Eletroporação do rombencéfalo rastrear Trajetórias axonal e Metas Synaptic no embrião de galinha

Resumo

Como as redes neuronais são estabelecidas no cérebro embrionário é uma questão fundamental no desenvolvimento da neurobiologia. Aqui nós combinamos uma técnica de eletroporação com novas ferramentas genéticas, como Cre / Lox-plasmídeos e sistema de transposição de DNA PiggyBac mediada no hindbrain aviária para rotular interneurons dorsal e rastrear suas projeções axonais e metas sinápticas em diferentes estágios de desenvolvimento.

Resumo

A electroporação do tubo neural embrionário pintainho tem muitas vantagens, tais como ser rápido e eficiente para a expressão de genes estranhos em células neuronais. Neste artigo, procuramos fornecer um método que demonstra unicamente como electroporate DNA no hindbrain aviária em E2.75, a fim de marcar especificamente um subconjunto de células progenitoras neuronais, e como seguir suas projeções axonais e metas sinápticas em estágios muito avançados de desenvolvimento, até E14.5. Utilizamos ferramentas genéticas novas, incluindo elementos específicos do realçador, Cre / Lox - plasmídeos base e do sistema de transposição de DNA PiggyBac mediada para dirigir a expressão GFP em um subtipo de células rombencéfalo (o dorsal mais subgrupo de interneurônios, da1). Trajetórias e metas da da1 axônios axonal são seguidas em fases embrionárias precoces e tardias em várias regiões do tronco cerebral. Esta estratégia contribui com técnicas avançadas para as células de interesse alvo na parte posterior do cérebro embrionário e para tracing formação circuito em vários estágios de desenvolvimento.

Introdução

A parte posterior do cérebro representa um cubo do relé-chave do sistema nervoso por meio da comunicação entre os sistemas nervosos central e periférico via ascendente e descendente redes neuronais. Ele regula as funções básicas, incluindo respiração, consciência, audição e coordenação motora ^1-3. Durante o desenvolvimento embrionário inicial, a parte posterior do cérebro dos vertebrados é transitoriamente subdividida ao longo do eixo ântero-posterior (AP) em rhombomeres repetitivas, em que os tipos de células neuronais distintas são formadas e gerar múltiplos centros de núcleos do tronco cerebral ^4. A parte posterior do cérebro também é dividido ao longo do seu eixo dorsal-ventral (DV) em uma placa basal e alar, em que os progenitores neuronais discretas e diferenciar-se especificadas em locais distintos ^3,5,6 DV. Como o início da AP e DV específicos padrões neuronais estão governando o estabelecimento de circuitos do tronco cerebral funcional é em grande parte desconhecido.

Para adquirir conhecimentos sobre esta fundamentaisquestão, são necessárias ferramentas, a fim de rotular subconjuntos específicos de neurônios no cérebro posterior cedo e traçar suas trajetórias axonal e conectividade em estágios mais avançados. Nós já utilizou elementos de melhoria específica, e um sistema de expressão condicional Cre / baseado LoxP para acompanhar a trajetória axonal de interneurônios da coluna dorsal no embrião de galinha cedo ^7-9. No manuscrito atual que têm como alvo o cérebro posterior e atualizado o paradigma experimental para a rotulagem final interneurons rombencéfalo embrionárias, axônios e seus alvos sinápticas, usando uma estratégia de eletroporação modificado eo PiggyBac - Transposição DNA mediada. A nossa nova estratégia permite a marcação de subtipos neuronais distintas em um dos lados da parte posterior do cérebro e a localização dos seus locais de projecções axonais e sinápticos em vários estádios de desenvolvimento embrionário, a partir de 2 até 12 dias após a electroporação. Com base neste método, que classificou o dorsal, mais subgrupo de interneurons rombencéfalo (dA1/Atoh1 ⁺ células) e revelou dois padrões de projeção axonal ascendentes contralateral, cada um deriva de um local AP diferente e alonga em um funículo distinta. da1 axônios foram encontrados para projeto e sinapses formulário em núcleos auditivos, mesencéfalo e em múltiplas camadas do cerebelo ^10.

A combinação de garota eletroporação, rastreamento genético de neurônios e análise de locais de projeção em estágios muito avançados de desenvolvimento fornece uma plataforma única de estudar a formação de redes neuronais no cérebro e para elucidar os mecanismos moleculares que governam a formação de circuitos.

Protocolo

1. Eletroporação hindbrain

1.1 manuseio Egg

1. Colocar os ovos horizontalmente numa incubadora humidificada (37-38,5 ° C). Os embriões são electroporados após 65-70 horas de incubação, quando atingem 16-17 (HH) fase (25-30 somites).
2. Retire os ovos da incubadora, eles permanecem na posição horizontal.

1.2 Preparações

1. Puxar capilares de vidro (0,5 mm de diâmetro).
2. Ligação dobrados em forma de L Genetrodes eléctrodos de ouro (diâmetro 3 mm) com uma placa de suporte para o gerador de impulsos. Parâmetros eletroporação incluem 25 volts, 5 números de pulso, 45 ms de comprimento de pulso, 300 intervalos de pulso ms.
3. Prepara-se uma pipeta de boca, agulha de seringa de 10 ml, as tiras de parafilme, uma escova macia, dissecando tesoura afiada e 25 ml de solução de PBS estéril. Esta quantidade é suficiente para lidar com uma bandeja de ovos (18 ovos).
4. Prepara-se uma mistura adequada de plasmídeos de ADN (5 mg / mL de cada) eadicionar cerca de corante Verde Rápido 0,025% para visualizar a injecção de ADN. Normalmente, um volume de 4 ul é suficiente para a injecção de um tabuleiro.

1.3 de janelas, Injeção e Eletroporação

1. Limpe as cascas de ovos com etanol 70%.
2. Lidar com um ovo de cada vez para minimizar o tempo de exposição ao ar embrionário.
3. Fazer um buraco no pólo ovo com as tesouras de pontas e remover 3-4 ml de albumina com a seringa. Não remova a maior quantidade de albumina, uma vez que reduz a viabilidade.
4. Abra uma pequena janela oval (2,5 x 2 cm de tamanho) na parte central superior da casca do ovo usando a tesoura de dissecação.
5. Gotejamento algumas gotas de PBS em cima do embrião para evitar a secura durante todo o processo.
6. Coloque uma pequena quantidade da mistura de ADN no capilar de vidro usando uma pipeta de boca.
7. Coloque o embrião com a extremidade posterior em direção a você. Sem injeção de tinta é necessária nesta fase, o embrião é claramente visível. Evitar um aumento de injeção de tintasobrevivência embrionária. Penetrar o hindbrain caudal mantendo o capilar em ~ 45 °. Não retire nenhuma membrana ao redor do embrião. Injetar solução de DNA com cuidado para a luz hindbrain e expire sem formar bolhas de ar. Solução de ADN espalha anteriormente.
8. Imediatamente após a injeção de DNA, coloque os eletrodos paralelos no AP precisa e DV posição hindbrain você apontar para o alvo. Empurrar os eléctrodos ligeiramente ventralmente sem tocar no coração, em que pode reduzir a viabilidade. Pulsar o electroporator. Os eléctrodos deverão ser cobertas com bolhas para indicar condutividade elétrica (Figura 1A).
9. Cuidadosamente retire os eletrodos e pingar algumas gotas de PBS para esfriar o embrião e para remover as bolhas. Selar o ovo abrir corretamente com uma tira de parafilme para evitar o ressecamento durante a incubação. Lavar eléctrodos em PBS com o pincel macio.
10. Coloque ovos na incubadora para o período de tempo desejado. A sobrevivência de embriões de aproximadamente 90% depois de 2-3 diaselectroporação, e reduz-se para 50% de 12 dias após a electroporação.

2. Análise de Embriões

2.1 Preparação e imunofluorescência plano de montagem

1. Preparações plano de montagem da parte posterior do cérebro podem ser realizadas até E6.5 para visualizar facilmente axônios sob um microscópio ou um estéreo-microscópio.
2. Dissecar o embrião cuidadosamente separando-a de membranas que envolvem e vasos sanguíneos. Colocar o embrião num pequeno silicone - revestido placa de Petri contendo PBS. Conecte o embrião para o prato com pinos de tungstênio enfrentam dorsal. Realize uma fenda dorsal na parte posterior do cérebro telhado placa usando sharp capilares de vidro.
3. Usando pinças afiadas e micro-tesouras segurar a parte superior da cabeça e puxe o tecido hindbrain com muito cuidado a partir de rostral para caudal. Após separação da rombencéfalo remover restantes tecidos ventrais para alcançar uma preparação limpa.
4. Incubar a hindbrain com 4Solução% paraformaldeído (PFA) por 1-2 horas em temperatura ambiente (RT). Lava-se a parte posterior do cérebro com PBT (PBS/0.1% de Triton X-100) para remover a PFA.
5. Para imunofluorescência em hindbrains plana montados adicionar 500 ul de solução de bloqueio (5% de soro de cabra em PBT e incubar durante 2 horas à temperatura ambiente com um anticorpo Incubar ^r ON a 4 ° C. A lavagem com PBT (15 minutos x 3). Incubar 2 ^nd com anticorpo durante 2 horas à temperatura ambiente. Lavar com PBT (15 minutos x 3).
6. Colocar o rombencéfalo virada dorsalmente numa lâmina de vidro. Adicione meios de montagem fluorescentes na parte posterior do cérebro. Use capilares de vidro ou agulhas de tungstênio para achatar a hindbrain no slide.
7. Adicionar pequena quantidade de massa lubrificante, em cada canto para impedir a compressão do tecido por a lamela de cobertura. Cuidadosamente coloque uma cobertura de vidro na parte superior da parte posterior do cérebro e evitar bolhas de ar. Para adesão adicionar unha polonês para cobrir as bordas de vidro.

2.2 Cryo-seções e Imunofluorescência

1. Cryo-seções do tronco cerebral can ser realizada em qualquer fase de visualizar trajectórias axonais. No entanto, depois de E6.5 este deve ser o método preferido, devido à dificuldade em visualizar os axônios no embrião fixa-montado, que se torna demasiado espessa. Além disso, a manifestação de sinapses requer o seccionamento do tecido e uma vista de alta ampliação com um microscópio.
2. Dissecar o embrião e remover todos os tecidos circundantes. Lavar com PBS. Corte o embrião na parte caudal da medula usando micro-tesouras e pinças afiadas. Fazer uma ampla incisão entre o cerebelo eo mesencéfalo e remover todo o tronco cerebral. O tecido deve conter a medula, ponte e cerebelo.
3. Fixar o tronco cerebral em PFA a 4% durante a noite (ON) a 4 ° C, lavar com PBS (10 minutos x 3), e incubar com 30% de sacarose para LIGADO, a 4 ° C até afundamento.
4. Incorporar o rombencéfalo num molde de crio com outubro (temperatura óptima de corte) de composto, e colocá-lo a -20 ° C, até o congelamento, conforme descrito noutro local ^11.
5. Coloque o bloco outubro no criostato no eixo transversal desejado. Largura da seção é de 12 mM.
6. Seque as lâminas. Adicionar 100 ul de solução de bloqueamento em cada lâmina, durante 2 horas à temperatura ambiente. Adicionar 100 ul de anticorpos (diluído em solução de bloqueio à concentração desejada). O período de incubação para a 1 ^ª e 2 ^ª anticorpos está ligado a 4 ° C ou 2 horas à temperatura ambiente, respectivamente. Para cada tempo de incubação, adicionar suavemente parafilme tira na parte superior da corrediça para evitar a secura. Lavar com PBS (10 minutos x 3) entre os anticorpos. Se for necessário, adicionar 1:1000 Dapi (4'-6-diamidino-2-fenilindole), diluiu-se em PBS durante 20 min à TA. Lavar com PBS.
7. Montar o slide com meios de montagem fluorescentes. Deixe secar por 1 hora antes da análise.

Resultados

Este protocolo foi usado recentemente para descobrir os padrões axonal e locais de projeção de da1 subgrupo de interneurônios na garota hindbrain ^10. Para identificar especificamente esses axónios, um elemento potenciador (Atoh1), que tenha sido previamente caracterizadas como específico para neurónios espinais ED1 ^8,12,13, foi confirmado para ser expresso em células rombencéfalo da1 ^10. O elemento foi clonado a montante Cre recombinase e co-electroporados em E2.75 juntamente co...

Discussão

Na eletroporação in ovo é uma ferramenta viável, confiável e eficaz para examinar especificação celular e orientação axonal durante garota desenvolvimento do sistema nervoso ^20. Neste protocolo, descrevemos um modo de eletroporação na hindbrain garota em E2.75 usando elementos potenciador que permitem a rotulagem condicional de interneurons específicas. Esta estratégia é combinada com o sistema de transposição PiggyBac mediada para inserir genes estranhos no genoma do pintinh...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
L-shaped gold Genetrodes 3 mm electrodes	BTX, Harvard Apparatus	45-0162
pulse generator, ECM 830	BTX, Harvard Apparatus	45-0002
OCT (Optimal Cutting Temperature) Compound	Tissue-Tek Sakura	4583 O.C.T. Compound
Nail Polish	From Any Commercial Supplier