A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
Method Article
كيف يتم إنشاء شبكات الخلايا العصبية في الدماغ الجنينية هي المسألة الأساسية في علم الأعصاب التنموي. هنا نحن الجمع بين تقنية electroporation مع الأدوات الوراثية الرواية، مثل لجنة المساواة العرقية / السلمون المدخن، البلازميدات وPiggyBac بوساطة نظام تبديل الحمض النووي في الدماغ المؤخر الطيور لتسمية interneurons الظهرية وتتبع التوقعات محور عصبي والأهداف متشابك في مراحل النمو المختلفة.
Electroporation من الفرخ الجنينية الأنبوب العصبي لديه العديد من المزايا مثل أن تكون سريعة وفعالة للتعبير عن الجينات الغريبة إلى خلايا العصبية. في هذا المخطوط ونحن نقدم الأسلوب الذي يوضح كيف فريد ل electroporate DNA في الدماغ المؤخر الطيور في E2.75 من أجل تسمية على وجه التحديد مجموعة فرعية من الخلايا العصبية الأسلاف، وكيفية متابعة اسقاطاتها محور عصبي والأهداف متشابك في مراحل متقدمة بكثير من التنمية، حتى E14.5. لقد استخدمت الأدوات الوراثية الرواية بما في ذلك عناصر محددة محسن، لجنة المساواة العرقية / السلمون المدخن - البلازميدات مقرها ونظام تبديل الحمض النووي PiggyBac بوساطة لدفع التعبير GFP في نوع فرعي من خلايا الدماغ المؤخر (الظهرية معظم فرعية من interneurons، DA1). يتم اتباع مسارات وأهداف DA1 المحاور محور عصبي في المراحل الجنينية المبكرة والمتأخرة في مناطق الدماغ المختلفة. تساهم هذه الاستراتيجية التقنيات المتقدمة لاستهداف خلايا من الفائدة في الدماغ المؤخر الجنينية ولهيئة تنظيم الاتصالاتالوراثة تشكيل الدوائر في مراحل متعددة من التنمية.
الدماغ المؤخر يمثل محور التتابع مفتاح في الجهاز العصبي من خلال التواصل بين الجهاز العصبي المركزي والمحيطي عبر الصعود والنزول الشبكات العصبية. وينظم الوظائف الأساسية بما في ذلك التنفس، والوعي، والسمع، والحركية التنسيق 1-3. أثناء التطور الجنيني المبكر، وينقسم الدماغ المؤخر الفقاريات عابر على طول لها الأمامي الخلفي (AP) في محور rhombomeres المتكررة، التي تتشكل أنواع الخلايا العصبية متميزة ومتعددة المراكز توليد نوى الدماغ 4. وينقسم الدماغ المؤخر أيضا جنبا إلى جنب في الظهري البطني (DV) محور في لوحة القاعدية والجناحية، الذي الأسلاف العصبية المنفصلة تصبح المحدد وتفرق في مواقع متميزة DV 3،5،6. كيف أوائل AP وDV-محددة أنماط الخلايا العصبية هي التي تنظم إنشاء circuitries الدماغ وظيفية غير معروف إلى حد كبير.
لاكتساب المعرفة الأساسية في هذاالسؤال، هناك حاجة إلى أدوات من أجل تسمية مجموعات فرعية معينة من الخلايا العصبية في الدماغ المؤخر المبكر وتتبع مساراتها محور عصبي والاتصال في مراحل أكثر تقدما. لقد استخدمت سابقا محسن عناصر محددة، ونظام التعبير الشرطي لجنة المساواة العرقية / المستندة إلى LoxP لتتبع مسار محور عصبي من interneurons العمود الفقري الظهري في جنين الفرخ المبكر 7-9. في المخطوطة الحالية قمنا استهدفت الدماغ المؤخر وترقية النموذج التجريبي لوصفها في وقت متأخر interneurons الدماغ المؤخر الجنينية، محاور عصبية وأهدافهم متشابك، وذلك باستخدام استراتيجية electroporation تعديل وPiggyBac - تبديل الحمض النووي بوساطة. يسمح لدينا استراتيجية جديدة لوضع علامات على أنواع فرعية متميزة العصبية في جانب واحد من الدماغ المؤخر وتتبع اسقاطاتها محور عصبي ومواقع متشابك في مختلف المراحل الجنينية، في الفترة من 2 إلى 12 يوما التالية electroporation. وبناء على هذه الطريقة، ونحن وصفت الظهري معظم فرعية من interneurons الدماغ المؤخر (dA1/Atoh1 + الخلايا) وكشفت اثنين المقابل تصاعدي أنماط الإسقاط محور عصبي، كل يستمد من موقع AP مختلفة، ويستطيل في الحبلة متميزة. تم العثور على DA1 محاور عصبية إلى المشروع ونقاط الاشتباك العصبي في شكل السمعية نوى، والدماغ المتوسط في طبقات متعددة من المخيخ 10.
مزيج من فرخ electroporation، تتبع الوراثية من الخلايا العصبية وتحليل مواقع الإسقاط في مراحل متقدمة بكثير من التنمية توفر منصة فريدة لدراسة تشكيل شبكات الخلايا العصبية في الدماغ وإلى توضيح الآليات الجزيئية التي تتحكم في تشكيل الدوائر.
1. Electroporation الدماغ المؤخر
1.1 التعامل مع البيض
1.2 التحضيرات
1.3 النوافذ، حقن و Electroporation
2. تحليل الأجنة
2.1 شقة جبل إعداد والمناعي
2.2 البرد أقسام والمناعي
وقد استخدم هذا البروتوكول مؤخرا للكشف عن أنماط محور عصبي ومواقع الإسقاط من DA1 فرعية من interneurons في الدماغ المؤخر كتكوت 10. لتسمية تحديدا هذه المحاور، تم تأكيد عنصر محسن (Atoh1)، الذي سبق وصفها بأنها محددة لالشوكي الخلايا العصبية DI1 8،12،13، أن أعرب في الدماغ ال?...
electroporation في البيضة هو أداة مجدية وموثوقة، وفعالة لفحص مواصفات الخلية والتوجيه محور عصبي خلال كتكوت تطوير الجهاز العصبي 20. في هذا البروتوكول ونحن تصف طريقة electroporation في الدماغ المؤخر فرخ في E2.75 باستخدام عناصر محسن التي تمكن من وضع العلامات الشرطية interneurons محد...
أي تضارب في المصالح.
نشكر الدكتور يوفال درور لغوتليب التوضيح electroporation. وأيد هذا العمل من المنح المقدمة إلى DSD من المعهد الوطني لعلم النفس الأحيائي في إسرائيل ومن برنامج Niedersachsen لإسرائيل التعاون البحثي والمنح لحزب العدالة والتنمية من مؤسسة العلوم الإسرائيلية، إن وزارة الصحة الإسرائيلية، ومركز التراث التميز في تراث شراكة العلوم الطبية الحيوية.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
L-shaped gold Genetrodes 3 mm electrodes | BTX, Harvard Apparatus | 45-0162 | |
pulse generator, ECM 830 | BTX, Harvard Apparatus | 45-0002 | |
OCT (Optimal Cutting Temperature) Compound | Tissue-Tek Sakura | 4583 O.C.T. Compound | |
Nail Polish | From Any Commercial Supplier |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved