병아리 배아에서 축삭 궤적과 시냅스 대상을 추적하는 후뇌의 일렉트로

요약

발달 신경 생물학의 근본적인 문제는 어떻게 신경 네트워크가 배아 뇌에 설립되어있다. 여기에서 우리는 크레 / 훈제 연어 - 플라스미드와 지느러미의 interneurons 레이블을 다양한 발달 단계에서 자신의 축삭 돌기 시냅스 목표를 추적하는 조류 후뇌의 PiggyBac 매개 DNA 전위 시스템과 같은 새로운 유전 도구와의 electroporation 기술을 결합했다.

초록

병아리 배아 신경 튜브의 일렉트로는 신경 세포에 외래 유전자의 발현에 대한 신속하고 효율적인되는 등 많은 장점이 있습니다. 이 논문에서 우리는, 특별히 신경 전구 세포의 하위 집합에 레이블을 지정하기 위해 E2.75에 새 후뇌로 DNA를 electroporate하는 방법을 독특하게 보여줍니다 방법, 방법 개발의 많은 고급 단계에서 자신의 축삭 돌기 시냅스 목표를 수행하는 방법 제공 최대 E14.5합니다. 기반의 플라스미드와 후뇌 세포 (의 interneurons, DA1의 지느러미 가장 하위 그룹)의 하위에 GFP 발현을 유도하는 PiggyBac 매개 DNA 전위 시스템 - 우리는 특정 증강 요소, 크레 / 훈제 연어 등의 소설 유전 도구를 활용했다. 축삭의 탄도와 DA1 축삭의 목표는 다양한 뇌간 지역에서 초기 및 후기 배아 단계에서 다음입니다. 이 전략은 배아 후뇌에 대한 관심의 세포를 타겟팅하고 tra에 대한 고급 기술에 기여개발의 여러 단계에서 회로 형성의 cing.

서문

후뇌 오름차순와 신경 네트워크를 내림차순를 통해 중앙과 주변 신경 시스템 간의 통신에 의한 신경계의 중요한 중계 허브를 나타냅니다. 그것은 호흡, 의식, 청각,와 모터 조정 ^1-3 등의 기본적인 기능을 조절한다. 초기 배아 발달 동안 척추 후뇌는 일시적으로 서로 다른 신경 세포 유형을 형성하고 여러 뇌간 핵 센터 ⁴ 생성되는 반복 rhombomeres로의 전후방 (AP) 축을 따라 세분화된다. 후뇌는 개별 신경 세포의 전구 세포가 지정되고 별개의 DV 위치에 ^3,5,6을 차별화하는 기초와 날개의 접시에 자사의 지느러미 - 복부 (DV) 축을 따라 구분됩니다. 초기 AP와 DV 특정 신경 세포의 패턴 기능 뇌간 회로에의 설립을 관리하는 방법은 크게 알려지지 않은 것입니다.

이 기본에 대한 지식을 얻기 위해질문 도구는 초기 후뇌에있는 뉴런의 특정 하위 집합에 레이블을 지정하려면보다 고급 단계에서 자신의 축삭 탄도와 연결을 추적하기 위해 필요합니다. 우리는 이전에 특정 증강 요소를 활용하고, 초기 병아리 배아 ^7-9 지느러미 척추의 interneurons의 축삭 궤적을 추적 크레 / LoxP 기반 조건식 시스템에있다. 현재 원고에서 우리는 후뇌를 대상으로하고 수정 일렉트로 전략과 PiggyBac 사용 후기 배아 후뇌의의 interneurons, 축삭과 시냅스 목표를 라벨에 대한 실험 패러다임 업그레이드 - 중재 DNA 전위합니다. 우리의 새로운 전략은 2 최대 12 일 ~ 후뇌과 축삭 돌기 다양한 배아 단계에서 시냅스 사이트의 추적의 한면에 서로 다른 신경 세포 아형의 태그가 일렉트로 다음 수 있습니다. 이 방법에 따라, 우리는 후뇌의의 interneurons의 지느러미 - 대부분의 서브 그룹 (dA1/Atoh1을 ⁺ 표시 세포)와 두 개의 반대측 오름차순 축삭 돌기 패턴을 밝혀, 각각은 별개의 삭조에서 다른 AP의 위치와이 신장에서 파생됩니다. DA1 축삭은 프로젝트와 청각 핵, 중뇌 및 소뇌 ^(10)의 여러 계층에서 폼 시냅스에 발견되었다.

병아리의 electroporation의 조합은 유전자가 신경 세포와 개발의 많은 고급 단계에서 투영 사이트 분석 추적 뇌의 신경 네트워크의 형성을 연구 및 회로 형성을 제어하는​​ 분자 메커니즘을 해명하는 독특한 플랫폼을 제공합니다.

프로토콜

1. 후뇌의 Electroporation에

1.1 에그 처리

1. 가습 배양기 (37-38.5 ° C)에서 수평으로 계란을 넣습니다. 배아들은 16-17 (HH) 단계 (25-30 somites)에 도달했을 때, 배양 65 ~ 70 시간 후 electroporation하여 있습니다.
2. 인큐베이터에서 계란을 제거, 그들은 수평 위치에 남아 있습니다.

1.2 준비

1. 유리 모세관 (0.5 mm 직경)을 당깁니다.
2. 펄스 발생기에 어댑터 홀더 구부러진 L-모양의 금 Genetrodes 전극 (3 mm 직경)를 연결합니다. 일렉트로 매개 변수는 25 볼트 5 펄스 수, 45 밀리 초 펄스 길이 300 밀리 초 펄스 간격이 (가) 있습니다.
3. 입 피펫, 10 ML의 주사기 바늘, 파라 필름 (parafilm) 스트립, 부드러운 브러시, 날카로운 해부 가위, 25 ML 멸균 PBS 용액을 준비합니다. 이 금액은 일반적으로 계란 트레이 (18 알)을 처리하기에 충분합니다.
4. DNA 플라스미드의 적절한 혼합 (5 ㎍ / ㎕의 각을)를 준비하고DNA 주사를 시각화하는 0.025 % 빠른 그린 염료에 대해 추가합니다. 보통 4 μL의 볼륨 트레이의 주입을위한 충분합니다.

1.3 윈도우, 사출 및 Electroporation에

1. 70 % 에탄올로 달걀 껍질을 청소합니다.
2. 공기에 배아 노출 시간을 최소화하기 위해 한 번에 하나의 계란을 처리합니다.
3. 가위 끝 계란 극에 구멍을 뚫어 주사기와 알부민의 3-4 ML를 제거합니다. 그것은 생존을 감소로 알부민의 큰 금액을 제거하지 마십시오.
4. 해부 가위를 사용하여 달걀 껍질의 상단 중앙에 작은 타원형 창 (2.5 × 2 cm 크기)를 엽니 다.
5. 전체 과정 동안 건조를 방지하기 위해 태아의 상단에 PBS 몇 방울을 드립.
6. 유리에 DNA 혼합물의 작은 금액을로드하면 입 피펫을 사용하여 모세관.
7. 쪽으로의 후방 끝 배아를 놓습니다. 배아가 명확하게 볼 수로 잉크가 주입이 단계에서 필요하지 않습니다. 잉크 분사 증가 방지배아 생존. ~ 45 °에서 모세관을 잡고 꼬리 후뇌에 침투. 배 주위로부터 막을 제거하지 마십시오. 공기 방울을 형성하지 않고 후뇌 루멘 내쉬고 조심스럽게 DNA 용액을 주입. DNA 솔루션은 전방으로 펼쳐집니다.
8. 바로 DNA 주입 한 후, 정확한 AP 및 대상을 목표로 DV의 후뇌 위치에서 평행 전극을 배치합니다. 이 가능성을 줄일 수 있으므로, 마음을 건드리지 않고 약간 ventrally 전극을 밀어 넣습니다. electroporator를 펄스. 전극 (그림 1A) 전기 전도도를 나타내는 거품으로 덮여해야합니다.
9. 조심스럽게 전극을 제거하고 배아를 냉각하고 거품을 제거하기 위해 PBS 몇 방울을 똑. 배양 중에 건조를 방지하기 위해 파라 필름 (parafilm) 스트립이 제대로 개방 계란을 밀봉하십시오. 부드러운 브러시로 PBS에 전극을 세척 할 것.
10. 시간의 원하는 기간 동안 인큐베이터에 계란을 넣습니다. 배아의 생존을 2 ~ 3 일 후에 약 90 %로일렉트로, 그리고 50 %의 electroporation 후 최대 12 일이 줄어 듭니다.

2. 배아의 분석

2.1 평면 마운트 준비와 면역

1. 후뇌의 평면 마운트 준비는 쉽게 현미경 또는 입체 음향 현미경으로 축삭을 시각화하기 위해 E6.5까지 수행 할 수 있습니다.
2. 주변 점막과 혈관에서 분리하여 조심스럽게 배아를 해부. PBS를 포함하는 코팅 페트리 접시 - 작은 실리콘에 배아를 놓습니다. dorsally에 직면 텅스텐 핀으로 접시에 배아를 연결합니다. 후뇌 날카로운 유리 모세관을 사용하여 지붕 플레이트 등의 슬릿을 수행합니다.
3. 날카로운 핀셋 및 마이크로 가위를 사용하면 머리의 상단 부분을 잡고 주동이의 꼬리에 매우 신중 후뇌 조직을 당겨. 후뇌의 분리 후 깨끗한 준비 도달하기 위해 남아있는 복부 조직을 제거합니다.
4. 4와 후뇌을 품어상온에서 1 ~ 2 시간 동안 % 파라 포름 알데히드 (PFA) 용액 (RT). PFA를 제거하는 PBT (PBS/0.1 % 트리톤 X-100)와 후뇌을 씻으십시오.
5. 평면 장착 hindbrains에서 면역 형광에 대한 차단 솔루션을 500 μL (4시 ON ¹ 차 항체 ° PBT와 C. 워시 (15 분 × 3)와 RT 품어에서 2 시간 동안 PBT와 부화에있는 염소 혈청의 5 %를 추가합니다. 품어은 RT에서 2 시간 동안 ^{2 차} 항체. PBT (15 분 × 3)로 씻으십시오.
6. 유리 슬라이드에 dorsally 직면 후뇌를 놓습니다. 후뇌에 형광등 설치 미디어를 추가 할 수 있습니다. 슬라이드 후뇌을 평평하게하는 유리 모세관 또는 텅스텐 바늘을 사용합니다.
7. 커버 슬립에 의해 조직의 압박을 방지하기 위해 각 모서리에 그리스의 작은 금액을 추가합니다. 후뇌의 상단에 커버 슬립을 조심스럽게 배치하고 공기 방울을 피하십시오. 준수를위한 유리제 가장자리를 커버하기 위해 매니큐어를 추가합니다.

2.2 극저온 섹션과 면역 형광

1. 뇌간 CA의 극저온 섹션N 축삭 궤적을 시각화하는 모든 단계에서 수행 할 수. 그러나, E6.5 후이 너무 두껍게되어 평면 장착 배아에서 축삭을 시각화하는 데 어려움으로 인해 선호하는 방법이어야한다. 또한, 시냅스의 데모 조직과 현미경 고배율보기의 단면이 필요합니다.
2. 배아를 해부하고 모든 주변 조직을 제거합니다. PBS로 씻어. 마이크로 가위와 날카로운 핀셋을 사용하여 수질의 꼬리 부분에서 배아를 잘라. 소뇌와 중뇌 사이의 넓은 절개를 확인하고 전체 뇌간를 제거합니다. 조직 수질, 뇌교와 소뇌를 포함해야합니다.
3. PBS (10 분 × 3)로 씻어 4에서 밤새 4 % PFA (ON) ° C에서 뇌간을 수정하고 ON 4 ° C에서 침몰까지 30 % 자당에 품어.
4. 10월 (최적 절삭 온도) 화합물 CRYO-금형 후뇌를 포함하고, 냉동, 다른 곳과 마찬가지로 ¹¹ 설명까지 -20 ° C에 배치합니다.
5. 원하는 단면 축에 그라 이오 스탯에 OCT의 블록을 놓습니다. 섹션 폭은 12 μm의 수 있습니다.
6. 슬라이드를 건조. RT에서 2 시간 동안 각 슬라이드에 100 μl를 차단 솔루션을 추가합니다. 항체 100 μl를 (원하는 농도 차단 용액에 희석)을 추가합니다. ¹ 차 및 ^{2 차} 항체 배양 기간은 4시에 ON으로 각각 RT에서 ° C 또는 2 시간. 각 배양 시간 동안 부드럽게 건조를 방지하기 위해 슬라이드의 상단에 파라 필름 (parafilm) 스트립을 추가합니다. 항체 사이의 PBS (10 분 × 3)로 씻으십시오. 필요한 경우, RT에서 20 분 동안 PBS에 희석 1:1,000 DAPI을 (4'-6-Diamidino-2-페닐 인돌) 추가합니다. PBS로 씻어.
7. 형광등 설치 미디어 슬라이드를 장착합니다. 분석하기 전에 1 시간 동안 건조하자.

결과

이 프로토콜은 최근 병아리 후뇌 ^10의 interneurons의 DA1 하위 그룹의 축삭 패턴 및 프로젝션 사이트를 발견하는 데 사용되었다. 특히 이러한 축삭에 레이블을 지정하려면, 이전에 척추 DI1 신경 ^8,12,13 특정으로 특징 된 증강 요소 (Atoh1은), 후뇌 DA1 세포를 ^10으로 표현할 수 있도록이 확인했습니다. 요소는 크레 재조합 플라스미드 크레 따라 세포질 GFP 기자 (; 그림 1BI

토론

비켜 electroporation에있는 병아리 신경 시스템 개발 ^20시 세포의 사양과 축삭 지침을 검토하는 가능한, 신뢰할 수있는 효과적인 도구입니다. 이 프로토콜에서는 특정의 interneurons의 조건 라벨을 사용 증강 요소를 사용하여 E2.75에 병아리 후뇌에있는 일렉트로의 모드를 설명합니다. 이 전략은 배아의 고급 단계에서 축삭 노선 계획과 시냅스 사이트의 추적을 가능하게 병아리 게놈에 외?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
L-shaped gold Genetrodes 3 mm electrodes	BTX, Harvard Apparatus	45-0162
pulse generator, ECM 830	BTX, Harvard Apparatus	45-0002
OCT (Optimal Cutting Temperature) Compound	Tissue-Tek Sakura	4583 O.C.T. Compound
Nail Polish	From Any Commercial Supplier