Elektroporation des Hinterhirn zu Axonal Trajectories und Synaptic Treffer in der Embryo-Küken Trace

Zusammenfassung

Wie neuronale Netze sind in der embryonalen Gehirn etabliert ist eine grundlegende Frage in Entwicklungsneurobiologie. Hier haben wir eine Elektroporation kombiniert Technik mit neuartigen genetischen Werkzeugen, wie Cre / Lox-Plasmiden und DNA-vermittelte PiggyBac Umsetzung System in der aviären hindbrain nach dorsal Interneuronen kennzeichnen und verfolgen ihre axonalen Projektionen und synaptische Ziele auf verschiedenen Entwicklungsstadien.

Zusammenfassung

Elektroporation des Kükenembryonen Neuralrohr hat viele Vorteile, als schnell und effizient zur Expression fremder Gene in neuronalen Zellen. In diesem Manuskript bieten wir eine Methode, die eindeutig zeigt, wie DNA in das Vogelgrippe hindbrain elektroporieren bei E2.75 um spezifisch zu markieren eine Teilmenge von neuronalen Vorläuferzellen, und wie sie ihre axonalen Projektionen und synaptische Ziele bei viel fortgeschrittenen Stadien der Entwicklung zu folgen, bis E14.5. Basierten Plasmiden und der PiggyBac DNA-vermittelte Umsetzung System GFP-Expression in einem Subtyp von hindbrain Zellen (die dorsale meisten Untergruppe von Interneuronen dA1) fahren - Wir haben neue genetische Werkzeuge einschließlich spezifischer Enhancer-Elemente, Cre / Lox genutzt. Axonal Bahnen und Ziele dA1 Axone sind in der frühen und späten embryonalen Stadien an verschiedenen Hirnstamm Regionen gefolgt. Diese Strategie trägt fortgeschrittene Techniken zur gezielten Zellen von Interesse in der embryonalen hindbrain und traCing Schaltung Bildung in mehreren Stufen der Entwicklung.

Einleitung

Die hindbrain stellt einen wichtigen Relais Nabe des Nervensystems durch die Kommunikation zwischen den zentralen und peripheren Nervensystems über-und absteigenden neuronalen Netzen. Es regelt grundlegende Funktionen wie Atmung, Bewusstsein, Gehör und Motorik ^1-3. Während der frühen embryonalen Entwicklung wird der Wirbeltiere hindbrain transient entlang seiner anterior-posterioren (AP) Achse in sich wiederholenden Rhombomere, in denen verschiedene neuronale Zelltypen gebildet werden und erzeugen mehrere Hirnstammkerne Zentren ⁴ unterteilt. Die hindbrain wird auch entlang der dorsal-ventralen (DV) Achse in eine basale und alar Platte, an dem diskreten neuronalen Vorläuferzellen werden angegeben und differenzieren in verschiedene Standorte DV ^3,5,6 unterteilt. Wie die frühen AP und DV-spezifische neuronale Muster sind für die Errichtung von funktionellen Schaltkreisen Hirnstamm ist weitgehend unbekannt.

Um Wissen zu diesem grundlegenden gewinnenFrage, sind Werkzeuge erforderlich, um bestimmte Untergruppen von Neuronen im frühen hindbrain beschriften und ihre axonalen Bahnen und Konnektivität bei fortgeschrittenen Stadien zu verfolgen. Wir haben zuvor spezifische Enhancer-Elemente verwendet, und eine Cre / loxP-basierten bedingten Ausdruck System für die Verfolgung axonal Flugbahn des dorsalen spinalen Interneuronen in den frühen Hühnerembryozellen ^7-9. In der aktuellen Manuskript haben wir die hindbrain gezielt und aktualisiert die experimentelle Paradigma zur Kennzeichnung späten embryonalen hindbrain Interneuronen, Axone und deren synaptischen Ziele, mit einer modifizierten Elektroporation Strategie und die PiggyBac - vermittelte DNA Umsetzung. Unsere neue Strategie ermöglicht die Kennzeichnung von verschiedenen neuronalen Subtypen in einer Seite des hindbrain und die Verfolgung ihrer axonalen Projektionen und synaptische Sites an verschiedenen embryonalen Stadien, von 2 bis 12 Tage nach der Elektroporation. Basierend auf dieser Methode, beschriftet wir die meisten dorsal-Untergruppe von hindbrain Interneuronen (dA1/Atoh1 ⁺ Zellen) und zeigte zwei kontralaterale steigend axonale Projektion Muster leitet jeder von einem anderen AP Lage und dehnt sich in einer deutlichen funiculus. dA1 Axone wurden Projekt und das Formular Synapsen im auditorischen Kerne, Mittelhirn und in mehreren Schichten des Kleinhirns ¹⁰ gefunden.

Die Kombination von Küken Elektroporation genetischen Rückverfolgung von Neuronen und Analyse Projektionsstellen bei viel fortgeschrittenen Entwicklungsstadium bietet eine einzigartige Plattform, um die Bildung von neuronalen Netzwerken im Gehirn zu untersuchen und molekularen Mechanismen, die Schaltung Bildung regeln aufzuklären.

Protokoll

1. Rautenhirn Elektroporation

1.1 Egg Handling

1. Legen Sie die Eier horizontal in einem befeuchteten Inkubator (37 bis 38,5 ° C). Die Embryonen werden nach 65-70 h Inkubation Elektroporation, wenn sie 16-17 (HH) Stufe (25-30 Somiten) zu erreichen.
2. Entfernen Sie die Eier aus dem Inkubator, sondern bleiben in der horizontalen Position.

1.2 Vorbereitungen

1. Ziehen Glaskapillaren (0,5 mm Durchmesser).
2. Verbinden gebogenen L-förmigen Gold Genetrodes Elektroden (3 mm Durchmesser) mit einem Adapter Halter an den Impulsgenerator. Elektroporation Parameter umfassen 25 Volt, 5 Pulszahlen, 45 ms Pulslänge 300 ms Impulsintervalle.
3. Bereiten Sie eine Mund Pipette, 10 ml Spritze und Nadel, Parafilm-Streifen, mit einer weichen Bürste, scharfe Präparierscheren und 25 ml steriler PBS-Lösung. Dieser Betrag ist in der Regel ausreichend, um ein Ei Fach (18 Eier) zu behandeln.
4. Zur Vorbereitung eines angemessenen Mischung von DNA-Plasmide (5 ug / ul jeder) undfügen über 0,025% Fast Green Farbstoff DNA-Injektion zu visualisieren. Normalerweise wird ein Volumen von 4 ul ist ausreichend für die Injektion von einem Tablett.

1.3 Windowing, Injektion und Elektroporation

1. Reinigen Eierschalen mit 70% Ethanol.
2. Griff ein Ei auf einmal zu embryonalen Belichtungszeit, um Luft zu minimieren.
3. Machen Sie ein Loch im Ei-Pol mit der Schere Enden entfernen und 3-4 ml Albumin mit der Spritze. Nehmen Sie eine größere Menge von Albumin als es Lebensfähigkeit reduziert.
4. Öffnen Sie eine kleine ovale Fenster (2,5 x 2 cm Größe) in der oberen Mitte der Eierschale mit den Präparierscheren.
5. Tropfen einige Tropfen PBS auf der Oberseite des Embryos bis zur Trockenheit während des gesamten Prozesses zu verhindern.
6. Legen Sie eine kleine Menge des DNA-Gemisch in die Glaskapillare mit dem Mund ansaugen.
7. Setzen Sie den Embryo mit seinem hinteren Ende in Richtung zu Ihnen. Keine Tinte Injektion wird in dieser Phase erforderlich, da der Embryo ist deutlich sichtbar. Vermeiden Tinte Injektion erhöhtembryonale Überleben. Dringen die Schwanzflosse hindbrain indem die Kapillare bei ~ 45 °. Entfernen Sie keine Membran aus der ganzen Embryo. Spritzen DNA-Lösung vorsichtig in den hindbrain Lumen und ausatmen ohne Bildung von Luftblasen. DNA-Lösung breitet vorn.
8. Unmittelbar nach der DNA-Injektion, legen Sie die parallele Elektroden genau an der AP und DV hindbrain Position, die Sie wollen Ziel. Drücken Sie die Elektroden leicht ventral ohne Berührung des Herzens, wie es Lebensfähigkeit verringern kann. Pulse die Elektroporator. Die Elektroden in Blasen abgedeckt werden, um elektrische Leitfähigkeit zeigen (Abb. 1A).
9. Entfernen Sie vorsichtig die Elektroden und tropft einige Tropfen PBS, um den Embryo zu kühlen und Luftblasen zu entfernen. Verschließen Sie die Öffnung Ei richtig mit einem Parafilm Streifen der Trocknung während der Inkubation zu verhindern. Waschen Elektroden in PBS mit der weichen Bürste.
10. Platzieren Ei in den Inkubator für die gewünschte Zeitdauer. Überleben von Embryonen etwa 90% 2-3 Tage nachElektroporation, reduziert und bis zu 50% 12 Tage nach der Elektroporation.

2. Analyse von Embryonen

2.1 Flat-Mount Vorbereitung und Immunfluoreszenz

1. Flat-Mount-Präparaten der hindbrain können bis E6.5 durchgeführt werden, um einfach visualisieren Axone unter einem Mikroskop oder einem Stereo-Mikroskop.
2. Präparieren Sie die Embryo sorgfältig trennt sie vom umgebenden Membranen und Blutgefäße. Setzen Sie den Embryo in einem kleinen Silikon - beschichtete Petrischale mit PBS. Befestigen Sie den Embryo in die Schale mit Wolfram Pins nach dorsal. Führen Sie einen dorsalen Schlitz in der hindbrain Dach-Platte mit scharfen Glaskapillaren.
3. Mit scharfen Pinzette und Mikro-Schere halten Sie den oberen Teil des Kopfes und ziehen Sie den hindbrain Gewebe sehr sorgfältig von rostral nach kaudal. Nach der Abtrennung der hindbrain entfernen restlichen ventralen Gewebe, um eine saubere Vorbereitung zu erreichen.
4. Inkubieren Sie die hindbrain mit 4% Paraformaldehyd (PFA)-Lösung für 1-2 h bei Raumtemperatur (RT). Waschen Sie die hindbrain mit PBT (PBS/0.1% Triton X-100) zu PFA entfernen.
5. Für Immunfluoreszenz in Flachbild-montiert hindbrains hinzufügen 500 l Blocking-Lösung (5% Ziegenserum in PBT und Inkubation für 2 Stunden bei RT inkubieren mit ^1. Antikörper ON bei 4 ° C. Waschen mit PBT (15 min x 3) inkubieren. mit ^2. Antikörper für 2 Stunden bei RT. mit PBT (15 min x 3) zu waschen.
6. Setzen Sie den Blick auf hindbrain dorsal auf einem Glasträger. In fluoreszierenden Eindeckmitteln auf die hindbrain. Verwenden Glaskapillaren oder Wolfram Nadeln, um die hindbrain auf der Folie zu glätten.
7. In wenig Fett an jeder Ecke zu quetschen des Gewebes durch das Deckglas zu verhindern. Vorsichtig ein Deckglas auf der Oberseite des hindbrain und vermeiden Sie Luftblasen. Zur Einhaltung hinzufügen Nagellack Glaskanten decken.

2.2 Cryo-Abschnitte und Immunfluoreszenz

1. Cryo-Abschnitten des Hirnstamms ca.n in jedem Stadium zu axonalen Bahnen visualisieren durchgeführt werden. Doch nach E6.5 dies das bevorzugte Verfahren, da es schwierig zu Axone in der Wohnung montiert Embryo, der zu dick wird visualisieren. Darüber hinaus erfordert Demonstration von Synapsen Schneiden des Gewebes und hoher Vergrößerung Ansicht unter dem Mikroskop.
2. Präparieren Sie den Embryo und entfernen Sie alle umgebenden Gewebe. Abspülen mit PBS. Schneiden Sie den Embryo im kaudalen Teil der Medulla mit Mikro-Schere und Pinzette scharf. Einen breiten Einschnitt zwischen dem Kleinhirn und dem Mittelhirn und entfernen Sie das gesamte Hirnstamm. Das Gewebe sollte die Medulla, Pons und Kleinhirn.
3. Fix den Hirnstamm in 4% PFA über Nacht (ON) bei 4 ° C, Spülen mit PBS (10 min x 3), und Inkubation mit 30% Saccharose ON bei 4 ° C bis Untergang.
4. Einbetten hindbrain in einer Kryo-Form mit OCT (Optimal Cutting Temperatur)-Verbindung, und legen Sie sie bei -20 ° C bis Einfrieren, wie an anderer Stelle beschrieben ^11.
5. Setzen Sie das Office-Block in den Kryostaten an der gewünschten Schnittachse. Feldbreite ist 12 um.
6. Trocknen Sie die Dias. 100 l Blocking-Lösung auf jeder Folie für 2 h bei RT. 100 ul Antikörper (verdünnt in Blocking-Lösung auf die gewünschte Konzentration). Inkubationszeit für ^1. und ^2. Antikörper ist ON bei 4 ° C oder 2 Stunden bei RT, beziehungsweise. Für jede Inkubationszeit sanft hinzufügen Parafilm Streifen auf der Oberseite der Folie, um Trockenheit zu verhindern. Waschen mit PBS (10 min x 3) zwischen Antikörpern. Falls erforderlich, fügen 1:1.000 Dapi (4'-6-Diamidino-2-phenylindol), in PBS für 20 min bei RT verdünnt. Abspülen mit PBS.
7. Montage des Schlittens mit fluoreszierenden Montage Medien. Lassen Sie für 1 Stunde vor der Analyse trocken.

Ergebnisse

Dieses Protokoll wurde kürzlich verwendet, um die Muster und axonale Projektion Websites von dA1 Untergruppe von Interneuronen im chick hindbrain ¹⁰ aufzudecken. Um spezifisch zu markieren diese Axone, wurde ein Enhancer-Element (ATOH1), die zuvor als spezifisch für spinale Neuronen dI1 ^8,12,13 charakterisiert wurde, bestätigt, dass in hindbrain dA1 Zellen ¹⁰ ausgedrückt werden. Das Element wurde stromaufwärts nach Cre-Rekombinase und E2.75 zusammen mit einem Cre abhängige zytoplas...

Diskussion

In ovo Elektroporation ist eine praktikable, zuverlässige und wirksames Instrument, um Zellspezifikation und axonalen Wegfindung während der Entwicklung des Nervensystems chick ²⁰ zu untersuchen. In diesem Protokoll beschreiben wir einen Modus der Elektroporation in das Küken hindbrain bei E2.75 mit Enhancer-Elemente, die die bedingte Kennzeichnung bestimmter Interneurone aktivieren. Diese Strategie wird mit dem PiggyBac-vermittelte Umsetzung System, um fremde Gene in das Genom Küken, die der axo...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
L-shaped gold Genetrodes 3 mm electrodes	BTX, Harvard Apparatus	45-0162
pulse generator, ECM 830	BTX, Harvard Apparatus	45-0002
OCT (Optimal Cutting Temperature) Compound	Tissue-Tek Sakura	4583 O.C.T. Compound
Nail Polish	From Any Commercial Supplier