Простой и эффективный способ для подготовки яичек клеточные суспензии

Резюме

Роман протокол для механической подготовки яичек клеточные суспензии от грызунов материала, избегая ферментов и моющих средств, описан. Метод очень прост, быстр, воспроизводимым, и оказывает хорошее качество клеточные суспензии, которые подходят для сортировки потоков и экстракции РНК.

Аннотация

Семенниках млекопитающих очень сложных органов, которые содержат более 30 различных типов клеток, в том числе соматических клетках яичек и различных стадиях половых клетках. Эта неоднородность является важным недостатком относительно изучения основы сперматогенеза у млекопитающих, в виде чистого или обогащенного популяции клеток на определенных стадиях развития спермы необходимы для большинства молекулярного анализа ^1.

Различные стратегии, такие как ^2,3 Staput, центробежные Отмучиванием ^1, и проточной цитометрии (FC) ^4,5 были использованы для получения обогащенных или очищенной популяции клеток яичек, с тем чтобы дифференциальных исследований экспрессии генов.

Это требует, чтобы клетки в суспензии в течение наиболее обогащения / очистки подходов. В идеальном случае клеточной суспензии будет представитель исходной ткани, имеют высокую долю жизнеспособных клеток и несколько multinucleates - которые имеют тенденцию формировать из-засинцитиальный природе эпителия семенных ^6,7 - и отсутствие скопления клеток ^1. Предыдущие доклады свидетельствуют, что яичек клеточные суспензии подготовленный исключительно механическим способом слипаются легче, чем те, трипсинизированных ^1. С другой стороны, ферментативные процедуры с РНКазы и / или дезагрегации ферментов, как трипсин и коллагеназу приводят к конкретным деградации макромолекул, что является нежелательным для некоторых последующих применений. Идеальный процесс должен быть как можно короче и включают минимальные манипуляции, так как для достижения хорошей сохранности макромолекул интереса, таких как мРНК. Текущие протоколы для приготовления суспензии клеток из твердых тканей обычно времени, весьма зависит от оператора, и может выборочно повредить определенные типы клеток ^1,8.

Протокол, представленные здесь сочетает в себе преимущества высокой воспроизводимостью и очень кратко механической дезагрегации сbsence ферментативной обработки, что приводит к хорошим качеством клеточных суспензий, которые могут быть использованы для анализа методом проточной цитометрии и сортировки ⁴ и скрытые исследования экспрессии гена ^9.

протокол

1. Приготовление клеточных суспензий

1. Жертвоприношение образца, которые будут использоваться в соответствии с рекомендациями специализированных комитетов, таких как IACUC или эквивалент (в Уругвае, Национальная комиссия по экспериментов на животных [НКАЭ]). В нашем случае передозировки пентобарбитала вводили.
2. Проанализируйте яичках после стандартных утвержденных процедур и разместить их в 96 мм стеклянная чашка Петри на льду, содержащую 10 мл ледяной DMEM с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки.
3. Снимите белочной оболочки и нарезать декапсулируется яички на квадратные заготовки из 2 - 3 мм с каждой стороны.
4. Эти части затем обрабатываются в Medimachine, автоматизированной механической мясорубки, где ткань в разбивке внутри одноразового единица содержит перфорированный из нержавеющей стали с плоским экраном и металла ротора. Для этого, 1 место мл холодной дополнен DMEM и 4 - 5 из этих частей в 50 мкм одноразовые аппарата включите disaggregator, и процесс в течение 50 сек следуя простым инструкциям от производителя.
5. Восстановление полученной клеточной суспензии из разбивки устройства с помощью 3 - 5 мл шприц без иглы.
6. Фильтруют через 50 мкм нейлоновую сетку, предварительно пропитанные 0,5 мл DMEM, дополненный.
7. Суспензию фильтруют еще раз, используя пропитанную 25 мкм нейлоновую сетку, и место на льду.
8. Всего в камере Нойбауэра и настроить сотовые концентрации до 1 - 2 х 10 ⁷ клеток / мл DMEM дополнена. По крайней мере, 4 х 10 ⁷ клеток / грамм материала яичка обычно получаются.
9. Наконец, добавьте NDA (2-нафтол-6 ,8-дисульфокислоты, двухкалийна соль) до конечной концентрации 0,2%, чтобы предотвратить слипание клетки.
10. Дополнительно: проверить жизнеспособность клеток яичек клеточные суспензии имеющейся в продаже комплект для жизнеспособности клеток животных, следуя инструкциям производителя.

2. Проточной цитометрии

ve_content "> Мы использовали Becton-Dickinson FACSVantage проточной цитометрии оснащен когерентной аргоновый ионный лазер настроен на излучающих на длине волны 488 нм для анализа клеток, окрашенных с высокой концентрацией йодида пропидий (PI). (вопрос о входе в PI нефиксированной Клетки в состоянии стресса была решена в другом месте ^9,10).

1. Для окрашивания PI, добавьте флуорохромом в конечной концентрации 50 мкг / мл к суспензии клеток, и инкубировали в течение 10 мин при 0 ° C в темноте.
2. Мощность лазера установлен в 100 мВт и 575/26 полосовой фильтр используется для сбора PI-испускаемых флуоресценцию в FL2.
3. Мы проводим измерения с FC 70 мкм сопла. Для сортировки сперматоцит населения, установить режим сортировки в Normal-R или Normal-C, с использованием 3 капли отсортированы как конверт. Хранить образца и сбор труб на 3 - 4 ° С с помощью холодильной установки. Регулировка образец дифференциального анализа клетки со скоростью от 500 до 1500 в секунду.
4. Используйте CellQuest программного обеспечения (BD) для анализаследующими параметрами: прямого рассеяния (FSC-H); бокового рассеяния (SSC-H); полной излучаемой флуоресценции или широтно-области (FL2-А), и длительность флуоресценции или широтно-импульсной (FL2-W).

Кроме того, мы использовали витальным красителем Hoechst 33342 до конечной концентрации 5 мкг / мл и инкубировали в течение 10 мин при 37 ° С в темноте. Сотовые анализ проводили с помощью MoFlo цитометра (DakoCytomation), снабженный УФ волны возбуждения лазера, работающего на 25 мВт и с помощью 70 мкм сопла. Данные манипуляции проводили с саммита v4.3 программное обеспечение (DakoCytomation).

Результаты

Пример хорошо дезагрегированных суспензии клеток крысы семенников приготовленные с протоколом, описанным здесь показана на рисунке 1.

По сравнению с ферментативной процедуры ^6,8 и в ранее описанных механических методов дезагрегирования ^2, один пред...

Обсуждение

Оптимизированный метод, описанный здесь позволяет получать суспензии клеток с грызунами ткани яичек в очень быстрым и воспроизводимым образом, избегая фермента и моющее средство лечения и поддержания хорошей целостности клеток и типа пропорции. Краткость процедуры (15 мин участок вкл...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of Reagent/Material	Company	Catalogue Number	Comments
Medimachine system	BD	340587
Medicon unit (50 μm)	BD	340591
Filcon unit (50 μm)	BD	340603
DMEM	Gibco	430-2100
Fetal calf serum	PAA	A11-151
NDA	Chemos BmbH	277081
Hoechst 33342	Sigma-Aldrich	14533	Stock solution 5 mg/ml; used at a final concentration of 5 μg/ml
Propidium iodide	Sigma-Aldrich	287075	Stock solution 1 mg/ml; used at a final concentration of 50 μg/ml