Technique simple et efficace pour la préparation de suspensions de cellules testiculaires

Résumé

Un nouveau protocole pour la préparation mécanique des suspensions de cellules testiculaires de matériel de rongeurs, en évitant les enzymes et les détergents, est décrite. La méthode est très simple, rapide et reproductible, et rend les suspensions cellulaires de bonne qualité, qui sont adaptés pour le tri de flux et extraction de l'ARN.

Résumé

Testicules de mammifères sont des organes très complexes qui contiennent plus de 30 différents types de cellules, notamment les cellules testiculaires somatiques et les différentes étapes de cellules germinales. Cette hétérogénéité est un inconvénient majeur en ce qui concerne l'étude des bases de la spermatogenèse chez les mammifères, comme les populations de cellules pures ou enrichies dans certaines étapes du développement des spermatozoïdes sont nécessaires pour la plupart des analyses moléculaires ^1.

Diverses stratégies telles que Staput ^2,3, élutriation centrifuge ^1, et cytométrie de flux (FC) ^4,5 ont été utilisées pour obtenir des populations de cellules testiculaires enrichi ou purifié afin de permettre des études d'expression différentielle de gènes.

Il est nécessaire que les cellules sont en suspension de la plupart des approches d'enrichissement / purification. Idéalement, la suspension cellulaire sera représentatif du tissu d'origine, une forte proportion de cellules viables et peu multinucleates - qui ont tendance à se former en raison de lasyncytial nature de l'épithélium séminifère ^6,7 - et amas de cellules manquent de ^1. Les rapports précédents ont mis en évidence que des suspensions de cellules testiculaires préparés par un procédé exclusivement mécanique agglutinées plus facilement que ceux trypsinisés ^1. D'autre part, les traitements enzymatiques avec RNAses et / ou des enzymes désagrégation comme la trypsine et la collagénase conduit à la dégradation des macromolécules spécifique, ce qui n'est pas souhaitable pour certaines applications en aval. Le processus idéal doit être aussi courte que possible et impliquer une manipulation minimale, afin de parvenir à une bonne conservation des macromolécules d'intérêt tels que les ARNm. Les protocoles actuels pour la préparation des suspensions cellulaires de tissus solides sont généralement beaucoup de temps, très dépendante de l'opérateur, et peut endommager de façon sélective certains types de cellules ^1,8.

Le protocole présenté ici combine les avantages d'une ventilation mécanique hautement reproductible et extrêmement brève avec l'unBSENCE de traitement enzymatique, ce qui conduit à des suspensions cellulaires de bonne qualité qui peuvent être utilisés pour l'analyse de cytométrie de flux et tri ^4, et les études d'expression génique pensées ^9.

Protocole

1. Préparation des suspensions cellulaires

1. Sacrifiez le spécimen à être utilisés suivant les recommandations des comités spécialisés tels que IACUC ou équivalent (en Uruguay, Commission nationale pour l'expérimentation animale [CNEA]). Dans notre cas, une surdose de pentobarbital a été administré.
2. Disséquer les testicules en suivant les procédures normales approuvées et les placer dans un verre 96 mm boîte de Pétri sur la glace, contenant 10 ml de DMEM glacée complété avec 10% de sérum de veau foetal.
3. Retirez la tunique albuginée et couper les testicules décapsulés en morceaux carrés de 2 - 3 mm de chaque côté.
4. Ces pièces sont ensuite traitées dans un Medimachine, un broyeur mécanique automatisé où le tissu est ventilé à l'intérieur d'un appareil jetable contenant un écran en acier inoxydable perforé et un rotor en métal. Pour ce faire, placer 1 ml de DMEM complété froid et 4-5 de ces pièces dans une unité de 50 um jetable, allumez le disaggregator et processus pendant 50 s suivant les instructions simples du fabricant.
5. Récupérer la suspension cellulaire obtenue à partir de l'unité de ventilation à l'aide d'une 3-5 ml seringue sans aiguille.
6. Filtrer à travers un maillage de 50 um nylon, préalablement trempée avec 0,5 ml de DMEM complété.
7. Filtrer la suspension à nouveau en utilisant une imbibé 25 um filet de nylon, et le placer sur la glace.
8. Comptez dans une chambre Neubauer et ajuster la concentration cellulaire à 1 - 2 x 10 ⁷ cellules / ml avec DMEM complété. Au moins 4 x 10 ⁷ cellules / gramme de matière testicules sont généralement obtenus.
9. Enfin, ajouter NDA (2-naphtol-6 ,8-disulfonique, sel dipotassique) à une concentration finale de 0,2% afin d'empêcher l'agglutination des cellules.
10. En option: vérifier la viabilité cellulaire des suspensions cellulaires testiculaires avec un kit de viabilité disponible dans le commerce pour les cellules animales, en suivant les instructions du fabricant.

2. Flux cytométrie

ve_content "> Nous avons utilisé une Becton-Dickinson FACSVantage cytomètre de flux équipé d'un laser à ions argon cohérent accordé à émettre à 488 nm pour l'analyse des cellules colorées avec de fortes concentrations d'iodure de propidium (PI). (La question de la PI entrée en non fixée cellules sous contrainte a été abordée ailleurs ^9,10).

1. Pour PI coloration, ajouter fluorochrome à une concentration finale de 50 pg / ml de la suspension cellulaire, et incuber pendant 10 min à 0 ° C dans l'obscurité.
2. Puissance du laser est fixée à 100 mW et un filtre passe-575/26 bande est utilisée pour recueillir PI-fluorescence émise en LV2.
3. Nous effectuons des mesures FC avec une buse de 70 um. Pour trier les populations spermatocytes, réglez le mode de tri en mode Normal-R ou Normal-C, en utilisant 3 gouttes triés comme enveloppe. Garder l'échantillon et les tubes de collecte à 3 - 4 ° C en utilisant une unité de réfrigération. Ajuster différentiel de l'échantillon à analyser des cellules à une vitesse de 500 à 1 500 par seconde.
4. Utilisez un logiciel CellQuest (BD) pour analyserles paramètres suivants: diffusion vers l'avant (FSC-H); diffusion latérale (SSC-H); fluorescence émise totale ou pulse-zone (FL2-A), et la durée de l'émission de fluorescence ou de largeur d'impulsion (FL2-W).

Sinon, nous avons utilisé le colorant vital Hoechst 33342 à une concentration finale de 5 pg / ml et incubé pendant 10 min à 37 ° C dans l'obscurité. l'analyse des cellules a été effectuée au moyen d'un cytomètre MoFlo (Dakocytomation) équipés d'une excitation UV de longueur d'onde laser fonctionnant à 25 mW et en utilisant une buse de 70 um. Manipulation des données a été réalisée avec le logiciel Summit v4.3 (DakoCytomation).

Résultats

Un exemple d'une suspension de cellules bien ventilées à partir de testicules de rats préparés avec le protocole décrit ici est illustré à la figure 1.

En comparaison avec les traitements enzymatiques ^6,8 et à des méthodes de désagrégation mécanique décrit précédemment ^2, celui présenté ici est beaucoup plus rapide, nécessite moins de manipulation, est facilement reproductible (non opérateur-dépendant), et rend les débris de cel...

Discussion

La méthode décrite ici optimisé permet la préparation de suspensions de cellules de rongeurs tissu testiculaire d'une manière très rapide et reproductible, en évitant un traitement enzymatique et de détergent et de maintenir une bonne intégrité cellulaire et les proportions de types. La brièveté de la procédure (la durée de 15 minutes comprend dissection des testicules, la découpe des tissus, et la transformation), manipulations nécessaires sont minimales, et l'absence de traitements enzymatiques...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of Reagent/Material	Company	Catalogue Number	Comments
Medimachine system	BD	340587
Medicon unit (50 μm)	BD	340591
Filcon unit (50 μm)	BD	340603
DMEM	Gibco	430-2100
Fetal calf serum	PAA	A11-151
NDA	Chemos BmbH	277081
Hoechst 33342	Sigma-Aldrich	14533	Stock solution 5 mg/ml; used at a final concentration of 5 μg/ml
Propidium iodide	Sigma-Aldrich	287075	Stock solution 1 mg/ml; used at a final concentration of 50 μg/ml