Electroporation של המוח האחורי כדי לעקוב אחר מסלולים ויעדי axonal Synaptic בעובר האפרוח

Summary

איך רשתות עצביות נוצרות במוח העוברי היא שאלה בסיסית בנוירוביולוגיה התפתחותית. כאן אנו בשילוב טכניקת electroporation עם כלים גנטיים חדשים, כגון מערכת טרנספוזיציה DNA PiggyBac בתיווך במוח האחורי העופות לתייג interneurons גב ולעקוב אחר תחזיות axonal ומטרות סינפטיים בשלבי התפתחות שונים Cre / קס-פלסמידים ו.

Abstract

Electroporation של הצינור העצבי החומוס העוברי יש יתרונות רבים כגון להיות מהיר ויעיל לביטוי של גנים זרים לתוך תאים עצביים. בכתב היד הזה אנו מספקים שיטה ייחודית המדגימה כיצד electroporate דנ"א לתוך המוח האחורי העופות בE2.75 כדי לתייג את קבוצת משנה של אבות עצביים באופן ספציפי, וכיצד לעקוב אחרי תחזיות axonal ומטרות סינפטיים בשלבים מתקדמים הרבה של פיתוח, עד E14.5. יש לנו מנוצלים כלים גנטיים חדשים כולל אלמנטים ספציפיים משפר, Cre / קס - פלסמידים מבוססי ומערכת ה-DNA טרנספוזיציה PiggyBac בתיווך לנהוג ביטוי של GFP בתת סוג של תאי מוח אחוריים (רוב תת קבוצה של interneurons הגבי, dA1). מסלולים ויעדים של dA1 האקסונים axonal הם אחריו בשלבים עובריים מוקדמים ומאוחר באזורי גזע מוח שונים. אסטרטגיה זו תורמת טכניקות מתקדמות למיקוד תאים של עניין במוח האחורי העוברי ועבור טרהcing היווצרות מעגלים בשלבים שונים של פיתוח.

Introduction

המוח האחורי מייצג רכזת ממסר מרכזית של מערכת העצבים על ידי תקשורת בין מערכות העצבים המרכזיות והיקפיות באמצעות עולה ויורד רשתות נוירונים. הוא מווסת את פונקציות בסיסיות כולל נשימה, תודעה, שמיעה, ומוטורי תיאום ^1-3. במהלך ההתפתחות עוברית מוקדמת, המוח האחורי החוליות מחולק transiently לאורך הציר (AP) קדמי, האחורי שלה לתוך rhombomeres חוזרת ונשנית, שבו תאים מסוגים שונים עצביים נוצרים וליצור מרכזי גרעיני גזע מוח מספר ^4. המוח האחורי מחולק גם לאורך הציר (DV) גב, גחונו לתוך צלחת בסיס ועלאר, שבו אבות עצביים בדידים להפוך צוינו ולהבדיל במקומות שונים DV ^3,5,6. איך מוקדם AP וDV ספציפיים הדפוסים עצביים המסדירים את הקמתה של circuitries גזע המוח תפקודי הוא במידה רבה לא ידוע.

כדי לצבור ידע על זה בסיסישאלה, כלים הנדרשים כדי לתייג תת ספציפית של תאי עצב במוח האחורי מוקדם ולעקוב אחר המסלולים וקישוריות axonal בשלבים מתקדמים יותר. יש לנו מנוצלים בעבר אלמנטים משפר ספציפיים, ומערכת משפט תנאי Cre / מבוסס LoxP למעקב אחר המסלול של axonal interneurons השדרה הגבי בעובר האפרוח מוקדם ^7-9. בכתב היד הנוכחית יש לנו ממוקד למוח האחורי ומשודרג פרדיגמה הניסויית לתיוג interneurons המאוחר עוברי המוח האחורי, אקסונים והיעדים סינפטיים שלהם, משתמש באסטרטגיה שונה וelectroporation PiggyBac - טרנספוזיציה DNA התיווך. האסטרטגיה החדשה שלנו מאפשרת התיוג של תת עצביים נפרדים בצד אחד של המוח האחורי ואת המעקב של תחזיות axonal ואתרים סינפטיים בשלבים עובריים שונים, מ -2 עד 12 ימים לאחר electroporation. המבוסס על שיטה זו, אנו הכותרת הגבי ביותר תת קבוצה של interneurons המוח האחורי (dA1/Atoh1 ⁺ תאים למעלה) וחשף שני דפוסי הקרנת axonal עולים נגדיים, כל אחד נובע ממיקום AP שונה ומתארכת בחבל טבור מובהק. dA1 אקסונים נמצאו פרויקט וסינפסות טופס בשמיעת גרעינים, המוח התיכון ובשכבות מרובות של המוח הקטן ^10.

שילוב של electroporation האפרוח, התחקות הגנטית של תאי עצב וניתוח של אתרי הקרנה בשלבים מתקדמים של פיתוח רבים מספק פלטפורמה ייחודית ללמוד את היווצרותם של רשתות עצביות במוח ועל מנת להבהיר מנגנונים מולקולריים השולטים היווצרות מעגל.

Protocol

1. Electroporation המוח האחורי

טיפול ביצה 1.1

1. מניחים את הביצים בצורה אופקית בחממת humidified (37-38.5 מעלות צלזיוס). עוברי electroporated לאחר 65-70 שעות של דגירה, כשהם מגיעים 16-17 (HH) שלב (25-30 somites).
2. להסיר את הביצים מהחממה, הם נשארים במצב האופקי.

1.2 הכנות

1. משוך זכוכית נימים (בקוטר 0.5 מ"מ).
2. חבר אלקטרודות Genetrodes מכופף בצורת L זהב (קוטר 3 מ"מ) עם בעל מתאם למחולל הפעימות. פרמטרים Electroporation כוללים 25 וולט, 5 מספרים דופק, 45 אורך הפולס אלפיות, 300 מרווחי דופק msec.
3. הכן פיפטה פה, 10 מיליליטר מחט מזרק, רצועות parafilm, מברשת רכה, מספריים חדים ולנתח 25 מיליליטר פתרון PBS סטרילית. סכום זה הוא בדרך כלל מספיק כדי להתמודד עם מגש ביצים (18 ביצים).
4. הכן תערובת נאותה של פלסמידים DNA (5 מיקרוגרם / μl כל אחד) ולהוסיף על 0.025% צבע ירוק מהיר כדי להמחיש הזרקת ה-DNA. בדרך כלל בהיקף של 4 μl מספיק להזרקה של מגש.

1.3 Windowing, הזרקה וElectroporation

1. יש לנקות את קליפות ביצים עם 70% אתנול.
2. להתמודד עם ביצה אחת בכל פעם כדי לצמצם את זמן חשיפה עוברית לאוויר.
3. לעשות חור בקוטב הביצה עם קצות המספריים ולהסיר מיליליטר 3-4 של אלבומין עם המזרק. אין להסיר כמות גדולה יותר של אלבומין שכן הוא מפחית יכולת קיום.
4. פתח חלון סגלגל קטן (בגודל 2.5 ס"מ X 2) במרכז העליון של קליפת הביצה באמצעות המספריים לנתח.
5. לטפטף כמה טיפות של PBS על גבי של העובר כדי למנוע יובש במהלך כל התהליך.
6. טען כמות קטנה של תערובת ה-DNA לתוך נימי הזכוכית באמצעות פיפטה פה.
7. הנח את העובר עם הקצה האחורי שלה כלפיך. הזרקת דיו לא נדרשת בשלב זה כעובר נראה בבירור. הימנעות עליות הזרקת דיוהישרדות עוברית. לחדור למוח האחורי הזנב על ידי החזקת הנימים ב ~ 45 מעלות. אין להסיר כל קרום מסביב העובר. הזרק פתרון ה-DNA בזהירות לתוך לום המוח האחורי ולנשוף בלי ליצור בועות אוויר. פתרון ה-DNA מתפשט anteriorly.
8. מייד לאחר הזרקת ה-DNA, הנח את האלקטרודות המקבילות בAP המדויק ואת מיקום המוח האחורי DV אתם שואפים להתמקד. לדחוף את האלקטרודות מעט ventrally בלי לגעת בלב, כפי שהוא עשוי להפחית את הכדאיות. דופק electroporator. אלקטרודות צריכה להיות מכוסות בבועות כדי לציין מוליכות חשמלית (איור 1 א).
9. מוציא בזהירות את האלקטרודות ולטפטף כמה טיפות של PBS כדי לקרר את העובר וכדי להסיר בועות. לאטום את הביצה פותחת כראוי עם רצועת parafilm כדי למנוע התייבשות במהלך דגירה. שטוף אלקטרודות בPBS עם המברשת הרכה.
10. מניחים ביצה בחממה לאורך הרצוי של זמן. הישרדות של עוברים היא כ -90% אחרי 2-3 ימיםelectroporation, ומפחית עד 50% 12 ימים לאחר electroporation.

2. ניתוח של עוברים

2.1 הכנה וimmunofluorescence שטוח הר

1. ניתן לבצע את ההכנות שטוח הר המוח האחורי לE6.5 לדמיין האקסונים בקלות תחת מיקרוסקופ או סטריאו מיקרוסקופ.
2. לנתח את העובר בקפידה על ידי הפרדתו מקרומים המקיפים וכלי דם. הנח את העובר בסיליקון קטן - צלחת פטרי המכילה PBS מצופה. צרף את העובר לצלחת עם סיכות טונגסטן מול dorsally. לבצע חריץ בגב גג הצלחת באמצעות חדות זכוכית נימי המוח האחורי.
3. באמצעות פינצטה חדה ומייקרו מספריים להחזיק את החלק העליון של הראש ולמשוך את רקמת המוח האחורי בזהירות רבה ממקורי לזנב. לאחר ההפרדה של רקמות המוח האחורי להסיר הגחון שנותרו כדי להגיע להכנה נקיות.
4. דגירה המוח האחורי עם 4Paraformaldehyde% (PFA) פתרון עבור שעות 1-2 בטמפרטורת החדר (RT). שטוף את המוח האחורי עם PBT (PBS/0.1% טריטון X-100) כדי להסיר PFA.
5. לImmunofluorescence בhindbrains שטוח רכוב להוסיף 500 μl של פתרון חסימה (5% נסיוב עז בPBT ו דגירה במשך שעה 2 ב RT דגירה עם נוגדן 1 ^st ON ב 4 ° C. לשטוף עם PBT (15 דקות X 3). דגירה עם נוגדן ^nd 2 לשעה 2 ב RT. לשטוף עם PBT (15 דקות X 3).
6. מניחים את המוח האחורי מול dorsally בשקופית זכוכית. הוסף תקשורת הרכבה ניאון אל המוח האחורי. השתמש בזכוכית נימים או מחטי טונגסטן לשטח המוח האחורי בשקופית.
7. הוסף כמות קטנה של שומן בכל פינה כדי למנוע התכווצות של הרקמות על ידי להחליק את המכסה. זהירות במקום להחליק על גבי עטיפה של המוח האחורי ולמנוע בועות אוויר. לדבקות להוסיף לק כדי לכסות את קצות זכוכית.

2.2 סעיפי Cryo וImmunofluorescence

1. סעיפי Cryo של CA גזע המוחn להתבצע בכל שלב כדי להמחיש מסלולי עצב. ובכל זאת, אחרי E6.5 זו צריכה להיות שיטה המועדפת בשל הקושי לדמיין האקסונים בעובר שטוח רכוב, אשר הופך להיות סמיכים מדי. יתר על כן, הפגנה של סינפסות דורשת חתך של הרקמות ונוף גבוהה הגדלה תחת מיקרוסקופ.
2. לנתח את העובר ולהסיר את כל הרקמות הסובבות. יש לשטוף עם PBS. חותכים את העובר בחלק הזנב של הלשד באמצעות מיקרו מספריים ופינצטה חדה. ביצוע חתך רחב בין המוח הקטן והמוח התיכון ולהסיר את כל גזע המוח. הרקמה צריכה להכיל את הלשד, פונס ומוח הקטן.
3. תקן גזע המוח בPFA 4% ללילה (ON) ב 4 ° C, לשטוף עם PBS (10 דק 'x 3), ו דגירה עם 30% סוכרוז לON על 4 מעלות צלזיוס עד לטביעתה.
4. שבץ המוח האחורי בcryo-תבנית עם מתחם אוקטובר (טמפרטורה אופטימלית חיתוך), ולמקם אותו ב -20 מעלות צלזיוס עד הקפאה, כפי שתואר במקומות אחרים ^11.
5. מניחים את הגוש באוקטובר cryostat בציר החתך הרצוי. רוחב החתך הוא 12 מיקרומטר.
6. ייבש את השקופיות. הוסף פתרון חסימת μl 100 בכל שקופית במשך שעה 2 ב RT. הוסף 100 μl של נוגדנים (בדילול בפתרון החסימה לריכוז הרצוי). תקופת הדגירה של ¹ ו 2 ^nd נוגדנים היא על על 4 מעלות צלזיוס או 2 שעות ב RT, בהתאמה. לכל אחד זמן דגירה, בעדינות להוסיף רצועת parafilm על גבי השקופית כדי למנוע יובש. לשטוף עם PBS (10 דק 'x 3) בין נוגדנים. במידת צורך, להוסיף 1:1,000 DAPI (4'-6-diamidino-2-phenylindole), בדילול מלא PBS במשך 20 דקות ב RT. יש לשטוף עם PBS.
7. הר השקופית עם תקשורת הרכבה ניאון. תן יבש במשך שעה 1 לפני הניתוח.

תוצאות

פרוטוקול זה היה בשימוש לאחרונה לחשוף את דפוסי axonal ואתרי הקרנה של dA1 תת קבוצה של interneurons בחומוס המוח האחורי ^10. לתייג במיוחד אקסונים אלה, אלמנט משפר (Atoh1), שבעבר התאפיין כספציפיים לתאי עצב בעמוד השדרה dI1 ^8,12,13, אושר לבוא לידי ביטוי במוח האחורי dA1 תאים ^10. ה...

Discussion

ב electroporation אובו הוא כלי אפשרי, אמין, יעיל ולבחון מפרט תא והכוונה axonal במהלך אפרוח פיתוח מערכת עצבים ^20. בפרוטוקול זה אנו מתארים מצב של electroporation במוח האחורי החומוס בE2.75 באמצעות משפר אלמנטים המאפשרים תיוג המותנה של interneurons הספציפי. אסטרטגיה זו היא בשילוב עם ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
L-shaped gold Genetrodes 3 mm electrodes	BTX, Harvard Apparatus	45-0162
pulse generator, ECM 830	BTX, Harvard Apparatus	45-0002
OCT (Optimal Cutting Temperature) Compound	Tissue-Tek Sakura	4583 O.C.T. Compound
Nail Polish	From Any Commercial Supplier