JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Gelişimsel nörobiyoloji temel bir soru nasıl nöron ağları embriyonik beyinde kurulan olmasıdır. Burada bu Cre / Lox-plazmid ve dorsal internöronlar etiket ve çeşitli gelişim aşamalarında kendi aksonal projeksiyonlar ve sinaptik hedefleri izlemek için kuş Beyin içinde piggyBac-aracılı DNA aktarılması sistemi olarak yeni genetik araçları ile bir elektroporasyon tekniği kombine.

Özet

Piliç embriyonik nöral tüpün elektroporasyon gibi nöronal hücrelerde yabancı genlerin sentezlenmesi için hızlı ve verimli olması gibi birçok avantajı vardır. Bu yazıda biz, özel olarak nöronal ataları bir alt etiket için E2.75 de kuş Beyin içine DNA electroporate nasıl benzersiz gösteriyor yöntemi ve ne gelişme çok ileri evrelerde kendi aksonal projeksiyonlar ve sinaptik hedefleri takip etmek sağlamak kadar E14.5 için. Tabanlı plazmid ve arka beyin hücreleri (internöronlar, dA1 dorsal en alt grubu) bir alt GFP ifade sürücü piggyBac-aracılı DNA aktarılması sistemi - Biz özel resim geliştirme elemanları, Cre / Lox dahil olmak üzere yeni genetik araçları kullanmış olurlar. Aksonal yörüngeleri ve dA1 akson hedefleri çeşitli beyin bölgelerinde erken ve geç embriyonik aşamalarında takip edilmektedir. Bu strateji embriyonik Beyin ilgi hücreleri hedef için ve tra için gelişmiş teknikler katkıdagelişim çeşitli aşamalarında devre oluşumu dans ediyorum.

Giriş

Beyin artan ve nöron ağları inen ile merkezi ve periferik sinir sistemi arasındaki iletişim kurarak sinir sisteminin önemli bir röle merkezi temsil eder. Bu solunum, bilinç, işitme ve motor koordinasyon 1-3 gibi temel fonksiyonlarını düzenler. Erken embriyonik gelişimi sırasında, omurgalı Beyin geçici farklı nöronal hücre tipleri oluşan ve çoklu beyin sapı çekirdekleri merkezleri 4 oluşturmak olduğu tekrarlayan rhombomeres, içine ön-arka (AP) ekseni boyunca bölünmüştür. Beyin de ayrık nöronal ataları belirtilen olmak ve farklı DV yerlerde 3,5,6 ayırt hangi bir bazal ve alar plaka, içine dorsal-ventral (DV) ekseni boyunca ayrılmıştır. Erken AP ve DV özel nöronal modelleri fonksiyonel beyin devrelerin kurulması yöneten nasıl büyük ölçüde bilinmemektedir.

Bu temel üzerinde bilgi sahibi olmaksoru, araçları erken Beyin nöronların belirli alt etiketlemek için ve daha ileri aşamalarında kendi aksonal yörüngeleri ve bağlantı takip etmek için gereklidir. Daha önce özel resim geliştirme elemanları kullanılan ve erken civciv embriyo 7-9 dorsal spinal internöron aksonal yörünge takip etmek için Cre / LoxP tabanlı koşullu ifade sistemi var. Mevcut yazıda; Beyin hedef ve değiştirilmiş bir elektroporasyon stratejisi ve piggyBac kullanarak, geç embriyonik arka beyin internöronlar, akson ve sinaptik hedefleri etiketleme için deneysel paradigma yükseltilmiş - aracılı DNA aktarılması. Yeni strateji 2 en fazla 12 gün arka beyin ve aksonal projeksiyonlar ve çeşitli embriyonik aşamalarında sinaptik sitelerin takibi bir tarafında belirgin nöronal alt tiplerinin etiketleme, elektroporasyon takip sağlar. Bu yöntem dayanarak, arka beyin internöronlar dorsal-en alt (dA1/Atoh1 + etiketli hücreleri) ve iki taraf artan aksonal projeksiyon modelleri ortaya, her bir ayrı kordon farklı bir AP konumu ve uzar kaynaklanmaktadır. dA1 akson proje ve işitsel çekirdekleri, orta beyin ve beyincik 10 çok katmanlı form sinaps bulunmuştur.

Civciv elektroporasyon kombinasyonu, genetik nöronlar ve gelişme çok daha ileri aşamalarında projeksiyon sitelerinin analiz izleme beyindeki nöronal ağların oluşması ile çalışma ve devre oluşumunu düzenleyen moleküler mekanizmaları aydınlatmak için benzersiz bir platform sağlar.

Protokol

1. Beyin Elektroporasyon

1.1 Yumurta taşıma

  1. Nemlendirilmiş bir inkübatör (37-38,5 ° C) yatay olarak yumurta yerleştirin. Embriyolar onlar 16-17 (HH) evre (25-30 Somitlerin) ulaştığınızda, inkübasyon 65-70 saat sonra electroporated vardır.
  2. Inkübatör yumurta kaldırmak, onlar yatay konumda kalır.

1.2 Hazırlıklar

  1. Cam kılcal (0.5 mm çapında) çekin.
  2. Puls üreteci için bir adaptör sahibi ile bükülmüş L şeklinde altın Genetrodes elektrotlar (3 mm çapında) bağlayın. Elektroporasyon parametreleri 25 volt, 5 darbe sayısının, 45 msn darbe uzunluğu, 300 msn darbe aralıklarla içerir.
  3. Bir ağız pipet, 10 ml şırınga iğnesi, parafilm şeritler, yumuşak bir fırça, keskin diseksiyon makas ve 25 ml steril PBS çözeltisi hazırlayın. Bu miktar genellikle yumurta kabı (18 yumurta) işlemek için yeterlidir.
  4. DNA plazmid yeterli bir karışımı (5 mg / ml her biri) hazırlayın veDNA enjeksiyon görselleştirmek için 0.025% Hızlı Yeşil boya hakkında ekleyin. Ortalama 4 ul bir hacmi bir tepsi enjeksiyon için yeterlidir.

1.3 Pencereleme, Enjeksiyon ve Elektroporasyon

  1. % 70 etanol ile yumurta kabukları temizleyin.
  2. Havaya embriyonik maruz kalma süresi en aza indirmek için her seferinde bir yumurta tutun.
  3. Makas uçları ile yumurta kutbunda bir delik açın ve şırınga ile albumin 3-4 ml kaldırın. Bu canlılığı azaltır olarak albümin daha büyük bir miktarda çıkarmayın.
  4. Diseksiyon makas kullanarak yumurta kabuğu üst merkezinde küçük bir oval pencere (2,5 x 2 cm boyutlarında) açın.
  5. Tüm süreç boyunca kuruyana önlemek için embriyonun üst PBS birkaç damla damla.
  6. Bardağa DNA karışımı, az miktarda yük bir ağız pipet kullanarak kılcal.
  7. Eğer yönelik arka ucu ile embriyo yerleştirin. Embriyo açıkça görünür olduğu gibi mürekkep püskürtme bu aşamada gereklidir. Mürekkep püskürtme artar kaçınmakembriyonik hayatta. ~ 45 ° kılcal tutarak kuyruk arka beyin nüfuz. Embriyo etrafında herhangi bir membran çıkarmayın. Hava kabarcığı oluşturmadan Beyin lümen ve nefes dikkatle DNA çözümü enjekte edilir. DNA çözüm öne yayılır.
  8. Hemen DNA enjeksiyonu sonrası, kesin AP ve hedef hedefliyoruz DV Beyin pozisyonda paralel elektrotlar yerleştirin. Bu canlılığı azaltabilir gibi, kalp dokunmadan biraz ventral elektrotlar itin. Elektroporatör darbe. Elektrotlar (Şekil 1A) elektriksel iletkenlik belirtmek için kabarcıkları ile örtülmelidir.
  9. Dikkatlice elektrotlar ve embriyo soğutmak için ve kabarcıklarını çıkarmak için PBS birkaç damla damla. Inkübasyon sırasında kurumasını önlemek için bir parafilm şeridi düzgün açılması yumurta Seal. Yumuşak bir fırça ile PBS içinde elektrotlar yıkayın.
  10. Istenen zaman uzunluğu için inkübatör yumurta yerleştirin. Embriyoların hayatta kalma 2-3 gün sonra yaklaşık% 90elektroporasyon, ve 50% elektroporasyon takip eden 12 gün öncesine kadar azaltır.

2. Embriyolar Analizi

2.1 Düz montaj hazırlanması ve immunofloresan

  1. Beyin düz-montaj hazırlıkları kolayca bir mikroskop ya da stereo-mikroskop altında aksonlar görselleştirmek için E6.5 kadar yapılabilir.
  2. Zarlarında ve kan damarları ayrılarak dikkatlice embriyo ayır. PBS içeren kaplı Petri kabı - küçük bir silikon embriyo yerleştirin. Dorsal karşı karşıya tungsten işaretçilerine ile çanak embriyo takın. Beyin keskin cam kapilerleri kullanarak çatı plakalı bir dorsal yarık gerçekleştirin.
  3. Keskin cımbız ve mikro-makas kullanılarak başın üst kısmını tutun ve rostral gelen kaudal çok dikkatli bir şekilde arka beyin dokusu çekin. Beyin ayrılmasından sonra temiz bir hazırlık ulaşmak için kalan ventral doku çıkarın.
  4. 4 Beyin inkübeOda sıcaklığında 1-2 saat boyunca% paraformaldehid (PFA) çözeltisi (RT). PFA kaldırmak için PBT (PBS/0.1% Triton X-100) ile arka beyin yıkayın.
  5. Düz monte hindbrains içinde İmmünofloresan için engelleme çözüm 500 ul (4 ON 1. antikor ° PBT ile C Yıkama (15 dakika x 3) ile oda sıcaklığında inkübe az 2 saat PBT ve inkübe keçi serumu% 5 ekleyin. Inkübe oda sıcaklığında 2 saat boyunca 2 nci antikor ile. PBT (15 dakika x 3) ile yıkayın.
  6. Bir cam slayt dorsal bakan arka beyin yerleştirin. Beyin üzerine floresan montaj medya ekleyin. Slaytta arka beyin düzleştirmek için cam kapiller veya tungsten iğne kullanın.
  7. Kapak kayma ile doku sıkma önlemek için her köşesinde yağ az miktarda ekleyin. Beyin üstüne bir kapak kayma dikkatlice yerleştirin ve hava kabarcıkları kaçının. Yapışma için cam kenarlarını kaplayacak şekilde tırnak cilası ekleyin.

2.2 Cryo-bölümleri ve İmmünofloresan

  1. Beyin sapı ca Cryo-bölümlerin aksonal yörüngeleri görselleştirmek için herhangi bir aşamada gerçekleştirilebilir. Ancak, E6.5 sonra bu çok kalın olur düz monte edilmiş embriyo, içinde aksonlar görselleştirmek için zorluk nedeniyle tercih edilen yöntem olmalıdır. Ayrıca, sinaps gösteri doku ve mikroskop altında bir yüksek büyütme bakış kesit gerektirir.
  2. Embriyo incelemek ve tüm çevre dokulara çıkarın. PBS ile durulayın. Mikro-makas ve keskin cımbız kullanarak medulla kuyruk kısmında embriyo kesin. Beyincik ve orta beyin arasında geniş bir kesi yapmak ve tüm beyin sapı çıkarın. Doku medulla, pons ve beyincik içermelidir.
  3. PBS (10 dakika x 3) ile yıkayın, 4 gece için% 4 PFA (ON) ° C beyin sapı düzeltmek ve ON 4 ° C batan kadar% 30 sakaroz ile kuluçkaya yatmaktadır.
  4. OCT (Optimal Kesme Sıcaklık) bileşik bir cryo-kalıp Beyin Embed ve dondurma gibi başka bir yerde 11 açıklandığı kadar -20 ° C'de yerleştirin.
  5. İstenen kesit eksende kriyostat içinde OCT blok yerleştirin. Kesit genişliği 12 mm.
  6. Slaytlar kurulayın. Oda sıcaklığında 2 saat için her bir slayt üzerine 100 ul blokaj solüsyonu eklenir. Antikor 100 ul (istenen konsantrasyonu için engelleme çözeltisi içinde seyreltilmiş) ilave edilir. 1. ve 2. antikorlar için kuluçka süresi 4 de AÇIK sırasıyla oda sıcaklığında ° C veya 2 saat,. Her inkübasyon süresi için, hafifçe kuruluğu önlemek için slayt üstüne parafilm şeridi ekleyin. Antikorlar arasında PBS (10 dakika x 3) ile yıkayın. Gerekirse, oda sıcaklığında 20 dakika boyunca PBS içinde 1:1000 seyreltilmiş Dapi (4'-6-Diamidino-2-fenilindol) ekleyin. PBS ile durulayın.
  7. Floresan montaj medya ile slayt monte edin. Analizden önce 1 saat kurumasını bekleyin.

Sonuçlar

Bu protokol son zamanlarda civciv Beyin 10 internöron dA1 alt grubu aksonal desen ve projeksiyon siteleri ortaya çıkarmak için kullanıldı. Özellikle bu aksonlar etiketlemek için, önce spinal DI1 nöronlar 8,12,13 için özel olarak karakterize edilmiş bir arttırıcı elemanı (Atoh1), arka beyin dA1 hücreleri 10 olarak ifade edilmesi doğrulandı. Eleman Cre recombinase ve plazmid bir Cre bağımlı sitoplazmik GFP muhabiri (; Şekil 1BI pCAGG-LoxP-Stop-LoxP-...

Tartışmalar

Ovo elektroporasyon civciv sinir sistemi gelişimi 20 sırasında hücre özellikleri ve aksonal rehberlik incelemek için uygun bir, güvenilir ve etkili bir araçtır. Bu protokolde özel internöronlar koşullu etiketlenmesini sağlayan güçlendirici elemanlar kullanarak E2.75 de civciv Beyin içinde elektroporasyon bir modunu tanımlamak. Bu strateji embriyogenez ileri aşamalarında aksonal yolları, projeksiyonlar ve sinaptik siteleri izleme sağlayan civciv genom, yabancı genlerin eklemek i?...

Açıklamalar

çatışması ilan etti.

Teşekkürler

Biz elektroporasyon gösterim amacıyla Dr Yuval Gottlieb-Dror teşekkür ederim. Bu çalışma İsrail'de Psikobiyoloji için Ulusal Enstitüsü ve Niedersachsen-İsrail Araştırma işbirliği programından DSD için hibe tarafından ve İsrail Bilim Vakfı, sağlık İsrail bakanlığı ve Mükemmeliyet Legacy Mirası Merkezi'nden AK hibe tarafından desteklenmiştir Biyomedikal Bilim ortaklık.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
L-shaped gold Genetrodes 3 mm electrodesBTX, Harvard Apparatus45-0162
pulse generator, ECM 830BTX, Harvard Apparatus45-0002
OCT (Optimal Cutting Temperature) CompoundTissue-Tek Sakura4583 O.C.T. Compound
Nail PolishFrom Any Commercial Supplier

Referanslar

  1. Altman, J., Bayer, S. A. Development of the precerebellar nuclei in the rat: II. The intramural olivary migratory stream and the neurogenetic organization of the inferior olive. J. Comp. Neurol. 257, 490-512 (1987).
  2. Rose, M. F., Ahmad, K. A., Thaller, C., Zoghbi, H. Y. Excitatory neurons of the proprioceptive, interoceptive, and arousal hindbrain networks share a developmental requirement for Math1. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 22462-22467 (2009).
  3. Storm, R., et al. The bHLH transcription factor Olig3 marks the dorsal neuroepithelium of the hindbrain and is essential for the development of brainstem nuclei. Development. 136, 295-305 (2009).
  4. Lumsden, A. The cellular basis of segmentation in the developing hindbrain. Trends Neurosci. 13, 329-335 (1990).
  5. Liu, Z., et al. Control of precerebellar neuron development by Olig3 bHLH transcription factor. J. Neurosci. 28, 10124-10133 (2008).
  6. Muller, T., et al. The bHLH factor Olig3 coordinates the specification of dorsal neurons in the spinal cord. Genes Dev. 19, 733-743 (2005).
  7. Avraham, O., et al. Motor and dorsal root ganglion axons serve as choice points for the ipsilateral turning of dI3 axons. J. Neurosci. 30, 15546-15557 (2010).
  8. Avraham, O., et al. Transcriptional control of axonal guidance and sorting in dorsal interneurons by the Lim-HD proteins Lhx9 and Lhx1. Neural Dev. 4, 21 (2009).
  9. Avraham, O., Zisman, S., Hadas, Y., Vald, L., Klar, A. Deciphering axonal pathways of genetically defined groups of neurons in the chick neural tube utilizing in ovo electroporation. J. Vis. Exp. (39), e1792 (2010).
  10. Kohl, A., Hadas, Y., Klar, A., Sela-Donenfeld, D. Axonal Patterns and Targets of dA1 Interneurons in the Chick Hindbrain. J. Neurosci. 32, 5757-5771 (2012).
  11. Vogel, J., Mobius, C., Kuschinsky, W. Early delineation of ischemic tissue in rat brain cryosections by high-contrast staining. Stroke. 30, 1134-1141 (1999).
  12. Helms, A. W., Abney, A. L., Ben-Arie, N., Zoghbi, H. Y., Johnson, J. E. Autoregulation and multiple enhancers control Math1 expression in the developing nervous system. Development. 127, 1185-1196 (2000).
  13. Lumpkin, E. A., et al. Math1-driven GFP expression in the developing nervous system of transgenic mice. Gene Expr. Patterns. 3, 389-395 (2003).
  14. Lu, Y., Lin, C., Wang, X. PiggyBac transgenic strategies in the developing chicken spinal cord. Nucleic Acids Res. 37, e141 (2009).
  15. Wang, J., et al. piggyBac-like elements in the pink bollworm, Pectinophora gossypiella. Insect Mol. Biol. 19, 177-184 (2010).
  16. Alsina, B., Vu, T., Cohen-Cory, S. Visualizing synapse formation in arborizing optic axons in vivo: dynamics and modulation by BDNF. Nat. Neurosci. 4, 1093-1101 (2001).
  17. Leal-Ortiz, S., et al. Piccolo modulation of Synapsin1a dynamics regulates synaptic vesicle exocytosis. J. Cell Biol. 181, 831-846 (2008).
  18. Gardzinski, P., et al. The role of synaptotagmin I C2A calcium-binding domain in synaptic vesicle clustering during synapse formation. J. Physiol. 581, 75-90 (2007).
  19. Nowack, A., Yao, J., Custer, K. L., Bajjalieh, S. M. SV2 regulates neurotransmitter release via multiple mechanisms. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 299, C960-C967 (2010).
  20. Itasaki, N., Sharpe, J., Morrison, A., Krumlauf, R. Reprogramming Hox expression in the vertebrate hindbrain: influence of paraxial mesoderm and rhombomere transposition. Neuron. 16, 487-500 (1996).
  21. Clarke, J. D., Lumsden, A. Segmental repetition of neuronal phenotype sets in the chick embryo hindbrain. Development. 118, 151-162 (1993).
  22. Diaz, C., Glover, J. C., Puelles, L., Bjaalie, J. G. The relationship between hodological and cytoarchitectonic organization in the vestibular complex of the 11-day chicken embryo. J. Comp. Neurol. 457, 87-105 (2003).
  23. Marin, F., Puelles, L. Morphological fate of rhombomeres in quail/chick chimeras: a segmental analysis of hindbrain nuclei. Eur. J. Neurosci. 7, 1714-1738 (1995).
  24. Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector. Gene. 108, 193-199 (1991).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

N robilimSay 75N robiyolojiGeli im BiyolojisiH cresel BiyolojiMolek ler BiyolojiAnatomiFizyolojiGenetikElektroporasyonChickarka beyinAksonInterneurondA1piggyBacArt r cSynapsen ronlaraksonlarGFP ifadeOvoEmbriyonik arka beyinbeyinhayvan modeli

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır