La electroporación del Rombencéfalo trazar trayectorias axonal y metas sinápticas en el embrión de pollo

Resumen

¿Cómo las redes neuronales se establecen en el cerebro embrionario es una cuestión fundamental en la neurobiología del desarrollo. Aquí hemos combinado una técnica de electroporación con herramientas genéticas novedosas, tales como Cre / Lox-plásmidos y el sistema de transposición de ADN PiggyBac mediada por el cerebro posterior aviar para etiquetar interneuronas dorsal y seguimiento de sus proyecciones axonales y metas sinápticas en las diversas etapas de desarrollo.

Resumen

La electroporación del tubo neural de embriones de pollo tiene muchas ventajas tales como ser rápida y eficiente para la expresión de genes extraños en células neuronales. En este manuscrito se proporciona un método que demuestra cómo única para electroporar ADN en el cerebro posterior aviar en E2.75 con el fin de etiquetar específicamente un subconjunto de células progenitoras neuronales, y cómo seguir sus proyecciones axonales y metas sinápticas en una fase mucho más avanzada de desarrollo, hasta E14.5. Hemos utilizado herramientas genéticas nuevas que incluyen elementos específicos potenciadoras, Cre / Lox - plásmidos basados ​​y el sistema de transposición de ADN PiggyBac mediada para dirigir la expresión de GFP en un subtipo de células del cerebro posterior (dorsal más subgrupo de interneuronas, DA1). Trayectorias y objetivos de DA1 axonal axones se siguen en las etapas embrionarias tempranas y tardías en varias regiones del tronco cerebral. Esta estrategia contribuye con técnicas avanzadas para atacar a las células de interés en la parte posterior del cerebro embrionario y de tracing formación circuito en múltiples etapas de desarrollo.

Introducción

El cerebro posterior representa un concentrador relé clave del sistema nervioso mediante la comunicación entre los sistemas nerviosos central y periférico por medio de ascendente y descendente redes neuronales. Regula las funciones básicas como la respiración, la conciencia, el oído y la coordinación motora ^1-3. Durante el desarrollo embrionario temprano, la parte posterior del cerebro de vertebrados se subdivide transitoriamente a lo largo de su eje antero-posterior (AP) en rhombomeres repetitivas, en las que se forman distintos tipos de células neuronales y generan múltiples centros de los núcleos del tronco cerebral ^4. El cerebro posterior también se divide a lo largo de su eje dorsal-ventral (DV) en una placa basal y alar, en la que los progenitores neuronales discretas se especifican y se diferencian en lugares distintos DV ^3,5,6. Como a principios del AP y DV-específicos patrones neuronales se rige el establecimiento de circuitería tronco cerebral funcional es en gran parte desconocida.

Para adquirir conocimientos sobre este fundamentalcuestión, se requieren herramientas para etiquetar subconjuntos específicos de neuronas en el cerebro posterior y principios para trazar su trayectoria axonal y la conectividad en las etapas más avanzadas. Hemos utilizado previamente elementos específicos potenciador, y un sistema de expresión condicional Cre / loxP basada para el seguimiento de la trayectoria axonal de interneuronas espinales dorsales en el embrión de pollo temprano ^7-9. En el manuscrito actual se ha centrado en el cerebro posterior y mejorado el paradigma experimental para etiquetar finales interneuronas rombencéfalo embrionarias, axones y sus objetivos sinápticas, mediante una estrategia de electroporación modificado y el PiggyBac - Adaptación de ADN mediada. Nuestra nueva estrategia permite que el etiquetado de los subtipos neuronales distintas en un lado del cerebro posterior y el seguimiento de sus proyecciones axonales y sitios sinápticos en las diversas etapas embrionarias, desde 2 hasta 12 días después de la electroporación. En base a este método, se calificó el dorsal más subgrupo de interneuronas del cerebro posterior (dA1/Atoh1 ⁺ las células) y reveló dos patrones de proyección axonal ascendentes contralaterales, cada uno deriva de una ubicación AP diferente y se alarga en un funiculus distinta. DA1 axones se encontraron para formar sinapsis en los núcleos auditivos, cerebro medio y en múltiples capas del cerebelo ¹⁰ proyecto.

La combinación de polluelo de la electroporación, el rastreo genético de las neuronas y el análisis de los sitios de proyección en una fase mucho más avanzadas de desarrollo proporciona una plataforma única para estudiar la formación de redes neuronales en el cerebro y para dilucidar los mecanismos moleculares que gobiernan la formación de circuito.

Protocolo

1. La electroporación Rombencéfalo

1.1 Manejo de Huevos

1. Coloque los huevos horizontalmente en un incubador humidificado (37-38.5 ° C). Los embriones son electroporación después de 65-70 horas de incubación, cuando alcanzan 16-17 (HH) etapa (25-30 somitas).
2. Eliminar los huevos de la incubadora, sino que permanecen en la posición horizontal.

1.2 Preparativos

1. Tire de capilares de vidrio (0,5 mm de diámetro).
2. Conectar dobladas en forma de L de oro Genetrodes electrodos (3 mm de diámetro) con un soporte del adaptador para el generador de impulsos. Electroporación parámetros incluyen 25 voltios, 5 números de impulsos, 45 ms de longitud de pulso, los intervalos de 300 ms de pulso.
3. Preparar una pipeta de boca, 10 ml de aguja de la jeringa, tiras de parafilm, un cepillo suave, unas tijeras de disección afilados y 25 ml de solución de PBS estéril. Esta cantidad es por lo general suficiente para manejar una bandeja de huevos (18 huevos).
4. Preparar una mezcla adecuada de los plásmidos de ADN (5 g / l cada uno) yañadir alrededor de 0,025% de colorante verde rápido para visualizar la inyección de ADN. Por lo general, un volumen de 4 l es suficiente para la inyección de una bandeja.

1.3 de ventanas, de inyección y electroporación

1. Limpie las cáscaras de huevo con etanol al 70%.
2. Manejar un huevo a la vez para minimizar el tiempo de exposición al aire embrionaria.
3. Hacer un agujero en el polo de huevo con los extremos tijeras y retire 3-4 ml de albúmina con la jeringa. No extraiga la mayor cantidad de albúmina, ya que reduce la viabilidad.
4. Abra una ventana oval pequeño (2,5 x 2 cm de grosor) en el centro superior de la cáscara de huevo con las tijeras de disección.
5. Por goteo unas gotas de PBS en la parte superior del embrión para evitar la sequedad durante todo el proceso.
6. Cargar una pequeña cantidad de la mezcla de ADN en el capilar de vidrio usando una pipeta de boca.
7. Coloque el embrión con su extremo posterior hacia usted. No se requiere la inyección de tinta en esta etapa el embrión es claramente visible. Evitar el aumento de inyección de tintasupervivencia embrionaria. Penetrar en el cerebro posterior caudal mediante la celebración de los capilares en el ~ 45 °. No retire cualquier membrana de todo el embrión. Inyectar solución de ADN con cuidado en el lumen cerebro posterior y exhalar sin que se formen burbujas de aire. Solución de ADN se extiende hacia delante.
8. Inmediatamente después de la inyección de ADN, coloque los electrodos paralelos a la AP precisa y DV posición rombencéfalo tu objetivo es orientar la campaña. Empuje los electrodos ligeramente ventralmente sin tocar el corazón, ya que puede reducir la viabilidad. Pulso del electroporador. Los electrodos deben estar cubiertos con burbujas para indicar la conductividad eléctrica (Figura 1A).
9. Retire con cuidado los electrodos y gotear unas gotas de PBS para enfriar el embrión y para eliminar las burbujas. Selle el orificio correctamente con una tira de parafina para evitar que se sequen durante la incubación de los huevos. Lave los electrodos en PBS con un cepillo suave.
10. Coloque huevo en la incubadora durante el período de tiempo deseado. La supervivencia de los embriones es de aproximadamente 90% después de 2-3 díaselectroporación, y reduce hasta el 50% 12 días después de la electroporación.

2. Análisis de embriones

2.1 La elaboración del plano de montaje e inmunofluorescencia

1. Preparaciones plana de montaje de la parte posterior del cerebro se pueden realizar hasta E6.5 para visualizar fácilmente los axones bajo un microscopio o un estereomicroscopio.
2. Diseccionar el embrión cuidadosamente por lo separa de membranas que rodean y los vasos sanguíneos. Coloque el embrión en una pequeña silicona - placa de Petri recubierto que contiene PBS. Conecte el embrión al plato con alfileres de tungsteno enfrenta dorsal. Realice una hendidura dorsal en el cerebro posterior en el techo placa con fuerte capilares de vidrio.
3. Con ayuda de pinzas cortantes y micro-tijeras sujetar la parte superior de la cabeza y tirar del tejido de cerebro posterior muy cuidadosamente de rostral a caudal. Después de la separación de la parte posterior del cerebro eliminar los tejidos ventrales restantes para alcanzar una preparación limpia.
4. Incubar el cerebro posterior con 4% De solución de paraformaldehído (PFA) para 1-2 hr a temperatura ambiente (RT). Lavar el cerebro posterior con PBT (PBS/0.1% de Triton X-100) para eliminar PFA.
5. Por inmunofluorescencia en hindbrains-montados plana añadir 500 l de solución de bloqueo (5% de suero de cabra en PBT y se incuba durante 2 horas a RT Incubar con 1 ^pt de anticuerpo ON a 4 ° C. Lavar con PBT (15 min x 3). Incubar con 2 ^ª anticuerpo durante 2 horas a TA. Lavar con PBT (15 min x 3).
6. Coloque el cerebro posterior frente dorsalmente en un portaobjetos de vidrio. Añadir medio de montaje fluorescentes en la parte posterior del cerebro. Usa capilares de vidrio o agujas de tungsteno para aplanar la parte posterior del cerebro en la diapositiva.
7. Añadir pequeña cantidad de grasa en cada esquina para evitar exprimir del tejido por la hoja de la cubierta. Con cuidado, coloque una hoja de cubierta en la parte superior de la parte posterior del cerebro y evitar burbujas de aire. Para añadir la adhesión esmalte de uñas para cubrir los bordes del vidrio.

2.2 Cryo-secciones e inmunofluorescencia

1. Cryo-secciones del tronco cerebral can llevarse a cabo en cualquier etapa de visualizar las trayectorias axonales. Sin embargo, después de E6.5 este debe ser el método preferido debido a la dificultad para visualizar los axones en el embrión de montaje plana, que se convierte en demasiado grueso. Por otra parte, la demostración de las sinapsis requiere la sección del tejido y una vista de gran aumento bajo un microscopio.
2. Disección del embrión y eliminar todos los tejidos circundantes. Lavar con PBS. Cortar el embrión en la parte caudal de la médula mediante micro-tijeras y pinzas cortantes. Hacer una amplia incisión entre el cerebelo y el cerebro medio y retirar todo el tronco cerebral. El tejido debe contener el bulbo raquídeo, la protuberancia y el cerebelo.
3. Fijar el tronco cerebral en PFA al 4% durante toda la noche (ON) a 4 ° C, enjuague con PBS (3 x 10 min), y se incuba con 30% de sacarosa para ON a 4 ° C hasta que se hunde.
4. Insertar el cerebro posterior en un molde con la crio-compuesto OCT (temperatura óptima de corte), y colocarlo a -20 ° C hasta su congelación, tal como se describe en otro lugar ^11.
5. Coloque el bloque de octubre en el criostato en el eje transversal deseada. Ancho de sección es de 12 micras.
6. Secar los portaobjetos. Añadir 100 l de solución de bloqueo en cada portaobjetos durante 2 h a TA. Añadir 100 l de anticuerpos (diluido en la solución de bloqueo a la concentración deseada). El período de incubación de 1 ^ª y 2 ^ª anticuerpos está encendido a 4 ° C o 2 horas a temperatura ambiente, respectivamente. Para cada tiempo de incubación, añadir con cuidado tira de parafina en la parte superior de la corredera para evitar la sequedad. Lavar con PBS (10 min x 3) entre los anticuerpos. Si es necesario, añadir 1:1000 DAPI (4'-6-diamidino-2-fenilindol), diluido en PBS durante 20 min a TA. Lavar con PBS.
7. Coloque el portaobjetos con medio de montaje fluorescentes. Deje que se seque durante 1 hora antes de su análisis.

Resultados

Este protocolo fue utilizado recientemente para descubrir los patrones axonal y sitios de proyección de DA1 subgrupo de interneuronas en el cerebro posterior chica ^10. Para etiquetar específicamente estos axones, se confirmó un elemento potenciador (Atoh1), que anteriormente ha sido caracterizado como específico para las neuronas espinales ED1 ^8,12,13, que se expresa en las células del cerebro posterior ¹⁰ DA1. El elemento fue clonado aguas arriba de la recombinasa Cre y co-electrop...

Discusión

En electroporación in ovo es una herramienta viable, fiable y eficaz para examinar especificación de las células y la guía axonal durante el desarrollo del sistema nervioso polluelo ^20. En este protocolo se describe un modo de electroporación en el cerebro posterior chica en E2.75 utilizando elementos potenciadores que permiten el etiquetado condicional de interneuronas específicos. Esta estrategia se combina con el sistema de transposición mediada por PiggyBac para insertar genes ext...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
L-shaped gold Genetrodes 3 mm electrodes	BTX, Harvard Apparatus	45-0162
pulse generator, ECM 830	BTX, Harvard Apparatus	45-0002
OCT (Optimal Cutting Temperature) Compound	Tissue-Tek Sakura	4583 O.C.T. Compound
Nail Polish	From Any Commercial Supplier