고환 세포 현탁액의 준비를 위해 간단하고 효율적인 기술

요약

효소 세제를 피 설치류 자료에서 고환 세포 현탁액의 기계적 준비를위한 새로운 프로토콜이 설명되어 있습니다. 방법은 매우 간단하고 빠르고, 재현성 및 흐름 정렬 및 RNA 추출에 적합한 좋은 품질의 세포 현탁액을 렌더링합니다.

초록

포유류의 고환은 체세포 고환 세포와 생식 세포의 여러 단계를 포함하여 30 개 이상의 서로 다른 세포 유형을 포함 매우 복잡한 기관이다. 이 이질성은 정자 발달의 특정 단계에서 순수한 농축 세포 인구는 대부분의 분자 분석 ¹ 필요에 따라, 포유류의 정자의 기초 연구에 관한 중요한 단점이다.

같은 Staput ^2,3, 원심 elutriation ¹ 및 유동 세포 계측법 등 다양한 전략 (FC) ^4,5는 차동 유전자 발현 연구를 활성화하기 위해 농축 또는 정제 고환 세포 인구를 얻기 위해 사용되어왔다.

이것은 세포가 가장 농축 / 정제 방법에 대한 정학 것을 요구된다. 이상적으로, 세포 현탁액은 원래의 조직을 대표하고, 가능한 세포와​​ 몇 multinucleates의 비중이 높은 때문에 -의 형성 경향이그리고 부족한 세포 대단히 짧은 시간 ¹ - 정액 상피 ^6,7의 세포 융합 성격. 이전 보고서는 독점적 기계적 방법에 의해 제조 고환 세포 현탁액은 트립신 사람 ^1보다 더 쉽게 응집 것을 입증했다. RNAses 및 / 또는 트립신 및 특정 스트림 애플리케이션에 바람직하지 않은 특정 고분자 분해에 콜라 리드와 같은 분해하는 효소 반면에, 효소 처리. 이상적인 프로세스는 mRNA가 같은 관심 고분자의 좋은 보존을 달성하기 위하여 가능한 한 짧아야하며 최소한의 조작을 포함해야한다. 단단한 조직에서 세포 현탁액의 준비를위한 현재 프로토콜은 일반적으로 시간이 걸리는 매우 연산자에 의존하고, 선택적으로 특정 세포 유형에게 ^1,8가 손상 될 수 있습니다.

여기에 제시 프로토콜과 높은 재현성 매우 간단한 기계 세분화의 이점을 결합유세포 분석 및 정렬 ⁴ 및 꿍꿍이 유전자 발현 연구 ^9에 사용할 수있는 좋은 품질의 세포 현탁액을 선도하는 효소 치료의 bsence.

프로토콜

1. 세포 현탁액의 준비

1. 이러한 IACUC 또는 동급으로 전문위원회의 권고에 따라 사용할 시편을 희생 (우루과이, 국가위원회의 동물 실험에 대한 [CNEA]). 우리의 경우, 펜 토바 비탈의 과량이 투여되었다.
2. 표준 승인 절차에 따라 고환을 해부하고 얼음처럼 차가운 DMEM 10 ML을 포함, 얼음 96mm 유리 페트리 접시에 배치 10 % 소 태아 혈청과 보충.
3. 투 니카 albuginea을 제거하고 2 사각형 조각으로 캡슐화가 고환을 잘라 - 양쪽에 3mm.
4. 그 조각은 다음 Medimachine, 조직이 뚫린 스테인리스 스크린과 금속 회 전자를 포함하는 일회용 기기 내부에 세분화 된 자동 기계 분쇄기로 처리됩니다. 50 μm의 일회용 단위 disaggregator에 스위치 및 프로세스에서 이러한 조각 중 1 - 5 이렇게하려면, 감기의 장소 1 ML은 DMEM 4를 보충 제조업체의 간단한 지침에 따라 50 초합니다.
5. 바늘없이 5 ML의 주사기 - 3을 사용하여 세분화 장치에서 결과 세포 현탁액을 복구 할 수 있습니다.
6. 0.5 밀리리터 DMEM을 보충와 이전에 담가 50 μm의 나일론 메쉬를 통해 필터링합니다.
7. 젖은 25 μm의 나일론 메쉬, 얼음에 장소를 사용하여 다시 현탁액을 필터링합니다.
8. 네우 바우 챔버에서 셀을 1로 세포 농도를 조정 - 2 × 10 ⁷ 세포 / ML DMEM 배지로. 적어도 4 X 10 ⁷ 세포 / 고환 물질의 그램은 일반적으로 얻을 수 있습니다.
9. 마지막으로, 세포 응집을 방지하기 위해 0.2 %의 최종 농도 (2 - 나프톨 -6,8 - 디 술폰산, 칼륨 염) NDA를 추가합니다.
10. 선택 사항 : 제조업체의 지침에 따라, 동물 세포 시중에서 생존 키트와 함께 고환 세포 현탁액의 세포 생존을 확인합니다.

2. 유세포 분석

ve_content "> 우리의 propidium 요오드의 높은 농도 (PI)로 염색 세포의 분석을 위해 488 nm에서 방출하는 조정 일관된 아르곤 이온 레이저를 장착 한 벡톤 - 디킨슨 FACSVantage 흐름 cytometer에를 사용했습니다. (고정되지 않은에 PI 입구의 문제 스트레스 세포) 다른 ^9,10 해결되었습니다.

1. PI 염색을위한 50 세포 현탁액에 μg / ML의 최종 농도에서 형광을 추가하고, 0시 10 분 ° 어둠 속에서 C에 대해 품어.
2. 레이저 전력은 100 mW의 및 26분의 575 밴드 패스 필터가 FL2에서 PI-방출 ​​형광을 수집하는 데 사용됩니다로 설정됩니다.
3. 우리는 70 μm의 노즐 FC 측정을 수행합니다. spermatocyte 인구를 정​​렬, 봉투로 3 분류 방울을 사용하여 일반-R 또는 Normal-C 모드에서 정렬을 설정합니다. 3시 샘플 및 수집 튜브를 유지 - 4 ° C에 냉동 장치를 사용하여. 초당 1,500 ~ 500의 속도로 세포를 분석 할 시료 차이를 조정합니다.
4. 분석하는 CellQuest 소프트웨어 (BD)를 사용하여다음 매개 변수 : 앞으로 분산 형 (FSC-H), 측면 산란 (SSC-H), 총 방출 형광 또는 펄스 면적 (FL2-A) 및 형광 방출 또는 펄스 폭 (FL2-W)의 기간.

또한, 우리는 5 μg / ML의 최종 농도에 중요한 염료 훽스트 33342을 고용하고 37 10 분 ° 어둠 속에서 C 동안 배양했다. 세포 분석은 MoFlo cytometer에 (DakoCytomation)를 통해 25 mW의에서 UV 여기 파장 레이저 운영을 탑재 해, 70 μm의 노즐을 사용하여 수행 하였다. 데이터 조작은 정상 V4.3 소프트웨어 (DakoCytomation)로 수행 하였다.

결과

여기에 설명 된 프로토콜을 준비 쥐의 고환에서 잘 분해 된 세포 현탁액의 예는 그림 1에 표시됩니다.

효소 치료 ^6,8에 이전에 설명한 기계 세분화 방법 ^2에 비해, 여기에 제시 한 (특히 다른 기계에 비해 훨씬 빠릅니다 적은 처리를 포함, (NOT 연산자에 의존) 쉽게 재현하고 부족한 세포 파편을 렌더링 방법)과 거의 multinucleates (광범위한 조직 조작

토론

여기에 설명 된 최적화 방법은 효소 세제 치료를 피하고 좋은 세포 무결성 및 유형 비율을 유지, 매우 빠르고 재현성 방식으로 쥐 고환 조직에서 세포 현탁액의 준비를 할 수 있습니다. 절차 (15 분 스팬 고환 해부, 조직의 절단 및 가공 포함), 관련 최소한의 처리 및 효소 치료의 부재의 간결함은 주요 장점 중 일부입니다. 이러한 모든 원래의 세포 인구에 존재하는 물질의 대표 샘플이 필요할 때 중...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of Reagent/Material	Company	Catalogue Number	Comments
Medimachine system	BD	340587
Medicon unit (50 μm)	BD	340591
Filcon unit (50 μm)	BD	340603
DMEM	Gibco	430-2100
Fetal calf serum	PAA	A11-151
NDA	Chemos BmbH	277081
Hoechst 33342	Sigma-Aldrich	14533	Stock solution 5 mg/ml; used at a final concentration of 5 μg/ml
Propidium iodide	Sigma-Aldrich	287075	Stock solution 1 mg/ml; used at a final concentration of 50 μg/ml