Técnica sencilla y eficaz para la preparación de suspensiones de células testiculares

Resumen

Se describe un nuevo protocolo para la preparación mecánica de suspensiones de células testiculares de material de roedor, evitando enzimas y detergentes,. El método es muy simple, rápido, reproducible, y hace que las suspensiones de células de buena calidad, que son adecuados para la clasificación de flujo y la extracción de RNA.

Resumen

Testículos de mamíferos son órganos muy complejos que contienen más de 30 tipos diferentes de células, incluyendo las células somáticas testiculares y las diferentes etapas de las células germinales. Esta heterogeneidad es un inconveniente importante relación con el estudio de las bases de la espermatogénesis de mamíferos, ya que se necesitan poblaciones de células puros o enriquecidos en ciertas etapas del desarrollo de los espermatozoides para la mayoría de los análisis moleculares ^1.

Varias estrategias tales como Staput ^2,3, elutriación centrífuga ^1, y citometría de flujo (FC) ^4,5 se han empleado para obtener poblaciones de células testiculares enriquecidos o purificados con el fin de permitir a los estudios de expresión génica diferencial.

Se requiere que las células están en suspensión para la mayoría de los enfoques de enriquecimiento / purificación. Idealmente, la suspensión celular será representativo del tejido original, tienen una alta proporción de células viables y unos multinucleates - que tienden a formar debido a lasincitial naturaleza del epitelio seminífero ^6,7 - y grupos de células falta ^1. En informes anteriores habían evidenciado que las suspensiones de células testiculares preparados por un método exclusivamente mecánica agrupados más facilidad que las tratadas con tripsina ^1. Por otra parte, los tratamientos enzimáticos con RNAsas y / o enzimas disgregantes como tripsina y la colagenasa conducen a la degradación de macromoléculas específica, lo cual es indeseable para ciertas aplicaciones industriales. El proceso ideal debe ser tan corta como sea posible e implicar un mínimo de manipulación, a fin de lograr una buena conservación de las macromoléculas de interés, tales como ARNm. Los protocolos actuales para la preparación de suspensiones de células de tejidos sólidos son por lo general mucho tiempo, altamente dependiente del operador, y pueden dañar selectivamente ciertos tipos de células ^1,8.

El protocolo presentado aquí combina las ventajas de una desagregación mecánica altamente reproducible y extremadamente breve con la unabsence de tratamiento enzimático, que conduce a suspensiones de células de buena calidad que se pueden utilizar para análisis de citometría de flujo y clasificación ^4, y ulteriores estudios de expresión génica ^9.

Protocolo

1. Preparación de las suspensiones celulares

1. Sacrificar la muestra para ser utilizados siguiendo las recomendaciones de las comisiones especializadas como IACUC o equivalente (en Uruguay, la Comisión Nacional de Experimentación Animal [CNEA]). En nuestro caso, se administró una sobredosis de pentobarbital.
2. Diseccionar los testículos siguientes procedimientos aprobados normales y colocarlos en un vaso de 96 mm de placa de Petri en hielo, que contiene 10 ml de DMEM enfriado con hielo suplementado con 10% de suero de ternera fetal.
3. Retire la túnica albugínea y cortar los testículos descapsulados en trozos cuadrados de 2 a 3 mm en cada lado.
4. Esas piezas se procesan entonces en un Medimachine, un molino mecánico automatizado donde el tejido se desagrega el interior de una unidad desechable que contiene una pantalla de acero inoxidable perforada y un rotor de metal. Para ello, colocar 1 ml de DMEM complementado fría y 4-5 de estas piezas en una unidad de 50 micras, desechable, encienda el disaggregator, y el proceso de para 50 seg siguiendo las instrucciones simples del fabricante.
5. Recuperar la suspensión de células resultante de la unidad de desagregación usando un 3 - 5 de jeringa ml sin aguja.
6. Filtrar con un 50 micras de malla de nylon, previamente remojadas con 0,5 ml DMEM suplementado.
7. Se filtra la suspensión de nuevo con un empapado 25 micras de malla de nylon, y el lugar en el hielo.
8. Contar en una cámara de Neubauer y ajustar la concentración celular a 1 - 2 x 10 ⁷ células / ml con DMEM suplementado. Al menos 4 x 10 ⁷ células / gramo de material testicular por lo general se obtiene.
9. Por último, añadir NDA (2-naftol-6 ,8-disulfónico, sal dipotásica) a una concentración final de 0,2% con el fin de evitar la aglutinación de células.
10. Opcional: comprobar la viabilidad celular de las suspensiones de células testiculares con un kit de viabilidad comercialmente disponible para las células animales, siguiendo las instrucciones del fabricante.

2. Análisis de citometría de flujo

ve_content "> Hemos utilizado un Becton-Dickinson FACSVantage citómetro de flujo equipado con un láser de iones de argón coherente sintonizado para emitir a 488 nm para el análisis de las células teñidas con altas concentraciones de yoduro de propidio (PI) (El tema de la entrada en PI no fijadas. Las células sometidas a estrés se ha abordado en otra parte ^9,10).

1. Para la tinción PI, añadir fluorocromo a una concentración final de 50 mg / ml a la suspensión de células, y se incuba durante 10 min a 0 ° C en la oscuridad.
2. La potencia del láser se ajusta a 100 mW y un filtro de paso de 575/26 banda se utiliza para recoger PI-la fluorescencia emitida en FL2.
3. Realizamos mediciones de FC con una boquilla de 70 micras. Para ordenar las poblaciones spermatocyte, establezca el modo de clasificación en Normal o Normal-R-C, con 3 gotas clasificados como sobre. Mantenga la muestra y los tubos de recogida en 3 - 4 ° C mediante el uso de una unidad de refrigeración. Ajuste diferencial de la muestra a analizar las células a una velocidad de 500 a 1.500 por segundo.
4. Utilice el software CellQuest (BD) para analizarlos siguientes parámetros: dispersión frontal (FSC-H); dispersión lateral (SSC-H); fluorescencia emitida o total de pulso-área (FL2-A), y la duración de la emisión de fluorescencia o de ancho de pulso (FL2-W).

Alternativamente, hemos empleado el colorante vital Hoechst 33342 a una concentración final de 5 g / ml y se incubaron durante 10 min a 37 ° C en la oscuridad. Análisis celular se realizó por medio de un citómetro MoFlo (DakoCytomation) equipados con una excitación de longitud de onda UV láser que opera a 25 mW y el uso de una boquilla de 70 micras. Manipulación de los datos se realizó con el software Summit v4.3 (Dako).

Resultados

Un ejemplo de una suspensión de células y desagregada de testículos de ratas preparadas con el protocolo descrito aquí se muestra en la Figura 1.

En comparación a los tratamientos enzimáticos ^6,8 y para los métodos descritos anteriormente desagregación mecánica ^2, la que se presenta aquí es mucho más rápido, implica menos manipulación, es fácilmente reproducible (no depende del operador), y hace que los desechos celulares escasos (especial...

Discusión

El método optimizado descrito aquí permite la preparación de suspensiones de células a partir de tejido testicular roedor de una manera muy rápida y reproducible, evitando enzima y detergente tratamiento y mantener una buena integridad de la célula y las proporciones de tipo. La brevedad del procedimiento (el lapso de 15 min incluye disección testículo, corte de tejido, y el procesamiento), la manipulación mínimos correspondientes, y la ausencia de tratamientos enzimáticos son algunas de las principales venta...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Medimachine system	BD	340587
Medicon unit (50 μm)	BD	340591
Filcon unit (50 μm)	BD	340603
DMEM	Gibco	430-2100
Fetal calf serum	PAA	A11-151
NDA	Chemos BmbH	277081
H–chst 33342	Sigma-Aldrich	14533	Stock solution 5 mg/ml; used at a final concentration of 5 μg/ml
Propidium iodide	Sigma-Aldrich	287075	Stock solution 1 mg/ml; used at a final concentration of 50 μg/ml