精巣細胞懸濁液の調製のためのシンプルで効率的な手法

要約

酵素および洗剤を回避するげっ歯類の材料から精巣細胞懸濁液を機械的に調製するための新規なプロトコルは、記載されている。この方法は非常に簡単、迅速、再現性があり、フローソーティングおよびRNA抽出のために適している良質の細胞懸濁液を、レンダリングする。

要約

哺乳動物の精巣は、体精巣細胞と生殖細胞のさまざまな段階を含む、30以上の異なる種類の細胞が含まれている非常に複雑な器官である。精子開発の特定の段階で純粋なまたは濃縮された細胞集団は最も分子解析¹のために必要とされるので、この不均一性は、哺乳類の精子形成の拠点の研究に関する重要な欠点である。

例えばStaput ^2,3、遠心水簸^1、およびフローサイトメトリー^（FC）4,5等の各種戦略が異なる遺伝子発現研究を可能にするために、富化または精製された精巣細胞集団を得るために用いられてきた。

これは、細胞が最も濃縮/精製アプローチが懸濁液であることが必要である。理想的には、細胞懸濁液は、元の組織の代表となり、生細胞と少数multinucleatesの高い割合を持っている - ために形成する傾向があると不足細胞塊¹ -精上皮^6,7の合胞体性質。以前の報告では、もっぱら機械的な方法によって調製精巣細胞懸濁液は、トリプシン処理したもの¹よりも容易に凝集していることも明らかでした。 RNアーゼおよび/または特定のダウンストリームアプリケーションのために望ましくない特定の高分子の劣化へのトリプシン及びコラゲナーゼ鉛のように分解する酵素で、一方、酵素処理。理想的なプロセスは、mRNAのようなその他の巨大分子の良好な保存を達成するために、可能な限り短くし、最小限の操作を含むべきである。固形組織からの細胞懸濁液の調製のための現在のプロトコルは、通常、時間がかかり、非常にオペレータに依存しており、選択的に特定の細胞型^1,8に損傷^を与えることができる。

ここで紹介するプロトコルは、と再現性の高い、非常に簡単な機械的な分解の利点を兼ね備えていますフローサイトメトリー分析および選別^4、及び不純な遺伝子発現研究⁹に用いることができる良質の細胞懸濁液につながる酵素処理のbsence。

プロトコル

1。細胞懸濁液の調製

1. このような動物実験委員会または同等の専門委員会の勧告後に使用する試験片を生け贄に捧げる（ウルグアイ、国家委員会における動物実験のための[CNEA]）。我々のケースでは、ペントバルビタールの過剰摂取は、投与した。
2. 標準的な承認さ​​れた手順に従って、精巣を解剖し、氷冷DMEM、10 mlを入れ、氷の上に96ミリメートルのガラスペトリ皿に配置し、10％ウシ胎児血清を添加した。
3. 白膜を取り外し、2の平方根の部分にカプセル開放精巣をカット - それぞれの側に3ミリメートル。
4. それらの作品は、その後Medimachine、組織があきステンレススクリーン、金属ローターを含む使い捨てユニットの内側に細分化され自動化された機械的な粉砕機で処理されます。 50μmの使い捨てユニット、disaggregatorのスイッチ、その過程で、これらの作品の5 - そのためには、風邪の代わりに1ミリリットルはDMEMと4を補足メーカーからの簡単な指示に従う50秒のために。
5. 針なしの5ミリリットルの注射器 - 3を使用して分解ユニットから得られた細胞懸濁液を回復。
6. 以前にDME​​Mを補足0.5mlの浸し、50μmのナイロンメッシュを通して濾過する。
7. 氷の上で浸した25μmのナイロンメッシュ、と場所を使用して再度サスペンションをフィルタリング。
8. ノイバウアー室にカウントし、1に対する細胞濃度を調整- 2×10 ⁷細胞/ ml添加したDMEMで。精巣材料の少なくとも4×10 ⁷細胞/グラムは、通常得られる。
9. 最後に、細胞凝集を防止するために0.2％の最終濃度にNDA（2 - ナフトール-6,8 - ジスルホン酸、カリウム塩）を追加する。
10. オプション：製造者の指示に従って、動物細胞のための市販のキットに生存精巣細胞懸濁液の細胞生存率を確認する。

2。フローサイトメトリー分析

ve_content ">我々は、ヨウ化プロピジウムの高濃度（PI）により染色した細胞の分析のために488nmで発光するように調整されたコヒーレントアルゴンイオンレーザーを備えたベクトン·ディッキンソンFACSVantageフローサイトメーターを使用している。（未定着にPI入り口の問題ストレス下の細胞は、他の場所で^9,10）対処されている。

1. PI染色のため、細胞懸濁液に50μgの/ mlの最終濃度で蛍光色素追加し、0℃で10分間インキュベート℃の暗所でC。
2. レーザパワーは100mWに設定され、26分の575バンドパスフィルタFL2にPI-発せられる蛍光を収集するために使用される。
3. 私たちは、70μmのノズルをFC測定を行う。精母細胞集団を選別するため、エンベロープとして3並べ滴を使用して、通常の-Rやノーマル-Cモードでソート設定。 3でのサンプルとコレクションチューブ保つ - 4°冷却ユニットを使用してC。毎秒500〜1,500の割合で細胞を分析するサンプルの差を調整します。
4. 分析するセルクエストソフトウェア（BD）を使用次のパラメーター：前方散乱（FSC-H）、側方散乱（SSC-H）、総放出される蛍光またはパルス面積（FL2-）、および蛍光発光またはパルス幅（FL2-W）が持続。

代わりに、我々は5μgの/ mlの最終濃度に生体染色色素ヘキスト33342を採用し、37時10分°C、暗所でインキュベートした。細胞分析はMoFloサイトメーター（DakoCytomation）を用いて25mWでのUV励起波長のレーザを動作させて搭載し、70μmのノズルを用いて行った。データ操作はサミットv4.3のソフトウェア（DakoCytomation）を用いて行った。

結果

ここで説明されたプロトコルを用いて調製したラット精巣からよく分解された細胞懸濁液の例は、図1に示されている。

酵素処理^6,8へと前述した機械的な分解方法²と比較すると、ここで紹介する1（特に他の機械に比べて、はるかに高速です少ないハンドリングを伴う、（not演算子に依存）を簡単に再現可能であり、希少細胞の破片をレンダ?...

ディスカッション

ここで説明する最適化された方法は、酵素と界面活性剤処理を回避し、良好な細胞の完全性と型の比率を維持し、非常に高速かつ再現可能な方法で、げっ歯類の精巣組織からの細胞懸濁液の調製を可能にする。手順（15分スパンが精巣解剖、組織の切断、および処理が含まれます）、関係する最小限の処理、酵素処理の不在の簡潔さは、主な利点のいくつかである。これらはすべて、元の細?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of Reagent/Material	Company	Catalogue Number	Comments
Medimachine system	BD	340587
Medicon unit (50 μm)	BD	340591
Filcon unit (50 μm)	BD	340603
DMEM	Gibco	430-2100
Fetal calf serum	PAA	A11-151
NDA	Chemos BmbH	277081
Hoechst 33342	Sigma-Aldrich	14533	Stock solution 5 mg/ml; used at a final concentration of 5 μg/ml
Propidium iodide	Sigma-Aldrich	287075	Stock solution 1 mg/ml; used at a final concentration of 50 μg/ml