Técnica simples e eficiente para a preparação de suspensões de células testiculares

Resumo

Um protocolo de novo para a preparação de suspensões de células mecânica testiculares roedor a partir de material, evitando enzimas e detergentes, é descrito. O método é muito simples, rápida, reprodutível e processa boas suspensões de células de qualidade, os quais são adequados para a separação do fluxo e extracção de RNA.

Resumo

Testículos mamíferos são órgãos muito complexos que contêm mais de 30 diferentes tipos de células, incluindo as células testiculares somáticas e diferentes estágios de células germinativas. Esta heterogeneidade é uma desvantagem importante em relação ao estudo das bases da espermatogénese mamíferos, visto que são necessárias populações puras ou enriquecidas de células em determinadas fases do desenvolvimento do esperma para a maioria das análises moleculares ^1.

Várias estratégias, tais como Staput ^{2,3, uma} elutriação centrífuga, e por citometria de fluxo (FC) ^{de 4,5} foram utilizados para a obtenção de populações de células testiculares enriquecida ou purificada, a fim de permitir que os estudos de expressão diferencial de genes.

Exige-se que as células estão em suspensão para a maioria das abordagens de enriquecimento / purificao. Idealmente, a suspensão de células seja representativo do tecido original, possuem uma elevada proporção de células viáveis ​​e alguns multinucleates - que tendem a formar por causa donatureza sincicial do epitélio seminífero ^6,7 - e aglomerados de células falta ^um. Relatórios anteriores evidenciaram que as suspensões de células testiculares preparados por um método exclusivamente mecânica agregada mais facilmente do que os tripsinizados ^1. Por outro lado, os tratamentos enzimáticos com ARNases e / ou desagregação das enzimas como a tripsina e a colagenase, levar à deterioração macromoléculas específicas, o que é indesejável em certas aplicações a jusante. O processo ideal deveria ser tão curto quanto possível e envolvem manipulação mínima de modo a conseguir uma boa conservação das macromoléculas de interesse, tal como ARNm. Protocolos actuais para a preparação de suspensões de células a partir de tecidos sólidos são geralmente demorados, altamente dependente do operador, e podem danificar selectivamente certos tipos de células ^1,8.

O protocolo aqui apresentado combina as vantagens de uma desagregação mecânica altamente reprodutível e extremamente breve com o umbsence de tratamento enzimático, que conduz a boas suspensões de células de qualidade que possam ser utilizados para a análise por citometria de fluxo e a triagem ^4, e os estudos de expressão de genes posteriores ^9.

Protocolo

1. Preparação de suspensões de células

1. Sacrificar o espécime a ser utilizado seguindo as recomendações das comissões especializadas, como IACUC ou equivalente (no Uruguai, Comissão Nacional de Experimentação Animal [CNEA]). No nosso caso, uma dose excessiva de pentobarbital foi administrada.
2. Dissecar testículos seguindo procedimentos padrão aprovados e colocá-los num copo 96 milímetros de Petri em gelo, contendo 10 ml de DMEM gelada suplementada com soro de vitela fetal a 10%.
3. Remover a túnica albugínea dos testículos e cortado em pedaços descapsulados quadrados de 2 - 3 mm de cada lado.
4. Essas peças são depois processados ​​num Medimachine, um moinho mecânico automatizado, onde o tecido é desagregado no interior de uma unidade descartável que contém uma tela de aço inoxidável perfurada e um rotor de metal. Para isso, coloque 1 ml de DMEM suplementado frio e 4-5 dessas peças em uma unidade de 50 mm descartável, ligue o disaggregator, e processo durante 50 seg, seguindo as instruções do fabricante simples.
5. Recuperar a suspensão de células resultante a partir da unidade de desagregação usando um grupo 3 - 5 ml de seringa sem agulha.
6. Filtrar com um mM malha 50 nylon, previamente embebidas com 0,5 ml de DMEM suplementado.
7. Filtrar a suspensão novamente usando um encharcada 25 mM malha de nylon, e colocar no gelo.
8. Contagem numa câmara de Neubauer e ajuste a concentração celular a 1-2 x 10 ⁷ células / ml com DMEM suplementado. Pelo menos 4 x 10 ⁷ células / grama de material de testículos são usualmente obtidas.
9. Finalmente, adicionar NDA (2-naftol-6 ,8-dissulfónico, sal de dipotássio) para uma concentração final de 0,2%, a fim de evitar a aglutinação de células.
10. Opcional: verificar a viabilidade celular das suspensões de células testiculares com um kit disponível comercialmente para a viabilidade de células animais, seguindo as instruções do fabricante.

2. Análise citométrica

ve_content "> Usámos um Becton-Dickinson FACSVantage citómetro de fluxo equipado com um laser de iões de árgon Coherent sintonizado para emitir a 488 nm para análise das células coradas com altas concentrações de iodeto de propídio (PI). (A questão da entrada em PI não fixado células sob estresse tem sido abordada em outros lugares ^9,10).

1. Para a coloração de PI, adicionar fluorocromo a uma concentração final de 50 ug / mL à suspensão de células, e incubar durante 10 min a 0 ° C no escuro.
2. Potência do laser é ajustado para 100 mW e um filtro passa 575/26 banda é usado para coletar PI-fluorescência emitida em FL2.
3. Realizamos medições FC com um bico de 70 mM. Para classificar as populações espermatócitos, defina o modo de classificação em Normal-R ou Normal-C, usando 3 gotas classificadas como envelope. Mantenha a amostra e os tubos de recolha de 3-4 ° C, utilizando uma unidade de refrigeração. Ajustar amostra diferencial para analisar as células a uma taxa de 500 a 1500 por segundo.
4. Use software CellQuest (BD) para analisaros seguintes parâmetros: Forward Scatter (FSC-H); dispersão lateral (SSC-H); fluorescência emitida ou total da área de pulso (FL2-A); ea duração da emissão de fluorescência ou por largura de pulso (FL2-W).

Alternativamente, podemos ter empregado o corante vital Hoechst 33342 para uma concentração final de 5 ug / ml e incubada durante 10 min a 37 ° C no escuro. A análise celular foi realizada por meio de um citómetro MoFlo (DakoCytomation), equipado com um laser de UV de comprimento de onda de excitação regulado para 25 mW e com um bocal de 70 um. Manipulação de dados foi realizada com o software Summit v4.3 (DakoCytomation).

Resultados

Um exemplo de uma suspensão de células bem desagregada preparados a partir de testículos de ratos com o protocolo aqui descrito é mostrado na Figura 1.

Em comparação com os tratamentos enzimáticos ^6,8 a desagregação e a métodos mecânicos descritos anteriormente ^2, o que foi apresentado aqui é muito mais rápido, envolve menos manuseamento, é facilmente reprodutível (não dependente do operador), os detritos celulares e torna escassa (espec...

Discussão

O método descrito aqui optimizado permite a preparação de suspensões de células a partir de tecido testicular de roedores de um modo muito rápido e reprodutível, evitando o tratamento enzima e detergente e de manter uma boa integridade da célula e tipo proporções. A brevidade do procedimento (a 15 min extensão inclui dissecção testículo, corte de tecido, e transformação), envolva um mínimo de manipulação, e na ausência de tratamentos enzimáticos são algumas das principais vantagens. Todas estas rep...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of Reagent/Material	Company	Catalogue Number	Comments
Medimachine system	BD	340587
Medicon unit (50 μm)	BD	340591
Filcon unit (50 μm)	BD	340603
DMEM	Gibco	430-2100
Fetal calf serum	PAA	A11-151
NDA	Chemos BmbH	277081
Hoechst 33342	Sigma-Aldrich	14533	Stock solution 5 mg/ml; used at a final concentration of 5 μg/ml
Propidium iodide	Sigma-Aldrich	287075	Stock solution 1 mg/ml; used at a final concentration of 50 μg/ml