تقنيات بسيطة وفعالة لإعداد تعليق خلية الخصية

Summary

يوصف بروتوكول رواية لإعداد الميكانيكية من الايقاف الخلية الخصية من المواد القوارض، وتجنب الانزيمات والمنظفات و. طريقة بسيطة جدا وسريعة، واستنساخه، ويجعل جيدة الايقاف الخلية الجودة، والتي هي مناسبة لتدفق الفرز واستخراج الحمض النووي الريبي.

Abstract

الخصيتين الثدييات هي الأجهزة المعقدة جدا التي تحتوي على أكثر من 30 أنواع مختلفة من الخلايا، بما في ذلك الخلايا الجسدية الخصية ومراحل مختلفة من الخلايا الجرثومية. هذا التباين هو العيب هامة تتعلق بدراسة أسس تكوين الحيوانات المنوية لدى الثدييات، كما هناك حاجة السكان الخلية نقية أو المخصب في مراحل معينة من تطور الحيوانات المنوية لمعظم التحليلات الجزيئية ^1.

استراتيجيات مختلفة مثل Staput ^2،3، تصويل الطرد المركزي ^1، والتدفق الخلوي (FC) ^4،5 وقد استخدمت للحصول على السكان الخلية الخصية المخصب أو تنقيته من أجل تمكين دراسات التعبير الجيني التفاضلي.

هو مطلوب منها أن الخلايا هي في تعليق لمعظم النهج تخصيب / تنقية. من الناحية المثالية، فإن تعليق خلية تكون ممثلة من النسيج الأصلي، لديها نسبة عالية من خلايا قابلة للحياة وقليلة multinucleates - التي تميل إلى تشكيل لللطبيعة المخلوي من ظهارة المنوية ^6،7 - وعدم وجود كتل الخلية ^1. وكانت تقارير سابقة يتضح أن الايقاف الخلية الخصية باستخدام أسلوب الميكانيكية حصريا على استعداد تجمعت أكثر سهولة من تلك trypsinized ^1. من ناحية أخرى، والعلاجات الأنزيمية مع RNAses و / أو الأنزيمات تفصيل مثل التربسين وكولاجيناز تؤدي إلى تدهور الجزيئات محددة، وهو غير مرغوب فيه لبعض التطبيقات المصب. وينبغي أن تكون عملية مثالية قصيرة قدر الإمكان وتتطلب الحد الأدنى من التلاعب، وذلك لتحقيق الحفاظ جيدة من الجزيئات ذات الأهمية مثل mRNAs و. البروتوكولات الحالية لإعداد تعليق خلية من الأنسجة الصلبة وعادة ما تكون تعتمد على المشغل تستغرق وقتا طويلا، إلى حد كبير، وربما تلف انتقائي بعض أنواع الخلايا ^1،8.

بروتوكول المعروضة هنا يجمع بين مزايا تصنيفها الميكانيكية استنساخه للغاية وجيزة للغاية مع أحدbsence العلاج الأنزيمية، مما أدى إلى تعليق خلية جيدة الجودة التي يمكن استخدامها لتحليل تدفق cytometric والفرز ^4، ودراسات التعبير الجيني خفية ^9.

Protocol

1. إعداد تعليق خلية

1. تضحية العينة ليتم استخدامها بعد توصيات اللجان المتخصصة مثل IACUC أو ما يعادلها (في أوروغواي، اللجنة الوطنية للتجارب على الحيوانات [مناخ الأعمال]). في حالتنا، وتدار جرعة زائدة من بنتوباربيتال.
2. تشريح الخصيتين وفقا للإجراءات القياسية المعتمدة ووضعها في 96 مم الزجاج طبق بتري على الجليد، التي تحتوي على 10 مل من الجليد الباردة DMEM تستكمل مع 10٪ مصل العجل الجنين.
3. إزالة الغلالة البيضاء وقطع الخصيتين الأرتيميا Decapsulated إلى قطع مربعة من 2-3 ملم على كل جانب.
4. ثم تتم معالجة تلك القطع في Medimachine، وهي طاحونة ميكانيكية الآلي حيث يتم تفصيل هذه الأنسجة داخل وحدة التخلص منها تحتوي على شاشة الفولاذ المقاوم للصدأ مثقبة والدوار المعادن. للقيام بذلك، ضع 1 مل من البرد تستكمل DMEM و4-5 من هذه القطع في 50 ميكرون وحدة القابل للتصرف، والتبديل على disaggregator، وعملية لمدة 50 ثانية بعد تعليمات بسيطة من الشركة المصنعة.
5. استرداد تعليق الخلية الناتجة من وحدة التفكيك باستخدام 3-5 مل حقنة من دون إبرة.
6. تحديد من خلال 50 ميكرومتر شبكة النايلون، غارقة في السابق مع 0.5 مل تستكمل DMEM.
7. تعليق تصفية مرة أخرى باستخدام غارقة 25 ميكرومتر شبكة النايلون، ومكان على الجليد.
8. عد في غرفة نويباور وضبط تركيز الخلوية إلى 1 - 2 × 10 ⁷ خلية / مل مع DMEM تستكمل. لا يقل عن 4 × 10 وعادة ما يتم الحصول عليها ⁷ خلية / جرام من المواد الخصية.
9. أخيرا، إضافة التجمع الوطني الديمقراطي (2 نفثول-6 ،8-دسلفنك حامض، ملح ثنائية البوتاسيوم) إلى تركيز النهائي من 0.2٪ من أجل منع تكتل الخلية.
10. اختياري: تحقق بقاء الخلية من الايقاف الخلية الخصية مع مجموعة الجدوى المتاحة تجاريا لخلايا الحيوان، باتباع إرشادات الشركة المصنعة.

2. تدفق تحليل Cytometric

ve_content "> وقد استخدمنا تدفق FACSVantage بيكتون ديكنسون عداد الكريات مجهزة متماسكة الأرجون ليزر ايون ضبطها لتنبعث منها في 488 نانومتر لتحليل الخلايا الملون مع تركيزات عالية من يوديد propidium (PI). (القضية من مدخل PI في غير المثبتة وقد عولجت الخلايا تحت الضغط في مكان آخر ^9،10).

1. لتلطيخ PI، إضافة تألقي في تركيز النهائي من 50 ميكروغرام / مل لتعليق الخلية، واحتضان لمدة 10 دقيقة في 0 درجة مئوية في الظلام.
2. تم تعيين قوة الليزر إلى 100 ميغاواط، ويستخدم مرشح تمرير 575/26 النطاق لجمع PI-تنبعث مضان في FL2.
3. ونحن أداء قياسات FC مع فوهة ميكرون 70. لفرز السكان منوية، تعيين وضع الفرز في نورمال-R أو عادي-C، وذلك باستخدام 3 قطرات الفرز كما المغلف. الحفاظ على عينة وأنابيب جمع في 3 - 4 ° C باستخدام وحدة التبريد. ضبط الفرق عينة لتحليل الخلايا بمعدل 500 إلى 1،500 في الثانية الواحدة.
4. استخدام البرمجيات CellQuest (BD) لتحليلالمعلمات التالية: مبعثر إلى الأمام (FSC-H)؛ الجانب مبعثر (SSC-H)؛ مجموع مضان المنبعثة أو منطقة النبض (FL2-A)، ومدة الانبعاثات مضان أو نبض العرض (FL2-W).

بدلا من ذلك، ونحن قد استخدمت حيوي صبغ هويشت 33342 إلى تركيز النهائي من 5 ميكروغرام / مل والمحتضنة لمدة 10 دقيقة عند 37 درجة مئوية في الظلام. تم إجراء تحليل الخلية عن طريق عداد الكريات MoFlo (DakoCytomation) مجهزة الطول الموجي للأشعة فوق البنفسجية الإثارة ليزر يعمل بطاقة 25 ميغاواط وذلك باستخدام فوهة ميكرون 70. تم إجراء معالجة البيانات مع القمة V4.3 البرمجيات (DakoCytomation).

النتائج

ويرد مثال على تعليق خلية مفصلة جيدا من الخصيتين الفئران أعدت مع بروتوكول الموصوفة هنا في الشكل 1.

بالمقارنة مع العلاجات الأنزيمية ^6،8 وطرق تصنيفها الميكانيكية التي سبق وصفها ^2، واحد المقدمة هنا هو أسرع بكثير و...

Discussion

الأسلوب الأمثل هو موضح هنا يمكن إعداد تعليق خلية من القوارض أنسجة الخصية بطريقة سريعة جدا وقابلة للتكرار، وتجنب انزيم المنظفات والعلاج والمحافظة على سلامة الخلية جيد ونوع النسب. الاختصار في الإجراء (تشمل 15 دقيقة تمتد تشريح الخصية، وقطع الأنسجة، والتصنيع)، والحد الأ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of Reagent/Material	Company	Catalogue Number	Comments
Medimachine system	BD	340587
Medicon unit (50 μm)	BD	340591
Filcon unit (50 μm)	BD	340603
DMEM	Gibco	430-2100
Fetal calf serum	PAA	A11-151
NDA	Chemos BmbH	277081
Hoechst 33342	Sigma-Aldrich	14533	Stock solution 5 mg/ml; used at a final concentration of 5 μg/ml
Propidium iodide	Sigma-Aldrich	287075	Stock solution 1 mg/ml; used at a final concentration of 50 μg/ml