Простой и эффективный способ для подготовки яичек клеточные суспензии

Резюме

Роман протокол для механической подготовки яичек клеточные суспензии от грызунов материала, избегая ферментов и моющих средств, описан. Метод очень прост, быстр, воспроизводимым, и оказывает хорошее качество клеточные суспензии, которые подходят для сортировки потоков и экстракции РНК.

Аннотация

Семенниках млекопитающих очень сложных органов, которые содержат более 30 различных типов клеток, в том числе соматических клетках яичек и различных стадиях половых клетках. Эта неоднородность является важным недостатком относительно изучения основы сперматогенеза у млекопитающих, в виде чистого или обогащенного популяции клеток на определенных стадиях развития спермы необходимы для большинства молекулярного анализа ^1.

Различные стратегии, такие как ^2,3 Staput, центробежные Отмучиванием ^1, и проточной цитометрии (FC) ^4,5 были использованы для получения обогащенных или очищенной популяции клеток яичек, с тем чтобы дифференциальных исследований экспрессии генов.

Это требует, чтобы клетки в суспензии в течение наиболее обогащения / очистки подходов. В идеальном случае клеточной суспензии будет представитель исходной ткани, имеют высокую долю жизнеспособных клеток и несколько multinucleates - которые имеют тенденцию формировать из-засинцитиальный природе эпителия семенных ^6,7 - и отсутствие скопления клеток ^1. Предыдущие доклады свидетельствуют, что яичек клеточные суспензии подготовленный исключительно механическим способом слипаются легче, чем те, трипсинизированных ^1. С другой стороны, ферментативные процедуры с РНКазы и / или дезагрегации ферментов, как трипсин и коллагеназу приводят к конкретным деградации макромолекул, что является нежелательным для некоторых последующих применений. Идеальный процесс должен быть как можно короче и включают минимальные манипуляции, так как для достижения хорошей сохранности макромолекул интереса, таких как мРНК. Текущие протоколы для приготовления суспензии клеток из твердых тканей обычно времени, весьма зависит от оператора, и может выборочно повредить определенные типы клеток ^1,8.

Протокол, представленные здесь сочетает в себе преимущества высокой воспроизводимостью и очень кратко механической дезагрегации сbsence ферментативной обработки, что приводит к хорошим качеством клеточных суспензий, которые могут быть использованы для анализа методом проточной цитометрии и сортировки ⁴ и скрытые исследования экспрессии гена ^9.

протокол

1. Приготовление клеточных суспензий

1. Жертвоприношение образца, которые будут использоваться в соответствии с рекомендациями специализированных комитетов, таких как IACUC или эквивалент (в Уругвае, Национальная комиссия по экспериментов на животных [НКАЭ]). В нашем случае передозировки пентобарбитала вводили.
2. Проанализируйте яичках после стандартных утвержденных процедур и разместить их в 96 мм стеклянная чашка Петри на льду, содержащую 10 мл ледяной DMEM с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки.
3. Снимите белочной оболочки и нарезать декапсулируется яички на квадратные заготовки из 2 - 3 мм с каждой стороны.
4. Эти части затем обрабатываются в Medimachine, автоматизированной механической мясорубки, где ткань в разбивке внутри одноразового единица содержит перфорированный из нержавеющей стали с плоским экраном и металла ротора. Для этого, 1 место мл холодной дополнен DMEM и 4 - 5 из этих частей в 50 мкм одноразовые аппарата включите disaggregator, и процесс в течение 50 сек следуя простым инструкциям от производителя.
5. Восстановление полученной клеточной суспензии из разбивки устройства с помощью 3 - 5 мл шприц без иглы.
6. Фильтруют через 50 мкм нейлоновую сетку, предварительно пропитанные 0,5 мл DMEM, дополненный.
7. Суспензию фильтруют еще раз, используя пропитанную 25 мкм нейлоновую сетку, и место на льду.
8. Всего в камере Нойбауэра и настроить сотовые концентрации до 1 - 2 х 10 ⁷ клеток / мл DMEM дополнена. По крайней мере, 4 х 10 ⁷ клеток / грамм материала яичка обычно получаются.
9. Наконец, добавьте NDA (2-нафтол-6 ,8-дисульфокислоты, двухкалийна соль) до конечной концентрации 0,2%, чтобы предотвратить слипание клетки.
10. Дополнительно: проверить жизнеспособность клеток яичек клеточные суспензии имеющейся в продаже комплект для жизнеспособности клеток животных, следуя инструкциям производителя.

2. Проточной цитометрии

ve_content "> Мы использовали Becton-Dickinson FACSVantage проточной цитометрии оснащен когерентной аргоновый ионный лазер настроен на излучающих на длине волны 488 нм для анализа клеток, окрашенных с высокой концентрацией йодида пропидий (PI). (вопрос о входе в PI нефиксированной Клетки в состоянии стресса была решена в другом месте ^9,10).

1. Для окрашивания PI, добавьте флуорохромом в конечной концентрации 50 мкг / мл к суспензии клеток, и инкубировали в течение 10 мин при 0 ° C в темноте.
2. Мощность лазера установлен в 100 мВт и 575/26 полосовой фильтр используется для сбора PI-испускаемых флуоресценцию в FL2.
3. Мы проводим измерения с FC 70 мкм сопла. Для сортировки сперматоцит населения, установить режим сортировки в Normal-R или Normal-C, с использованием 3 капли отсортированы как конверт. Хранить образца и сбор труб на 3 - 4 ° С с помощью холодильной установки. Регулировка образец дифференциального анализа клетки со скоростью от 500 до 1500 в секунду.
4. Используйте CellQuest программного обеспечения (BD) для анализаследующими параметрами: прямого рассеяния (FSC-H); бокового рассеяния (SSC-H); полной излучаемой флуоресценции или широтно-области (FL2-А), и длительность флуоресценции или широтно-импульсной (FL2-W).

Кроме того, мы использовали витальным красителем Hoechst 33342 до конечной концентрации 5 мкг / мл и инкубировали в течение 10 мин при 37 ° С в темноте. Сотовые анализ проводили с помощью MoFlo цитометра (DakoCytomation), снабженный УФ волны возбуждения лазера, работающего на 25 мВт и с помощью 70 мкм сопла. Данные манипуляции проводили с саммита v4.3 программное обеспечение (DakoCytomation).

Результаты

Пример хорошо дезагрегированных суспензии клеток крысы семенников приготовленные с протоколом, описанным здесь показана на рисунке 1.

По сравнению с ферментативной процедуры ^6,8 и в ранее описанных механических методов дезагрегирования ^2, один пред...

Обсуждение

Оптимизированный метод, описанный здесь позволяет получать суспензии клеток с грызунами ткани яичек в очень быстрым и воспроизводимым образом, избегая фермента и моющее средство лечения и поддержания хорошей целостности клеток и типа пропорции. Краткость процедуры (15 мин участок вкл...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Medimachine system	BD	340587
Medicon unit (50 μm)	BD	340591
Filcon unit (50 μm)	BD	340603
DMEM	Gibco	430-2100
Fetal calf serum	PAA	A11-151
NDA	Chemos BmbH	277081
H–chst 33342	Sigma-Aldrich	14533	Stock solution 5 mg/ml; used at a final concentration of 5 μg/ml
Propidium iodide	Sigma-Aldrich	287075	Stock solution 1 mg/ml; used at a final concentration of 50 μg/ml