Testis Hücre Cezalı Hazırlanması için basit ve Verimli Tekniği

Özet

Enzimler ve deterjan kaçınarak kemirgen malzemeden testis hücre süspansiyonları, mekanik hazırlanması için bir yeni protokol tarif edilmektedir. Yöntem çok basit, hızlı, tekrarlanabilir ve akış sıralama ve RNA ekstraksiyon için uygun kaliteli hücre süspansiyonları, vermektedir.

Özet

Memeli testis somatik testis hücreleri ve eşey hücrelerinde farklı aşamalarında dahil olmak üzere 30 farklı hücre tipleri, içeren çok karmaşık organlardır. Bu heterojenlik sperm gelişimi belirli aşamalarında saf ya da zenginleştirilmiş hücre popülasyonlarının en moleküler analizler ¹ için gerekli olduğu gibi, memeli spermatogenez üsleri, çalışmaları ile ilgili önemli bir sorun var.

Bu Staput ^2,3, santrifüj elutrasyon ^1, ve akış sitometri gibi çeşitli stratejileri (FC) ^4,5 diferansiyel gen ekspresyon çalışmaları sağlamak amacıyla zenginleştirilmiş ya da saflaştırılmış testiküler hücre popülasyonlarının elde etmek için kullanılmıştır.

Bu hücrelerin en zenginleştirme / saflaştırma yaklaşımlar için süspansiyon içinde olduğu gereklidir. İdeal olarak, hücre süspansiyonu orijinal dokunun temsili olacak, canlı hücreler ve az multinucleates yüksek bir oranda olması - çünkü şekline eğilimindedirve eksikliği hücre kümeleri ¹ - seminifer epitel ^6,7 sinsisyal doğası. Önceki raporlar sadece mekanik yöntemle hazırlanan testiküler hücre süspansiyonları tripsinize olanlar ^1'den daha kolay clumped olduğunu kanıtladığı vardı. RNases ve / veya tripsin ve belirli alt uygulamalar için istenmeyen belirli makromoleküller bozulma, kollajenaz gibi kurşun ayırmak enzimler ile diğer yandan, enzimatik işlemlerin. İdeal süreci, mRNA gibi ilgi makromoleküllerin iyi bir koruma elde edilmesi amacıyla, mümkün olduğunca kısa ve minimal manipülasyon içermelidir. Katı dokulardan hücre süspansiyonlarının hazırlanması için mevcut protokoller genellikle zaman alan ve yüksek operatöre bağlı olan ve seçici olarak belirli bir hücre tipi ^1,8 zarar verebilir.

Burada sunulan protokol bir ile son derece tekrarlanabilir ve son derece kısa bir mekanik ayrıştırma avantajlarını birleştirirAkış sitometrik analizi ve sıralama ⁴ ve art gen ekspresyon çalışmaları ⁹ için kullanılabilecek iyi kalitede hücre süspansiyonları yol açan enzimatik tedavi bsence.

Protokol

1. Hücre süspansiyonlarının hazırlanması

1. Bu IACUC veya eşdeğeri olarak özel komitelerin önerileri takip kullanılacak örnek Sacrifice (Uruguay, Ulusal Komisyonu Hayvan Deney için [CNEA]). Bizim durumumuzda, pentobarbital aşırı dozda uygulandı.
2. Onaylı Standart prosedürler takip testis ayır ve buz gibi soğuk 10 mi DMEM içeren, buz üzerinde bir 96 mm cam petri tabağına yerleştirin,% 10 fetal dana serumu ile desteklenmiştir.
3. Tunika albuginea çıkarın ve 2 kare parçalar halinde Decapsulated testis kesmek - Her iki tarafta 3 mm.
4. Bu parçalar daha sonra bir Medimachine, doku bir delikli paslanmaz çelik ekran ve bir metal rotor içeren bir tek birim içinde ayrıştırılmış bir otomatik mekanik taşlama işlenir. 50 mikron tek birim, disaggregator açın ve süreç içinde bu parçaları 5 - Bunu yapmak için, soğuk yerine 1 ml DMEM ve 4 takviye üreticisinin basit yönergeleri izleyerek 50 sn.
5. Iğne olmadan 5 ml şırınga - 3 kullanarak ayrıştırma ünitesinden çıkan hücre süspansiyonu kurtarın.
6. 0.5 ml DMEM takviye ile daha önce ıslatılmış 50 mikron naylon örgü, süzülmeye.
7. Bir batırılmış 25 mikron naylon örgü, ve buz üzerinde yer kullanarak tekrar süspansiyon filtre.
8. Bir Neubauer odasında saymak ve 1 ile hücresel konsantrasyonu ayarlayın - 2 x 10 ⁷ hücre / ml desteklenmiş DMEM ile. En az 4 x 10 ⁷ hücre / testis malzemesinin gramı Ortalama elde edilir.
9. Son olarak, hücre topaklanma önlemek için% 0.2 'lik nihai bir konsantrasyona kadar (2-naftol-6 ,8-disülfonik asit, dipotasyum tuzu) NDA ekleyin.
10. İsteğe bağlı: Üreticinin talimatları izleyerek, hayvan hücreleri için bir ticari canlılığı kiti ile testis hücre süspansiyonları hücre canlılığı kontrol edin.

2. Akış Sitometrik Analizi

ve_content "> Biz propidyum iyodür yüksek konsantrasyonlarda (PI) ile lekeli hücrelerin analizi için 488 nm dalga boyunda yayan ayarlı bir Coherent argon iyon lazer ile donatılmış, bir Becton-Dickinson FACSVantage akış sitometresi kullandık. (sabitlenmemiş içine PI giriş sorunu stres altında hücreleri) başka bir yerde ^9,10 ele alınmıştır.

1. PI boyama için, 50 hücre süspansiyonu ug / ml 'lik bir son konsantrasyonda florokrom ekleyin ve 0 ° C'da 10 dakika ° C'de karanlıkta inkübe edin.
2. Lazer gücü 100 mW ve 575/26 bant geçiren filtre FL2 PI-yayılan floresan toplamak için kullanılır ayarlanır.
3. Biz bir 70 mikron nozul ile FC ölçümleri. Spermatosit nüfus sıralama için, zarf olarak 3 sıralama kriteri damla kullanarak, Normal-R veya Normal-C modunda sıralama ayarlayın. 3 de örnek ve toplama tüpleri tutun - 4 ° C soğutma ünitesi kullanarak. Saniyede 1.500 500 oranında hücreleri analiz etmek için örnek diferansiyel ayarlayın.
4. Analiz etmek CellQuest yazılım (BD) kullanınAşağıdaki parametreleri: forward scatter (FSC-H); tarafında dağılım (SSC-H), toplam yayılan floresan veya darbe alan (FL2-A) ve floresan emisyon veya darbe genişliği (FL2-W) süresi.

Alternatif olarak, 5 mg / ml 'lik bir nihai konsantrasyona kadar önemli bir boya Hoechst 33342 kullanılan ve 37 dakika 10 ° C'de karanlıkta inkübe var. Hücre analizi bir MoFlo Sitometreyi (DakoCytomation) aracılığıyla 25 mW bir UV dalgaboyu lazer çalışma ile donatılmış ve 70 mikron nozul kullanılarak yapılmıştır. Veri işleme Zirvesi v4.3 yazılımı (DakoCytomation) ile yapıldı.

Sonuçlar

Burada tarif edilen protokol ile hazırlanan fare testis, iyi ayrıştırılmış hücre süspansiyonu, bir örneği Şekil 1'de gösterilmiştir.

Enzimatik tedavi ^6,8 ve daha önce açıklanan mekanik ayrıştırma yöntemleri ² ile karşılaştırıldığında, burada sunulan bir (özellikle diğer mekanik göre, çok daha hızlı daha az işleme içerir, (değil operatöre bağlı) kolayca tekrarlanabilir ve kıt hücre artıkları vermektedir y?...

Tartışmalar

Burada açıklanan optimize yöntemi enzim ve deterjan tedavi kaçınarak ve iyi hücre bütünlüğü ve tipi oranlarını koruyarak, çok hızlı ve tekrarlanabilir bir şekilde kemirgen testis dokusundan hücre süspansiyonları hazırlanması sağlar. Prosedürü (15 dakika süresi testis diseksiyonu, doku kesme ve işleme dahil), yer az işleme ve enzimatik tedavilerin yokluğu kısalık en önemli avantajlarından bazılarıdır. Tüm bu orijinal hücre popülasyonu bulunan bileşiklerin temsil eden bir örneklem ...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of Reagent/Material	Company	Catalogue Number	Comments
Medimachine system	BD	340587
Medicon unit (50 μm)	BD	340591
Filcon unit (50 μm)	BD	340603
DMEM	Gibco	430-2100
Fetal calf serum	PAA	A11-151
NDA	Chemos BmbH	277081
Hoechst 33342	Sigma-Aldrich	14533	Stock solution 5 mg/ml; used at a final concentration of 5 μg/ml
Propidium iodide	Sigma-Aldrich	287075	Stock solution 1 mg/ml; used at a final concentration of 50 μg/ml