipülatör, insertareference elektrot, kullanma.
  4. Ayrı bir mikromanipülatör kullanarak, bu tür bir sarmal tetrode tel, silikon ya da çok-kanallı elektrodu (NeuroNexus Technologies) gibi, çok-kanallı elektrot eklemek arı anten lobları içine. Bu, elektrot bu tür TDT sistemin Z-veriyolu bioamp işlemci TDT sistemin S-3 Z serisi gibi bir ön-yükselticiye bağlanmıştır. Gaz Chro çıktısıkorumalı bir BNC kablo ile matogram adlı dedektör hem nöral ve GC sinyali senkronize böyle amplifikatör ve veri toplama sistemi ile arabirim olabilir.
  5. Stabilize nöral kayıtları için yaklaşık 30-60 dakika bekleyin. Spontan aktivite ve kayıt kanallardaki birim dalga şekli tutarlı hale gelince, arı uyarmak ve koku kayıt kanallarının yanıtı gözlemlemek için bir koku şırınga kullanın.
  6. Tarafından nöronların ekstrasellüler kramponları kaydedin otomatik eşikleme ayrı kayıt kanallarında sinyal 3,5-5 sigma tarafından kayıt kanalları. Manuel eşikleme elektriksel gürültü kirliliğini önlemek için bazı kanallar için gerekli olabilir. Nöronların aksiyon potansiyelleri kayıt kanalında ani voltaj yükselmelerine olarak görünecektir. Kanalın gerilim eşiği aştığında, sistem böylece Takin, eşik geçiş öncesi ve sonrası birkaç milisaniye tamponlar ve kaydederga dalga anlık görüntü veya başak.
  7. Hemen hava tablonun yanındaki GC olduğunu. GC içine çiçek özü enjekte etmeden önce, GC koşmak sıcaklık rampa yöntemi doğru olduğundan emin olun. Buradaki örnekte, 10 ° C / dak 'lık bir hızla sıcaklık artış takip 4 dakika için 50 başlayarak bir sıcaklık yöntem ° C kullanır. 220 ° ilave bir 6 dakika GC tutun hangi zaman C,. Biz taşıyıcı gaz olarak helyum ile DB-5 GC sütunu (J & W Scientific, Folsom, CA, USA) kullanın. Giriş 200 ° C'ye ayarlanmış bir sıcaklık, splitless olduğunu Alev iyonizasyon dedektörü sıcaklığı 230 ° C'ye ayarlanır
  8. GC sütuna adsorbe uçucular serbest bırakmak için GC ısıtmalı enjeksiyon portu içine çiçek headspace özü örnek enjekte. Sütun atık Alev İyonizasyon Detektörü (FID) ve bir bardak "Y" konnektör (J & W Scientific) kullanılarak arı anten arasındaki 01:01 bölünür. Rec BaşlayanEğer GC bir örnek enjekte olarak elektrottan ording.
  9. GC çalışma bittikten sonra, 5 ila 15 dakika için hazırlık dinlendirin. Bundan sonra, GC başka bir örnek enjekte edilir ya da tek bir uçucu bileşik veya bileşikler karışımı kullanılarak hazırlama uyarır. Hazırlık uyarıcı son bahsedilen yöntem, bir sabit hava akımı hava darbeleri bileşikleri tevdi edilmiş olan filtre kağıdı üzerinde bir parça içeren bir cam şırınga aracılığıyla yönlendirilir. Koku uyarıcı yazılım tarafından kontrol edilen bir solenoid valf ile aktive vasıtasıyla darbeli edildi.
  10. Birim faaliyet aniden durur veya değişiklik varsa, tuzlu damla kontrol edin ve 15 dakika hazırlık dinlendirin. Spontan aktivite önceki seviyesi yeniden kazanmak değilse mevcut ise o zaman hazırlık atılır ve bir başka arı kullanılmalıdır.
  11. Deneyden sonra, hala doku içinde sonda ile, 20 dakika için% 5 formalin ile beyin düzeltmek. Daha sonra, tüketim beyinve 4 saat boyunca% 2 glutaraldehit yerleştirin ve daha sonra kademeli bir etanol dehidratasyon serisi yapmak ve metil salisilat ile beyin temizleyin. Doku, elektrotlar doku konfokal mikroskopi ile pek belirgin olmalıdır delinmiş AL bölgesindeki yerlerin tespiti ve takas sonucu.

4. Veri Analizi

  1. Çözümle Kaydedilen nöral birimleri ayırmak ve tanımlamak için deneme sonra veri toplanmıştır. Böyle tepe veya vadi genlik, pik yarı genişliği, vb gibi başak şekiller, ya da azaltılmış tedbirler dayalı ayrı bir dalga, ya da "ani", (temel bileşenler) 17 için tipik yazılım programları (Çevrimdışı Sıralayıcısı MClust ve SClust) kullanın , 18 (Şekil 2). Üç boyutlu uzayda ayrılmış (PC1-PC3) ve birbirlerinden istatistiksel olarak farklı olduğunu sivri türüne kümeleri kullanın (çok değişkenli ANOVA, p <0.05) (Şekil 2) daha fazla analiz için. Bakıntetrode kayıt ve başak-sıralama yöntemlerin tam açıklaması için alıntıyı # s 17-19.
  2. Zaman damgası her kümede ani ve raster araziler ve atış hızı yanıtları (Şekil 2, 3A) oluşturmak için MATLAB veya Neuroexplorer (Nex Teknolojileri, Winston-Salem, NC) kullanılarak analiz için bu verileri dışa aktarın.
  3. Eş zamanlı olarak kaydedilir GC verileri kullanılarak uçucu alıkonma zamanları belirleyin. O zaman noktalarında ünite, incelemek için, kromatogram dan tepe tepe tarafından belirlenen uçucu tutma süreleri, kullanın.
  4. GC vadede aracılığıyla bireysel ünite cevapları incelemek için, 100 msn aralıklarla başak sayısı, bin ve uçucular salınımlı bir retansiyon zamanı referans ile hızı yanıtları ateşleme zaman ders incelemek. 100 msn aralıklarla başak binning GC bir elüt odorant için nöronal cevabının zaman-kurs hakkında yeterli ayrıntı veya sinyali sağlar.
  5. EXA içinFarklı salgılayan uçucular için nüfus yanıtları mayın, önce, 3 sn örnekleme penceresi üzerinden 1.5 sn bireysel birimlerin ateşleme hızı yanıtları entegre ve 1,5 saniye sonra, bir retansiyon zamanı uçucu (Şekil 3). Bu süre GC uçucu bir salınımlı süreleri tipik bir örneğidir. Ve (sütunlar) GC atık için topluluk yanıtı temsil eden her satırında bir etkinlik matrisi olarak düzenlenmesi (; Biz göre renk kodlama onları (mavi düşük bir yanıttır kırmızı bir yüksek atış hızı yanıtı) birimlerinin hızı yanıtları ateş göster Şekil 3).

Sonuçlar

M. kullanılarak GCMR tahlilinde lewisii çiçek kokusu, biz GC özü 3 ul enjekte. GC ile akıtılarak Uçucu toplam sayısı genellikle 60-70 uçucu olduğunu. M. kokusu lewisii ağırlıklı altı karbonlu, örneğin 2-heksanol gibi uçucu maddeler, ve tepe boşluğunun, <% 1 ihtiva seskuiterpenoidler oluşan koku geri kalanı ile, β-mirsen (asiklik) ve α-pinen de dahil olmak üzere, monoterpenoids oluşur.

GCMR anten lob nöronla...

Tartışmalar

Böcek koku-aracılı davranışları üreme, ana-yer seçimi ve uygun gıda kaynaklarının belirlenmesi dahil olmak üzere birçok farklı süreçler, sürücü. Bu süreçlerin çalışma kaynak yanı sıra, davranışları aracılık eden, bu bileşiklerin teşhis etme yeteneği yayılan uçucu maddeler belirlemek için yeteneğini gerektirir. Konularda karmaşık kokular birlikte, tek tek bileşenlerin 6,7,13,19,20 farklı algılanan bir tek koku oluşturmak tek tek bileşiklerin yüz on oluşmaktadır o...

Açıklamalar

Çıkar çatışması ilan etti.

Teşekkürler

Bu çalışma NSF hibe IOS 1121692 tarafından ve Washington'un Araştırma Vakfı Üniversitesi tarafından desteklenmiştir.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Öğenin ismi Şirket Katalog Numarası Yorumlar
Porapak Tip Q 80-100 örgü Waters WAT027060
Reynolds Fırın Çanta Reynolds
GC Agilent 7820A
GC sütunu J & W Scientific, Folsom, CA, USA DB-5 (30 m, 0.25 mm, 0.25 mikron)
Analitik helyum taşıyıcı gaz Praxair HE K 1 cc / dk
16 kanallı silikon elektrot NeuroNexus Technologies a4x4-3mm50-177
İnce tel NiCr, 0.012 mm çapında) Sandvik Kanthal HP Reid PX000004 Özel tetrodes ve stereotrodes yapmak için
Pre-amplifikatör Tucker-Davis Sistemi PZ-2
Amplifikatör Tucker-Davis Sistemi RZ-2
Veri toplama sistemi - OpenEx suite Tucker-Davis Sistemi
Çevrimiçi başak-sıralama yazılımı - SpikePac Tucker-Davis Sistemi
Çevrimdışı başak-sıralama yazılımı - Mclust Spike-sorting araç David Redish, Nörobilim, Üniversite BölümüMinnesota Az Bedava indir http://redishlab.neuroscience.umn.edu/MClust/MClust.html MATLAB toolbox

Referanslar

  1. Hildebrand, J. G., Shepherd, G. M. Mechanisms of olfactory: converging evidence for common principles across phyla. Annual Review of Neuroscience. 20, 595-631 (1997).
  2. Reisenman, C. E., Riffell, J. A., Bernays, E. A., Hildebrand, J. G. Antagonistic effects of floral scent in an insect-plant interaction. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 277, 2371-2379 (2010).
  3. Reisenman, C. E., Riffell, J. A., Hildebrand, J. G. . International Symposium on Olfaction and Taste. 1170, 462-467 (2009).
  4. Alarcón, R. Congruence between visitation and pollen-transport networks in a California plant-pollinator community. Oikos. 119, 35-44 (2010).
  5. Alarcón, R., Waser, N. M., Ollerton, J. Year-to-year variation in the topology of a plant-pollinator interaction network. Oikos. 117, 1796-1807 (2008).
  6. Riffell, J., et al. Behavioral consequences of innate preferences and olfactory learning in hawkmoth-flower interactions. P. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 3404-3409 (2008).
  7. De Moraes, C. M., Lewis, W. J., Pare, P. W., Alborn, H. T., Tumlinson, J. H. Herbivore-infested plants selectively attract parasitoids. Nature. 393, 570 (1998).
  8. Carey, A. F., Wang, G., Su, C. -. Y., Zwiebel, L. J., Carlson, J. R. Odorant reception in the malaria mosquito Anopheles gambiae. Nature. 464, 66-71 (2010).
  9. Turner, S. L., et al. Ultra-prolonged activation of CO2-sensing neurons disorients mosquitoes. Nature. 474, 87-91 (2011).
  10. Pellegrino, M., Nakagawa, T., Vosshall, L. B. Single sensillum recordings in the insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae. J Vis Exp. (36), e1725 (2010).
  11. Syed, Z., Leal, W. S. Electrophysiological measurements from a moth olfactory system. J. Vis. Exp. (49), e2489 (2011).
  12. Roelofs, W. L., Comeau, A., Hill, A., Milicevic, G. Sex attractant of the codling moth: characterization with electroantennogram technique. Science. 174, 297-299 (1971).
  13. Riffell, J. A., Lei, H., Christensen, T. A., Hildebrand, J. G. Characterization and coding of behaviorally significant odor mixtures. Current Biology. 19, 335-340 .
  14. Riffell, J. A., Lei, H., Hildebrand, J. G. Neural correlates of behavior in the moth Manduca sexta in response to complex odors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the U.S.A. 106, 19219-19226 (2009).
  15. Raguso, R. A., Pellmyr, O. Dynamic headspace analysis of floral volatiles: a comparison of methods. Oikos. 81, 238-254 (1998).
  16. Rodriguez-Saona, C. R. Herbivore-induced blueberry volatiles and intra-plant signaling. J Vis Exp. , e3440 (2011).
  17. Nguyen, D. P., et al. Micro-drive array for chronic in vivo recording: tetrode assembly. J Vis Exp. , e1098 (2009).
  18. Schjetnan, A. G. P., Luczak, A. Recording large-scale neuronal ensembles with silicon probes in the anesthetized rat. J Vis Exp. , e3282 (2011).
  19. Deisig, N., Giurfa, M., Lachnit, H., Sandoz, J. -. C. Neural representation of olfactory mixtures in the honeybee antennal lobe. European Journal of Neuroscience. 24, 1161-1174 (2006).
  20. Stökl, J., et al. A deceptive pollination system targeting drosophilids through olfactory mimicry of yeast. Current Biology. 20, 1846-1852 (2010).
  21. Schneider, D. Elektrophysiologische untersuchungen von chemo- und mechanorezeptoren der antenne des seidenspinners Bombyx mori L. Journal of Comparative Physiology A: Neuroethology, Sensory, Neural, and Behavioral Physiology. 40, 8-41 (1957).
  22. Arn, H., Städler, E., Rauscher, S. The electroantennographic detector: a selective and senstitive tool in the gas chromatographic analysis of insect pheromones. Zeitschrift für Naturforschung. 30c, 722-725 (1975).
  23. Schneider, D., Boeckh, J. Rezeptorpotential und nervenimpulse einzelner olfaktorischer sensillen der insektenantenne. Journal of Comparative Physiology A: Neuroethology, Sensory, Neural, and Behavioral Physiology. 45, 405-412 (1962).
  24. Blight, M. M., Pickett, J. A., Wadhams, L. J., Woodcock, C. M. Antennal perception of oilseed rape Brassica napus (Brassicaceae) volatiles by the cabbage seed weevil Ceutorhynchus assimilis (Coleoptera, Curculionidae). Journal of Chemical Ecology. 21, 1649-1664 (1995).
  25. Lin, D. Y., Shea, S. D., Katz, L. C. Representation of natural stimuli in the rodent main olfactory bulb. Neuron. 50, 937-949 (2006).
  26. Lei, H., Reisenman, C. E., Wilson, C. H., Gabbur, P., Hildebrand, J. G. Spiking patterns and their functional implications in the antennal lobe of the tobacco hornworm Manduca sexta. PLoS ONE. 6, e23382 (2011).
  27. Syed, Z., Leal, W. S. Acute olfactory response of Culex mosquitoes to a human- and bird-derived attractant. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106, 18803-18808 (2009).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

N robilimSay 72N robiyolojiFizyolojiBiyokimyaKimyaEntomlogyDavranelektrofizyolojikoku almakoku alma sistemib cekok kanall kay tgaz kromatografisitozlanmaar larBombus impatiensAntenbeyinhayvan modeli

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır