Электропорации Hindbrain Трейс аксонов траектории и Synaptic Цели у эмбрионов кур

Резюме

Как нейронных сетей устанавливаются в эмбриональном мозге является фундаментальным вопросом в развитии нейробиологии. Здесь мы объединили метод электропорации с новых генетических инструментов, таких как Cre / LOX-плазмиды и PiggyBac ДНК-опосредованного переноса системы в заднем мозге птичьего маркировать интернейронов спинного и отслеживать их аксональное прогнозы и синаптических целей на различных стадиях развития.

Аннотация

Электропорации цыпленок эмбриональной нервной трубки имеет много преимуществ, таких как быстрое и эффективное для экспрессии чужеродных генов в нервных клетках. В этой рукописи мы предлагаем способ, который демонстрирует, как однозначно электропорации ДНК в мозге на птичьем E2.75 для того, чтобы специально маркировать подмножество нейронных предшественников, и как следовать их аксональное прогнозы и синаптической цели на много продвинутых стадиях разработки, до E14.5. Мы использовали новые генетические инструменты, включая конкретные элементы усилителя, Cre / Жидкий кислород - на основе плазмид и PiggyBac ДНК-опосредованного переноса системы в целях обеспечения GFP выражение в подтип заднего мозга клеток (спинной наиболее подгруппе интернейронов, dA1). Траектории аксонов и задач dA1 аксоны следуют на ранних и поздних стадиях эмбриогенеза в различных регионах мозга. Эта стратегия способствует передовые методы таргетинга интерес клетки в эмбриональном мозге и траCING схемы формирования на различных стадиях развития.

Введение

Задний мозг представляет одного из ключевых узлов реле нервной системы, общаясь между центральной и периферической нервной системы с помощью восходящих и нисходящих нейронных сетей. Он регулирует основные функции, включая дыхание, сознание, слуха, координации движений и ^1-3. Во время раннего эмбрионального развития, заднего мозга позвоночных временно разделена по его передне-задней (AP) оси в повторяющихся ромбомеры, в которых различные типы клеток нейронов формируются и создания нескольких центров ядер ствола мозга ^4. Задний мозг также разделен вдоль его спинной-вентральной (DV) оси в базальной и крыльев пластины, на которой дискретных нейронных предшественников стать указан и дифференцироваться в различных местах DV ^3,5,6. Как раннее AP и DV-конкретные нейронные паттерны, регулирующие создание функциональной схемами мозга в значительной степени неизвестно.

Чтобы получить знания по этой фундаментальнойВопрос, инструменты необходимы для того, чтобы обозначить конкретные группы нейронов в мозге и ранней проследить их аксональное траекторий и связи на более поздних стадиях. Ранее мы уже использовали конкретных элементов усилителя, и Cre / LoxP основе системы условного выражения для отслеживания траектории аксональное задних спинальных интернейронов в начале куриного эмбриона ^7-9. В текущем рукописи мы нацелены на заднем мозге и модернизированные экспериментальной парадигмы для маркировки поздних эмбриональных интернейронов заднего мозга, аксоны и их синаптических целей, с использованием модифицированной стратегии электропорации и PiggyBac - опосредованного переноса ДНК. Наши новые стратегии позволяет пометки различных подтипов нейронов в одну сторону заднего мозга и отслеживание их аксонального проекции и синаптической сайтов на различных стадиях эмбриогенеза, от 2 до 12 дней после электропорации. На основе этого метода, мы обозначили наиболее спинно-подгруппе интернейронов заднего мозга (dA1/Atoh1 ⁺ клетки) и выявили две противоположной восходящей аксональное проекции моделей, каждая вытекает из другого места АП и удлиняется в отдельном канатика. dA1 аксоны были обнаружены проекта и форма синапсов в слуховых ядер среднего мозга и в несколько слоев мозжечка ^10.

Сочетание электропорации цыпленок, генетические отслеживания нейронов и анализ проекции места на гораздо поздних стадиях развития предоставляет уникальную платформу для изучения формирования нейронных сетей в мозге и выяснить молекулярные механизмы, которые управляют схемой формирования.

протокол

1. Hindbrain Электропорацию

1.1 обработки яйца

1. Место яйца горизонтально в увлажненном инкубаторе (37-38.5 ° C). Эмбрионы электропорации после 65-70 ч инкубации, когда они достигают 16-17 (HH) этапе (25-30 сомитами).
2. Удалите яйца из инкубатора, они остаются в горизонтальном положении.

1.2 Подготовка

1. Потяните стеклянные капилляры (диаметром 0,5 мм).
2. Соединение изогнутые L-форме золота Genetrodes электродами (3 мм в диаметре) с адаптером держатель с генератором импульсов. Электропорацию параметры включают в себя 25 вольт, 5 числа импульсов, 45 мс длительность импульса 300 мс импульс интервалами.
3. Подготовить рот пипеткой, 10 мл игла шприца, парафильм полосы, мягкой щеткой, острые рассечение ножницами и 25 мл стерильного раствора PBS. Эта сумма, как правило, достаточно для обработки для яиц (18 яиц).
4. Подготовка адекватной смесь ДНК плазмиды (5 мкг / мкл) идобавить около 0,025% Быстрая краска Зеленая визуализировать инъекции ДНК. Обычно объемом 4 мкл, является достаточным для введения лотка.

1,3 Windowing, инъекции и электропорации

1. Очистите яичную скорлупу с 70% этанола.
2. Ручка одно яйцо в то время, чтобы свести к минимуму время эмбрионального воздействия воздуха.
3. Сделайте отверстие в яйце полюса с ножницами и удалить концы 3-4 мл альбумина со шприцем. Не удалять большее количество альбумина так как он снижает жизнеспособность.
4. Открыть небольшое овальное окно (2,5 х 2 см размер) в верхней центральной части яичной скорлупы использованием рассечение ножницами.
5. Капельное несколько капель PBS в верхней части эмбриона, чтобы предотвратить сухость в течение всего процесса.
6. Загрузка небольшое количество ДНК смесь в стеклянный капилляр использованием рот пипеткой.
7. Поместите эмбриона с его задним концом к вам. Нет чернил инъекций не требуется на данном этапе как зародыш был четко виден. Как избежать увеличения чернил инъекцийэмбриональной выживаемости. Проникнуть хвостового заднего мозга путем проведения капиллярного при ~ 45 °. Не удаляйте мембраны со всего эмбриона. Введите ДНК раствор осторожно в просвет заднего мозга и выдох без образования пузырьков воздуха. Раствор ДНК распространяется вперед.
8. Сразу после инъекции ДНК, поместите параллельными электродами в точное AP и DV заднего мозга позиции вы стремитесь цели. Нажмите на электроды немного снизу, не прикасаясь к сердцу, так как это может уменьшить жизнеспособность. Пульс электропоратора. Электроды должны быть покрыты пузырьками, чтобы указать, электропроводности (рис. 1А).
9. Осторожно выньте электроды и капать несколько капель PBS для охлаждения эмбриона и, чтобы удалить пузырьки. Печать яйцо открывается правильно с полосой парафином для предотвращения высыхания во время инкубации. Вымойте электродов в PBS с мягкой щеткой.
10. Поместите яйцо в инкубаторе в течение желаемого промежутка времени. Выживаемость эмбрионов составляет приблизительно 90% через 2-3 дня послеэлектропорации, а также снижает до 50% 12 дней после электропорации.

2. Анализ Эмбрионы

2.1 Плоские крепления подготовки и иммунофлюоресценции

1. Плоские крепления препараты заднего мозга может быть выполнена до E6.5 легко визуализировать аксонов под микроскопом или стерео-микроскопа.
2. Проанализируйте эмбриона тщательно отделив ее от окружающих оболочек и кровеносных сосудов. Поместите эмбриона в небольшом Силикон - покрытием чашке Петри, содержащую PBS. Прикрепить эмбриона к блюду с вольфрамом штырьков, расположенный напротив сверху. Выполните рассечение в заднем мозге крыши пластины с использованием резких стеклянных капилляров.
3. Используя острый пинцет и микроножниц удерживать верхнюю часть головы и тянуть заднего мозга ткани очень тщательно от ростральнее хвостового. После разделения задний мозг удалить остатки вентральной ткани, чтобы достичь чистого препарата.
4. Выдержите заднего мозга с 4% Параформальдегида (PFA) раствор в течение 1-2 ч при комнатной температуре (RT). Промыть заднего мозга с PBT (PBS с 0,1% Triton X-100), чтобы удалить из PFA.
5. Для иммунофлуоресценции с плоским установлен hindbrains добавляют 500 мкл блокирующего раствора (5% козьей сывороткой в ПБТ и инкубируют в течение 2 ч при комнатной температуре инкубировать с ^1-го антитело ON при 4 ° C. Промыть PBT (15 мин × 3). Инкубируют со ^2-й антител в течение 2 ч при комнатной температуре. Промыть PBT (15 мин × 3).
6. Поместите задний мозг сталкивается дорсально на предметное стекло. Добавить люминесцентные монтажа носителя, на заднем мозге. Используйте стеклянные капилляры или вольфрама иглы для выравнивания заднего мозга на слайде.
7. Добавить небольшое количество смазки на каждом углу, чтобы предотвратить сдавливание ткани на покровное стекло. Аккуратно покровным стеклом в верхней части заднего мозга и избежать пузырьков воздуха. За верность добавить лак для ногтей для покрытия кромок стекла.

2.2 Cryo-секций и Иммунофлуоресценция

1. Крио-разделов мозга CAN быть выполнена на любой стадии для визуализации аксональное траекторий. Тем не менее, после E6.5 это должно быть предпочтительным методом из-за трудности для визуализации аксонов в плоской установлен эмбриона, который становится слишком толстым. Кроме того, демонстрация синапсов требует срезов тканей и высоким увеличением вид под микроскопом.
2. Проанализируйте эмбриона и удалить все окружающие ткани. Полоскание с PBS. Вырезать эмбриона на каудальной части продолговатого мозга с использованием микро-ножницы и пинцет острый. Сделайте широкий разрез между мозжечком и средним мозгом и удалить весь мозга. Ткань должна содержать мозга, моста и мозжечка.
3. Исправить ствола мозга в 4% PFA в течение ночи (ON) при 4 ° С, промыть PBS (10 мин х 3) и инкубировать с 30% сахарозы для ВКЛ при 4 ° С до тонущего.
4. Вставить в задний мозг крио-формы с ОСТ (оптимальная температура резка) соединения и не поместить его при температуре -20 ° С до замораживания, как описано в другом месте ^11.
5. Поместите блок ОКТ криостата в нужное сечение оси. Ширина профиля составляет 12 мкм.
6. Сушат слайды. Добавить 100 мкл блокирующего раствора на каждый слайд в течение 2 ч при комнатной температуре. Добавить 100 мкл антитела (разведенного в блокирующем растворе до желаемой концентрации). Инкубационный период ^1-й и ^2-й антител включается при 4 ° С или 2 часа при комнатной температуре, соответственно. Для каждого времени инкубации, осторожно добавляют парафином полосы на верхней части слайда, чтобы предотвратить сухости. Промыть PBS (10 мин х 3) между антителами. При необходимости добавьте 1:1000 Dapi (4'-6-диамидино-2-фенилиндол), разведенного в PBS в течение 20 мин при комнатной температуре. Полоскание с PBS.
7. Монтаж салазок с люминесцентными монтажа средств массовой информации. Дайте высохнуть в течение 1 ч перед анализом.

Результаты

Этот протокол был недавно использован, чтобы раскрыть аксонов модели и проекции сайтах dA1 подгруппе интернейронов в заднем мозге цыпленок ^10. Чтобы специфично метить эти аксонов, энхансер (Atoh1), который ранее был охарактеризован как специфичные для нейронов спинного dI1 ^8,12,13, б...

Обсуждение

В ово электропорации является выполнимой, надежный и эффективный инструмент для изучения спецификации клеток и аксонов во куриных развития нервной системы ^20. В этом протоколе мы опишем способ электропорации у кур на заднем мозге E2.75 использованием усилителя элементы, котор...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
L-shaped gold Genetrodes 3 mm electrodes	BTX, Harvard Apparatus	45-0162
pulse generator, ECM 830	BTX, Harvard Apparatus	45-0002
OCT (Optimal Cutting Temperature) Compound	Tissue-Tek Sakura	4583 O.C.T. Compound
Nail Polish	From Any Commercial Supplier