Tecnica semplice ed efficace per la preparazione delle sospensioni cellulari testicolari

Riepilogo

Un nuovo protocollo per la preparazione meccanica di sospensioni di cellule testicolari di materiale roditore, evitando enzimi e detergenti, è descritto. Il metodo è molto semplice, veloce, riproducibile, e rende sospensioni cellulari di buona qualità, che sono adatti per il flusso di smistamento e l'estrazione di RNA.

Abstract

Testicoli di mammiferi sono organi molto complessi che contengono più di 30 diversi tipi di cellule, tra cui le cellule somatiche testicolari e le diverse fasi di cellule germinali. Questa eterogeneità è un importante svantaggio riguarda lo studio delle basi della spermatogenesi mammiferi, poiché sono necessari popolazioni pure o arricchito di cellule in determinate fasi dello sviluppo sperma per la maggior parte delle analisi molecolari ^1.

Strategie diverse quali Staput ^2,3, elutriazione centrifuga ^1, e citometria a flusso (FC) ^4,5 sono stati impiegati per ottenere popolazioni di cellule testicolari arricchiti o purificata per consentire studi di espressione genica differenziale.

E 'necessario che le celle siano in sospensione per la maggior parte degli approcci arricchimento / purificazione. Idealmente, la sospensione cellulare sarà rappresentativo del tessuto originale, hanno una elevata percentuale di cellule vitali e poche multinucleates - che tendono a formare a causa dellanatura sinciziale dell'epitelio seminifero ^6,7 - e grumi di cellule mancanza ^1. I rapporti precedenti hanno evidenziato che le sospensioni di cellule testicolari preparati da un metodo esclusivamente meccanico aggregata più facilmente di quelli trypsinized ^1. D'altra parte, trattamenti enzimatici con RNasi e / o disaggregazione enzimi come tripsina e collagenasi porterebbe al degrado macromolecole specifico, che è indesiderabile per determinate applicazioni a valle. Il processo ideale dovrebbe essere il più breve possibile e coinvolgere manipolazione minima, in modo da realizzare una buona conservazione delle macromolecole di interesse come mRNA. Protocolli attuali per la preparazione di sospensioni cellulari da tessuti solidi sono solitamente richiede tempo, fortemente operatore-dipendente, e possono danneggiare selettivamente alcuni tipi di cellule ^1,8.

Il protocollo presentato qui combina i vantaggi di una disaggregazione meccanica altamente riproducibile ed estremamente breve con l'unabsence di trattamento enzimatico, portando a sospensioni cellulari di buona qualità che possono essere usati per l'analisi di citometria di flusso e di smistamento ^4, e ulteriori studi di espressione genica ^9.

Protocollo

1. Preparazione delle sospensioni cellulari

1. Sacrifica il campione da utilizzare secondo le raccomandazioni delle commissioni specializzate, come IACUC o equivalente (in Uruguay, Commissione nazionale per la sperimentazione animale [CNEA]). Nel nostro caso, una overdose di pentobarbital è stato somministrato.
2. Sezionare i testicoli seguenti procedure approvate standard e metterli in un bicchiere Petri 96 millimetri sul ghiaccio, contenente 10 ml di ghiacciata DMEM supplementato con siero fetale di vitello al 10%.
3. Rimuovere la tunica albuginea e tagliare i testicoli decapsulati in pezzi quadrati di 2-3 mm su ogni lato.
4. Quei pezzi vengono poi trattati in un Medimachine, un macinino meccanico automatizzato in cui il tessuto è disaggregato all'interno di una unità monouso contenente uno schermo di acciaio inossidabile perforato e un rotore metallo. Per fare ciò, posto 1 ml di DMEM integrato freddo e 4-5 di questi pezzi in una unità di 50 micron e getta, interruttore sul disaggregator, e il processo di per 50 sec seguendo le semplici istruzioni del produttore.
5. Recuperare la sospensione risultante cellula dall'unità utilizzando una disaggregazione 3-5 ml siringa senza ago.
6. Filtrare su un 50 micron nylon mesh, precedentemente ammollato con 0,5 ml DMEM integrato.
7. Filtrare nuovamente la sospensione con una inzuppato 25 micron nylon mesh, e posto sul ghiaccio.
8. Contare in una camera di Neubauer e regolare la concentrazione cellulare di 1-2 x 10 ⁷ cellule / ml con DMEM integrato. Almeno 4 x 10 ⁷ cellule / grammo di materiale testicolo sono solitamente ottenuti.
9. Infine, aggiungere NDA (2-naftolo-6 ,8-disolfonico acido, sale dipotassico) ad una concentrazione finale di 0,2%, al fine di evitare grumi cella.
10. Optional: verificare la vitalità cellulare delle sospensioni di cellule testicolari con un kit disponibile in commercio per la vitalità delle cellule animali, seguendo le istruzioni del produttore.

2. Mediante citometria a flusso

ve_content "> Abbiamo utilizzato un Becton-Dickinson FACSVantage citofluorimetro dotato di un laser a ioni argon Coherent sintonizzati per emettere a 488 nm per l'analisi di cellule colorate con elevate concentrazioni di ioduro di propidio (PI). (La questione di ingresso PI in unfixed cellule sotto stress è stato affrontato altrove ^9,10).

1. Per PI colorazione, aggiungere fluorocromo ad una concentrazione finale di 50 mg / ml di sospensione cellulare, e incubare per 10 min a 0 ° C al buio.
2. Potenza del laser è impostato a 100 mW e un filtro passa-banda 575/26 viene utilizzato per raccogliere PI-emessa fluorescenza in FL2.
3. Eseguiamo misurazioni FC con un ugello di 70 micron. Per l'ordinamento popolazioni spermatociti, impostare la modalità di ordinamento in Normal-R o Normal-C, con 3 gocce classificate come busta. Mantenere campione e tubi di raccolta a 3 - 4 ° C utilizzando una unità di refrigerazione. Regolare differenziale campione da analizzare le cellule ad una velocità di 500 a 1500 per secondo.
4. Utilizzare software CellQuest (BD) per analizzarei seguenti parametri: forward scatter (FSC-H); side scatter (SSC-H); fluorescenza totale emessa o impulso-zona (FL2-A), e la durata di emissione di fluorescenza o di larghezza di impulso (FL2-W).

Alternativamente, abbiamo impiegato il colorante vitale Hoechst 33342 per una concentrazione finale di 5 pg / ml e incubate per 10 min a 37 ° C al buio. Analisi delle cellule è stata eseguita mediante un citometro MoFlo (Dako) provvisti di eccitazione UV di lunghezza d'onda del laser funzionante a 25 mW e utilizzando un ugello di 70 micron. Manipolazione dei dati è stata effettuata con il software Summit v4.3 (Dako).

Risultati

Un esempio di una sospensione cellulare ben disaggregata da testicoli di ratto preparate con il protocollo qui descritto è mostrato in Figura 1.

In confronto ai trattamenti enzimatici ^6,8 e precedentemente descritti metodi di disaggregazione meccanici ^2, quello qui presentato è molto più veloce, comporta meno manipolazione, è facilmente riproducibile (non operatore-dipendente), e rende detriti cellulari scarsi (soprattutto rispetto ad altri meccanic...

Discussione

Il metodo qui descritto ottimizzato consente la preparazione di sospensioni di cellule da tessuto testicolare roditore in modo molto veloce e riproducibile, evitando enzima e detersivo trattamento e mantenere una buona integrità delle cellule e di tipo proporzioni. La brevità della procedura (il minimo campata 15 include la dissezione testicolo, il taglio dei tessuti, e la lavorazione), una minima manipolazione coinvolto, e l'assenza di trattamenti enzimatici sono alcuni dei principali vantaggi. Tutti questi sareb...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of Reagent/Material	Company	Catalogue Number	Comments
Medimachine system	BD	340587
Medicon unit (50 μm)	BD	340591
Filcon unit (50 μm)	BD	340603
DMEM	Gibco	430-2100
Fetal calf serum	PAA	A11-151
NDA	Chemos BmbH	277081
Hoechst 33342	Sigma-Aldrich	14533	Stock solution 5 mg/ml; used at a final concentration of 5 μg/ml
Propidium iodide	Sigma-Aldrich	287075	Stock solution 1 mg/ml; used at a final concentration of 50 μg/ml