JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

كيف يتم إنشاء شبكات الخلايا العصبية في الدماغ الجنينية هي المسألة الأساسية في علم الأعصاب التنموي. هنا نحن الجمع بين تقنية electroporation مع الأدوات الوراثية الرواية، مثل لجنة المساواة العرقية / السلمون المدخن، البلازميدات وPiggyBac بوساطة نظام تبديل الحمض النووي في الدماغ المؤخر الطيور لتسمية interneurons الظهرية وتتبع التوقعات محور عصبي والأهداف متشابك في مراحل النمو المختلفة.

Abstract

Electroporation من الفرخ الجنينية الأنبوب العصبي لديه العديد من المزايا مثل أن تكون سريعة وفعالة للتعبير عن الجينات الغريبة إلى خلايا العصبية. في هذا المخطوط ونحن نقدم الأسلوب الذي يوضح كيف فريد ل electroporate DNA في الدماغ المؤخر الطيور في E2.75 من أجل تسمية على وجه التحديد مجموعة فرعية من الخلايا العصبية الأسلاف، وكيفية متابعة اسقاطاتها محور عصبي والأهداف متشابك في مراحل متقدمة بكثير من التنمية، حتى E14.5. لقد استخدمت الأدوات الوراثية الرواية بما في ذلك عناصر محددة محسن، لجنة المساواة العرقية / السلمون المدخن - البلازميدات مقرها ونظام تبديل الحمض النووي PiggyBac بوساطة لدفع التعبير GFP في نوع فرعي من خلايا الدماغ المؤخر (الظهرية معظم فرعية من interneurons، DA1). يتم اتباع مسارات وأهداف DA1 المحاور محور عصبي في المراحل الجنينية المبكرة والمتأخرة في مناطق الدماغ المختلفة. تساهم هذه الاستراتيجية التقنيات المتقدمة لاستهداف خلايا من الفائدة في الدماغ المؤخر الجنينية ولهيئة تنظيم الاتصالاتالوراثة تشكيل الدوائر في مراحل متعددة من التنمية.

Introduction

الدماغ المؤخر يمثل محور التتابع مفتاح في الجهاز العصبي من خلال التواصل بين الجهاز العصبي المركزي والمحيطي عبر الصعود والنزول الشبكات العصبية. وينظم الوظائف الأساسية بما في ذلك التنفس، والوعي، والسمع، والحركية التنسيق 1-3. أثناء التطور الجنيني المبكر، وينقسم الدماغ المؤخر الفقاريات عابر على طول لها الأمامي الخلفي (AP) في محور rhombomeres المتكررة، التي تتشكل أنواع الخلايا العصبية متميزة ومتعددة المراكز توليد نوى الدماغ 4. وينقسم الدماغ المؤخر أيضا جنبا إلى جنب في الظهري البطني (DV) محور في لوحة القاعدية والجناحية، الذي الأسلاف العصبية المنفصلة تصبح المحدد وتفرق في مواقع متميزة DV 3،5،6. كيف أوائل AP وDV-محددة أنماط الخلايا العصبية هي التي تنظم إنشاء circuitries الدماغ وظيفية غير معروف إلى حد كبير.

لاكتساب المعرفة الأساسية في هذاالسؤال، هناك حاجة إلى أدوات من أجل تسمية مجموعات فرعية معينة من الخلايا العصبية في الدماغ المؤخر المبكر وتتبع مساراتها محور عصبي والاتصال في مراحل أكثر تقدما. لقد استخدمت سابقا محسن عناصر محددة، ونظام التعبير الشرطي لجنة المساواة العرقية / المستندة إلى LoxP لتتبع مسار محور عصبي من interneurons العمود الفقري الظهري في جنين الفرخ المبكر 7-9. في المخطوطة الحالية قمنا استهدفت الدماغ المؤخر وترقية النموذج التجريبي لوصفها في وقت متأخر interneurons الدماغ المؤخر الجنينية، محاور عصبية وأهدافهم متشابك، وذلك باستخدام استراتيجية electroporation تعديل وPiggyBac - تبديل الحمض النووي بوساطة. يسمح لدينا استراتيجية جديدة لوضع علامات على أنواع فرعية متميزة العصبية في جانب واحد من الدماغ المؤخر وتتبع اسقاطاتها محور عصبي ومواقع متشابك في مختلف المراحل الجنينية، في الفترة من 2 إلى 12 يوما التالية electroporation. وبناء على هذه الطريقة، ونحن وصفت الظهري معظم فرعية من interneurons الدماغ المؤخر (dA1/Atoh1 + الخلايا) وكشفت اثنين المقابل تصاعدي أنماط الإسقاط محور عصبي، كل يستمد من موقع AP مختلفة، ويستطيل في الحبلة متميزة. تم العثور على DA1 محاور عصبية إلى المشروع ونقاط الاشتباك العصبي في شكل السمعية نوى، والدماغ المتوسط ​​في طبقات متعددة من المخيخ 10.

مزيج من فرخ electroporation، تتبع الوراثية من الخلايا العصبية وتحليل مواقع الإسقاط في مراحل متقدمة بكثير من التنمية توفر منصة فريدة لدراسة تشكيل شبكات الخلايا العصبية في الدماغ وإلى توضيح الآليات الجزيئية التي تتحكم في تشكيل الدوائر.

Protocol

1. Electroporation الدماغ المؤخر

1.1 التعامل مع البيض

  1. وضع البيض أفقيا في حاضنة ترطيب (37-38،5 درجة مئوية). يتم electroporated الأجنة بعد 65-70 ساعة من الحضانة، عندما تصل إلى 16-17 (HH) مرحلة (25-30 somites).
  2. إزالة البيض من الحاضنة، بل البقاء في وضع أفقي.

1.2 التحضيرات

  1. سحب الزجاج الشعيرات الدموية (0.5 مم).
  2. ربط عازمة Genetrodes الذهب على شكل L أقطاب (3 مم) مع حامل محول لمولد النبض. وتشمل المعلمات Electroporation 25 فولت، 5 أرقام النبض، 45 ميللي ثانية النبض طول، 300 ميللي ثانية فترات النبض.
  3. إعداد ماصة الفم، 10 مل إبرة حقنة، شرائط parafilm، فرشاة ناعمة، ومقص تشريح حادة و 25 مل من محلول PBS العقيمة. هذا المبلغ يكفي عادة للتعامل مع علبة البيض (18 بيضة).
  4. إعداد خليط كافية من البلازميدات الحمض النووي (5 ميكروغرام / ميكرولتر لكل منهما) وإضافة حوالي 0.025٪ سريع الصبغة الخضراء لتصور حقن الحمض النووي. عادة ما يكون حجم 4 ميكرولتر كافية لحقن صينية.

1.3 النوافذ، حقن و Electroporation

  1. تنظيف قشر البيض مع الايثانول 70٪.
  2. التعامل مع بيضة واحدة في وقت واحد لتقليل الجنينية وقت التعرض للهواء.
  3. جعل ثقب في القطب البيض مع نهايات مقص وإزالة مل 3-4 من الألبومين مع الحقنة. لا تقم بإزالة كمية أكبر من الألبومين كما أنه يقلل من قدرتها على البقاء.
  4. فتح نافذة صغيرة بيضاوية (2.5 × 2 سم حجم) في مركز العليا من قشرة البيضة باستخدام مقص تشريح.
  5. بالتنقيط بضع قطرات من برنامج تلفزيوني على رأس الجنين لمنع جفاف خلال العملية برمتها.
  6. تحميل كمية صغيرة من الخليط الحمض النووي في الزجاج الشعرية باستخدام ماصة الفم.
  7. وضع الجنين مع نهاية الخلفي نحو لك. لا يلزم حقن الحبر في هذه المرحلة، ذلك لأن الجنين غير واضحة للعيان. تجنب الزيادات حقن الحبرالبقاء على قيد الحياة الجنينية. اختراق الدماغ المؤخر الذيلية من خلال عقد الشعرية في ~ 45 درجة. لا تقم بإزالة أي غشاء من حول الجنين. حقن محلول الحمض النووي بعناية في تجويف الدماغ المؤخر والزفير دون تشكيل فقاعات الهواء. حل الحمض النووي ينتشر الأمامية.
  8. مباشرة بعد حقن الحمض النووي، ووضع الأقطاب المتوازية دقيق عند AP وموقف الدماغ المؤخر DV كنت تهدف لاستهداف. دفع أقطاب البطني قليلا دون لمس قلب، لأنه قد يقلل من قدرتها على البقاء. نبض electroporator. يجب تغطية الأقطاب مع فقاعات للإشارة إلى الموصلية الكهربائية (الشكل 1A).
  9. إزالة بعناية الأقطاب وبالتنقيط بضع قطرات من برنامج تلفزيوني لتبريد الجنين وإزالة الفقاعات. ختم البيض فتح بشكل صحيح مع قطاع parafilm لمنع جفاف أثناء الحضانة. غسل أقطاب في برنامج تلفزيوني مع فرشاة ناعمة.
  10. وضع البيض في الحاضنة لمدة من الوقت المطلوب. بقاء الأجنة ما يقرب من 90٪ بعد 2-3 أيامelectroporation، ويقلل ما يصل الى 50٪ 12 أيام التالية electroporation.

2. تحليل الأجنة

2.1 شقة جبل إعداد والمناعي

  1. الاستعدادات مسطحة جبل من الدماغ المؤخر لا يمكن أن يؤديها حتى E6.5 لتصور محاور بسهولة تحت المجهر أو ستيريو المجهر.
  2. تشريح الجنين بعناية من قبل فصله من الأغشية المحيطة والأوعية الدموية. وضع الجنين في سيليكون صغيرة - المغلفة طبق بتري تحتوي على برنامج تلفزيوني. نعلق الجنين إلى الطبق مع دبابيس التنغستن تواجه ظهريا. إجراء شق ظهري في الدماغ المؤخر سقف لوحة باستخدام الزجاج الشعيرات الدموية الحادة.
  3. باستخدام الملقط حادة والمقص الصغير يعقد الجزء العلوي من الرأس وسحب الأنسجة الدماغ المؤخر بعناية فائقة من منقاري إلى الذيلية. بعد فصل الدماغ المؤخر إزالة الأنسجة بطني المتبقية للتوصل إلى إعداد نظيفة.
  4. احتضان الدماغ المؤخر مع 4٪ بارافورمالدهيد (PFA) حل للموارد البشرية 1-2 في درجة حرارة الغرفة (RT). غسل الدماغ المؤخر مع PBT (PBS/0.1٪ تريتون X-100) لإزالة PFA.
  5. لالمناعي في hindbrains محمولة على شقة إضافة 500 ميكرولتر من عرقلة الحل (5٪ من مصل الماعز في PBT واحتضان لمدة 2 ساعة على RT احتضان مع الأجسام المضادة 1 شارع ON في 4 درجات مئوية. غسل مع PBT (15 دقيقة × 3). احتضان مع 2 الأجسام المضادة الثانية لمدة 2 ساعة على RT. يغسل مع PBT (15 دقيقة × 3).
  6. وضع الدماغ المؤخر تواجه ظهريا على شريحة زجاجية. إضافة وسائط الفلورسنت تصاعد على الدماغ المؤخر. استخدام الزجاج الشعيرات الدموية أو الإبر التنغستن لشد الدماغ المؤخر على الشريحة.
  7. إضافة كمية صغيرة من الشحوم في كل زاوية لمنع الضغط من الأنسجة من قبل انزلاق الغطاء. وضع بعناية زلة تغطية على الجزء العلوي من الدماغ المؤخر وتجنب فقاعات الهواء. لتمسك إضافة طلاء الأظافر لتغطية حواف الزجاج.

2.2 البرد أقسام والمناعي

  1. البرد أجزاء من الدماغ CAغير أن يؤديها في أي مرحلة لتصور مسارات محور عصبي. حتى الآن، بعد E6.5 هذا ينبغي أن يكون الأسلوب المفضل نظرا لصعوبة تصور محاور عصبية في الجنين محمولة على شقة، والتي تصبح سميكة جدا. وعلاوة على ذلك، مظاهرة من نقاط الاشتباك العصبي يتطلب باجتزاء الأنسجة والرؤية تضخم عالية تحت المجهر.
  2. تشريح الجنين وإزالة جميع الأنسجة المحيطة بها. شطف مع برنامج تلفزيوني. قطع الجنين في الجزء الذيلية من النخاع باستخدام مقص الصغرى وملاقط حاد. جعل شق واسع بين المخيخ والدماغ المتوسط ​​وإزالة الدماغ بأكمله. يجب أن يحتوي على أنسجة النخاع، بونز والمخيخ.
  3. إصلاح الدماغ في 4٪ PFA ليلة وضحاها (ON) في 4 درجات مئوية، وشطف مع برنامج تلفزيوني (10 دقيقة × 3)، واحتضان مع 30٪ سكروز لON في 4 درجات مئوية حتى الغرق.
  4. تضمين الدماغ المؤخر في البرد القالب مع أكتوبر مركب (درجة الحرارة المثلى للقطع)، ووضعه في -20 درجة مئوية حتى تجميد، كما هو موضح في مكان آخر 11.
  5. وضع كتلة أكتوبر في ناظم البرد في محور قطاعات المطلوب. عرض المقطع هو 12 ميكرون.
  6. تجفيف الشرائح. إضافة 100 ميكرولتر حل حظر على كل شريحة لمدة 2 ساعة على RT. إضافة 100 ميكرولتر من الأجسام المضادة (مخففة في عرقلة الحل للتركيز المطلوب). فترة الحضانة لمدة 1 و 2 ش الأجسام المضادة الثاني هو ON عند 4 درجة مئوية أو 2 ساعة على RT، على التوالي. في كل مرة الحضانة، إضافة بلطف قطاع parafilm على رأس الشريحة لمنع جفاف. يغسل مع برنامج تلفزيوني (10 دقيقة × 3) بين الأجسام المضادة. إذا لزم الأمر، إضافة 1:1،000 دابي (4'-6-Diamidino-2-phenylindole)، مخففة في برنامج تلفزيوني لمدة 20 دقيقة في RT. شطف مع برنامج تلفزيوني.
  7. تركيب الشريحة مع وسائل الاعلام الفلورسنت في تصاعد مستمر. اسمحوا الجافة لمدة 1 ساعة قبل التحليل.

النتائج

وقد استخدم هذا البروتوكول مؤخرا للكشف عن أنماط محور عصبي ومواقع الإسقاط من DA1 فرعية من interneurons في الدماغ المؤخر كتكوت 10. لتسمية تحديدا هذه المحاور، تم تأكيد عنصر محسن (Atoh1)، الذي سبق وصفها بأنها محددة لالشوكي الخلايا العصبية DI1 8،12،13، أن أعرب في الدماغ ال?...

Discussion

electroporation في البيضة هو أداة مجدية وموثوقة، وفعالة لفحص مواصفات الخلية والتوجيه محور عصبي خلال كتكوت تطوير الجهاز العصبي 20. في هذا البروتوكول ونحن تصف طريقة electroporation في الدماغ المؤخر فرخ في E2.75 باستخدام عناصر محسن التي تمكن من وضع العلامات الشرطية interneurons محد...

Disclosures

أي تضارب في المصالح.

Acknowledgements

نشكر الدكتور يوفال درور لغوتليب التوضيح electroporation. وأيد هذا العمل من المنح المقدمة إلى DSD من المعهد الوطني لعلم النفس الأحيائي في إسرائيل ومن برنامج Niedersachsen لإسرائيل التعاون البحثي والمنح لحزب العدالة والتنمية من مؤسسة العلوم الإسرائيلية، إن وزارة الصحة الإسرائيلية، ومركز التراث التميز في تراث شراكة العلوم الطبية الحيوية.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
L-shaped gold Genetrodes 3 mm electrodesBTX, Harvard Apparatus45-0162
pulse generator, ECM 830BTX, Harvard Apparatus45-0002
OCT (Optimal Cutting Temperature) CompoundTissue-Tek Sakura4583 O.C.T. Compound
Nail PolishFrom Any Commercial Supplier

References

  1. Altman, J., Bayer, S. A. Development of the precerebellar nuclei in the rat: II. The intramural olivary migratory stream and the neurogenetic organization of the inferior olive. J. Comp. Neurol. 257, 490-512 (1987).
  2. Rose, M. F., Ahmad, K. A., Thaller, C., Zoghbi, H. Y. Excitatory neurons of the proprioceptive, interoceptive, and arousal hindbrain networks share a developmental requirement for Math1. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 22462-22467 (2009).
  3. Storm, R., et al. The bHLH transcription factor Olig3 marks the dorsal neuroepithelium of the hindbrain and is essential for the development of brainstem nuclei. Development. 136, 295-305 (2009).
  4. Lumsden, A. The cellular basis of segmentation in the developing hindbrain. Trends Neurosci. 13, 329-335 (1990).
  5. Liu, Z., et al. Control of precerebellar neuron development by Olig3 bHLH transcription factor. J. Neurosci. 28, 10124-10133 (2008).
  6. Muller, T., et al. The bHLH factor Olig3 coordinates the specification of dorsal neurons in the spinal cord. Genes Dev. 19, 733-743 (2005).
  7. Avraham, O., et al. Motor and dorsal root ganglion axons serve as choice points for the ipsilateral turning of dI3 axons. J. Neurosci. 30, 15546-15557 (2010).
  8. Avraham, O., et al. Transcriptional control of axonal guidance and sorting in dorsal interneurons by the Lim-HD proteins Lhx9 and Lhx1. Neural Dev. 4, 21 (2009).
  9. Avraham, O., Zisman, S., Hadas, Y., Vald, L., Klar, A. Deciphering axonal pathways of genetically defined groups of neurons in the chick neural tube utilizing in ovo electroporation. J. Vis. Exp. (39), e1792 (2010).
  10. Kohl, A., Hadas, Y., Klar, A., Sela-Donenfeld, D. Axonal Patterns and Targets of dA1 Interneurons in the Chick Hindbrain. J. Neurosci. 32, 5757-5771 (2012).
  11. Vogel, J., Mobius, C., Kuschinsky, W. Early delineation of ischemic tissue in rat brain cryosections by high-contrast staining. Stroke. 30, 1134-1141 (1999).
  12. Helms, A. W., Abney, A. L., Ben-Arie, N., Zoghbi, H. Y., Johnson, J. E. Autoregulation and multiple enhancers control Math1 expression in the developing nervous system. Development. 127, 1185-1196 (2000).
  13. Lumpkin, E. A., et al. Math1-driven GFP expression in the developing nervous system of transgenic mice. Gene Expr. Patterns. 3, 389-395 (2003).
  14. Lu, Y., Lin, C., Wang, X. PiggyBac transgenic strategies in the developing chicken spinal cord. Nucleic Acids Res. 37, e141 (2009).
  15. Wang, J., et al. piggyBac-like elements in the pink bollworm, Pectinophora gossypiella. Insect Mol. Biol. 19, 177-184 (2010).
  16. Alsina, B., Vu, T., Cohen-Cory, S. Visualizing synapse formation in arborizing optic axons in vivo: dynamics and modulation by BDNF. Nat. Neurosci. 4, 1093-1101 (2001).
  17. Leal-Ortiz, S., et al. Piccolo modulation of Synapsin1a dynamics regulates synaptic vesicle exocytosis. J. Cell Biol. 181, 831-846 (2008).
  18. Gardzinski, P., et al. The role of synaptotagmin I C2A calcium-binding domain in synaptic vesicle clustering during synapse formation. J. Physiol. 581, 75-90 (2007).
  19. Nowack, A., Yao, J., Custer, K. L., Bajjalieh, S. M. SV2 regulates neurotransmitter release via multiple mechanisms. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 299, C960-C967 (2010).
  20. Itasaki, N., Sharpe, J., Morrison, A., Krumlauf, R. Reprogramming Hox expression in the vertebrate hindbrain: influence of paraxial mesoderm and rhombomere transposition. Neuron. 16, 487-500 (1996).
  21. Clarke, J. D., Lumsden, A. Segmental repetition of neuronal phenotype sets in the chick embryo hindbrain. Development. 118, 151-162 (1993).
  22. Diaz, C., Glover, J. C., Puelles, L., Bjaalie, J. G. The relationship between hodological and cytoarchitectonic organization in the vestibular complex of the 11-day chicken embryo. J. Comp. Neurol. 457, 87-105 (2003).
  23. Marin, F., Puelles, L. Morphological fate of rhombomeres in quail/chick chimeras: a segmental analysis of hindbrain nuclei. Eur. J. Neurosci. 7, 1714-1738 (1995).
  24. Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector. Gene. 108, 193-199 (1991).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

75 Electroporation DA1 PiggyBac GFP

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved