Électroporation de la Rhombencéphale tracer des trajectoires axonales et cibles synaptiques dans l'embryon de poulet

Résumé

Comment les réseaux neuronaux sont établis dans le cerveau embryonnaire est une question fondamentale en neurobiologie développementale. Ici, nous avons combiné une technique d'électroporation avec des outils génétiques nouvelles, comme Cre / Lox-plasmides et le système de transposition ADN PiggyBac médiation dans le cerveau postérieur aviaire à étiqueter interneurones dorsale et suivre leurs projections axonales et des cibles synaptiques à différents stades de développement.

Résumé

Électroporation du tube neural embryonnaire poussin présente de nombreux avantages comme étant rapide et efficace pour l'expression de gènes étrangers dans des cellules neuronales. Dans ce manuscrit, nous proposons une méthode qui démontre unique façon d'électroporation d'ADN dans le cerveau postérieur aviaire à E2.75 pour étiqueter spécifiquement un sous-ensemble de progéniteurs neuronaux, et comment suivre leurs projections axonales et des cibles synaptiques à bien des stades avancés de développement, jusqu'à E14.5. Nous avons utilisé des outils génétiques nouveaux, y compris des éléments spécifiques enhancer, la CRE / Lox - Plasmides et que le système de transposition ADN PiggyBac médiation pour conduire l'expression de la GFP dans un sous-type de cellules du cerveau postérieur (la dorsale plus sous-groupe des interneurones, DA1). Trajectoires et les objectifs de dA1 axones axones sont suivis à des stades embryonnaires précoces et tardives à différentes régions du tronc cérébral. Cette stratégie contribue techniques avancées pour cibler des cellules d'intérêt dans le cerveau postérieur embryonnaire et pour tracement formation de circuit à plusieurs stades de développement.

Introduction

Le cerveau postérieur représente une plaque tournante du relais clé du système nerveux par la communication entre les systèmes nerveux central et périphérique via ascendant et descendant des réseaux neuronaux. Il régule les fonctions de base, y compris la respiration, la conscience, l'audition et la coordination motrice ^1-3. Au cours du développement embryonnaire, le cerveau postérieur vertébré est subdivisé de manière transitoire le long de son axe antéro-postérieur (AP) dans rhombomères répétitifs, dans lequel les types de cellules neuronales distinctes sont formées et générer de multiples centres des noyaux du tronc cérébral ^4. Le cerveau postérieur est également divisé le long de son axe dorso-ventral (DV) dans une plaque basale et Alar, au cours de laquelle progéniteurs neuronaux distincts deviennent spécifiés et se différencient dans des endroits distincts DV ^3,5,6. Comment le début AP et spécifiques DV modèles neuronaux sont relatives à la création de circuits de tronc cérébral fonctionnel est largement inconnue.

D'acquérir des connaissances sur ce principe fondamentalquestion, des outils sont nécessaires pour étiqueter sous-ensembles spécifiques de neurones dans le cerveau postérieur au début et à retracer leurs trajectoires axonales et la connectivité à des stades plus avancés. Nous avons déjà utilisé des éléments activateurs spécifiques, et un système d'expression conditionnelle Cre / loxP-base pour le suivi de trajectoire des axones des interneurones spinaux dorsaux au début embryon de poulet ^7-9. Dans le manuscrit actuel, nous avons ciblé le cerveau postérieur et amélioré le paradigme expérimental pour l'étiquetage fin des interneurones du cerveau postérieur embryonnaire, les axones et leurs cibles synaptiques, en utilisant une stratégie d'électroporation modifié et le PiggyBac - transposition de l'ADN induite. Notre nouvelle stratégie permet le marquage des sous-types neuronaux distincts dans un côté du cerveau postérieur et le suivi de leurs projections axonales et les sites synaptiques à différents stades embryonnaires, à partir de 2 jusqu'à 12 jours après l'électroporation. Sur la base de cette méthode, nous avons appelé la dorsale la plus sous-groupe des interneurones du cerveau postérieur (dA1/Atoh1 ⁺ Suivi des cellules) et révélé deux modèles de projections axonales ascendantes controlatéral, chacun vient d'un endroit et s'allonge AP différent dans un funiculus distinct. dA1 axones ont été trouvés à projet et le formulaire synapses dans les noyaux auditifs, le mésencéphale et dans de multiples couches du cervelet ^10.

La combinaison de poussin électroporation, génétique traçage des neurones et analyse des sites de projection à bien des stades avancés de développement fournit une plate-forme unique d'étudier la formation des réseaux neuronaux dans le cerveau et à élucider les mécanismes moléculaires qui régissent la formation des circuits.

Protocole

1. électroporation Rhombencéphale

1.1 manipulation des oeufs

1. Placez les oeufs horizontalement dans un incubateur humidifié (37 à 38,5 ° C). Les embryons sont électroporation après 65-70 heures d'incubation, quand ils atteignent 16-17 (HH) stade (25-30 somites).
2. Retirer les oeufs de l'incubateur, ils restent en position horizontale.

1.2 Préparatifs

1. Tirez capillaires en verre (0,5 mm de diamètre).
2. Connexion pliées en forme de L Genetrodes électrodes d'or (3 mm de diamètre) avec un support d'adaptateur sur le générateur d'impulsions. paramètres d'électroporation comprennent 25 volts, 5 numéros d'impulsions, 45 msec longueur d'impulsion, 300 msec intervalles impulsions.
3. Préparer une pipette de bouche, 10 ml aiguille de la seringue, bandes parafilm, une brosse douce, des ciseaux de dissection tranchants et une solution de PBS stérile 25 ml. Cette quantité est habituellement suffisante pour gérer un plateau d'oeufs (18 oeufs).
4. Préparer un mélange adéquat de plasmides d'ADN (5 ug / ul chacun) etajouter environ 0,025% de colorant de vert rapide de visualiser injection d'ADN. Habituellement, un volume de 4 pi est suffisant pour l'injection d'un plateau.

1.3 fenêtrage, injection et l'électroporation

1. Nettoyer les coquilles d'œufs avec 70% d'éthanol.
2. Manipuler un oeuf à la fois pour réduire le temps d'exposition embryonnaire à l'air.
3. Faire un trou au niveau du pôle d'oeuf avec des ciseaux fins et retirer 3-4 ml d'albumine avec la seringue. Ne pas retirer une plus grande quantité d'albumine, car elle réduit la viabilité.
4. Ouvrir une petite fenêtre ovale (2,5 x 2 cm d'épaisseur) au centre supérieur de la coquille de l'oeuf à l'aide des ciseaux de dissection.
5. Goutte à goutte quelques gouttes de PBS sur le dessus de l'embryon pour prévenir la sécheresse durant tout le processus.
6. Charger une petite quantité du mélange d'ADN dans le capillaire en verre à l'aide d'une pipette de bouche.
7. Placez l'embryon avec son extrémité postérieure vers vous. Pas d'injection d'encre est nécessaire à ce stade que l'embryon est clairement visible. Éviter les augmentations d'injection d'encresurvie embryonnaire. Pénétrer dans le cerveau postérieur caudale en maintenant le capillaire à ~ 45 °. Ne pas enlever la membrane du monde embryon. Injecter la solution d'ADN soigneusement dans la lumière du cerveau postérieur et expirez sans former de bulles d'air. solution d'ADN se propage en avant.
8. Immédiatement après l'injection d'ADN, placer les électrodes parallèles à l'AP précise et DV position hindbrain vous visez à cibler. Poussez les électrodes légèrement ventrale sans toucher le cœur, car il peut réduire la viabilité. Pulser le électroporateur. Les électrodes doivent être couverts avec des bulles pour indiquer une conductivité électrique (figure 1A).
9. Retirez délicatement les électrodes et couler quelques gouttes de PBS pour refroidir l'embryon et pour éliminer les bulles. Sceller l'ouverture correctement avec une bande parafilm pour éviter le dessèchement pendant l'incubation oeuf. Lavez électrodes dans PBS avec la brosse douce.
10. Placer l'œuf dans l'incubateur pendant la durée souhaitée. La survie des embryons est d'environ 90% 2-3 jours aprèsélectroporation, et réduit jusqu'à 50% de 12 jours après l'électroporation.

2. Analyse des embryons

2.1 préparation Flat-mount et immunofluorescence

1. Préparations plat de montage du cerveau postérieur peuvent être effectuées jusqu'à E6.5 de visualiser facilement les axones sous un microscope ou un stéréo-microscope.
2. Disséquer l'embryon soigneusement en le séparant de membranes qui entourent et les vaisseaux sanguins. Placez l'embryon dans une petite silicone - boîte de Pétri contenant recouvert PBS. Fixez l'embryon dans le plat avec des épingles de tungstène face dorsale. Effectuer une fente dorsale dans le cerveau postérieur toit-plaque à l'aide forte capillaires en verre.
3. En utilisant des pinces pointues et des micro-ciseaux tenir la partie supérieure de la tête et tirez le tissu de cerveau postérieur très soigneusement de rostral à caudal. Après la séparation du cerveau postérieur éliminer les derniers tissus ventraux pour atteindre une préparation propre.
4. Incuber le cerveau postérieur avec 4% solution de paraformaldéhyde (PFA) pour 1-2 heures à température ambiante (RT). Laver le cerveau postérieur avec PBT (PBS contenant 0,1% de Triton X-100) pour enlever les PFA.
5. Pour immunofluorescence dans hindbrains plat montés ajouter 500 ul de solution de blocage (5% de sérum de chèvre en PBT et incuber pendant 2 heures à température ambiante incuber avec 1 ^m anticorps ON à 4 ° C. Laver avec de PBT (15 min x 3). Incubate avec 2 ^ème anticorps pendant 2 heures à température ambiante. Laver avec PBT (15 min x 3).
6. Placez le cerveau postérieur face dorsale sur une lame de verre. Ajouter milieux de montage fluorescentes sur le cerveau postérieur. Utilisez capillaires en verre ou des aiguilles de tungstène pour aplatir le cerveau postérieur sur la diapositive.
7. Ajoutez petite quantité de graisse à chaque coin pour éviter la compression des tissus par la lamelle. Placez délicatement une lamelle sur le dessus du cerveau postérieur et d'éviter les bulles d'air. Pour ajouter adhésion de vernis à ongles pour couvrir les bords du verre.

2.2 Cryo-sections et immunofluorescence

1. Cryo-sections du tronc cérébral can être effectuée à n'importe quel stade de visualiser les trajectoires axonales. Pourtant, après E6.5 ce devrait être la méthode privilégiée en raison de la difficulté à visualiser axones dans l'embryon plate-monté, qui devient trop épaisse. De plus, la démonstration de synapses nécessite la coupe du tissu et une vue à fort grossissement au microscope.
2. Disséquer l'embryon et enlever tous les tissus environnants. Rincer avec du PBS. Couper l'embryon à la partie caudale de la moelle aide de micro-ciseaux et des pinces acérées. Faire une large incision entre le cervelet et le mésencéphale et retirer l'ensemble du tronc cérébral. Le tissu doit contenir la moelle, la protubérance et le cervelet.
3. Fixer le tronc cérébral dans 4% PFA pour la nuit (ON) à 4 ° C, rincer avec du PBS (10 min x 3), et incuber à 30% de saccharose de ON à 4 ° C jusqu'à son naufrage.
4. Intégrer le cerveau postérieur dans un cryo-moule avec du composé OCT (Optimal Cutting Temperature), et placez-le à -20 ° C jusqu'à ce que le gel, comme décrit par ailleurs ^11.
5. Placez le bloc octobre dans le cryostat à l'axe section souhaitée. largeur de la section est de 12 um.
6. Sécher les diapositives. Ajouter 100 ul de solution de blocage sur chaque diapositive pendant 2 heures à température ambiante. Ajouter 100 ul d'anticorps (dilué dans la solution de blocage à la concentration souhaitée). La période d'incubation de 1 ^ère et 2 ^ème anticorps est ON à 4 ° C ou 2 heures à température ambiante, respectivement. Pour chaque temps d'incubation, ajouter doucement la bande parafilm sur le dessus de la lame pour prévenir la sécheresse. Laver avec du PBS (10 min x 3) entre les anticorps. Si nécessaire, ajoutez 1:1000 Dapi (4'-6-Diamidino-2-phenylindole), dilué dans du PBS pendant 20 min à température ambiante. Rincer avec du PBS.
7. Monter la lame avec un milieu de montage fluorescentes. Laisser sécher pendant 1 heure avant l'analyse.

Résultats

Ce protocole a été récemment utilisée pour découvrir les modèles axonales et les sites de projection de dA1 sous-groupe des interneurones dans le cerveau postérieur poussin ^10. Pour étiqueter spécifiquement ces axones, un élément activateur (Atoh1), qui a déjà été qualifiée de spécifique pour la colonne vertébrale EL1 neurones ^8,12,13, a été confirmée à exprimer en dA1 cellules cerveau postérieur ^10. L'élément a été cloné en amont de la recombinase Cre et ...

Discussion

En électroporation in ovo est un outil réalisable, fiable et efficace pour examiner la spécification des cellules et le guidage axonal au cours de poussin développement du système nerveux ^20. Dans ce protocole, nous décrivons un mode d'électroporation dans le cerveau postérieur de poulet à E2.75 utilisant des éléments amplificateurs qui permettent l'étiquetage conditionnelle des interneurones spécifiques. Cette stratégie est combiné avec le système de transposition Pi...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
L-shaped gold Genetrodes 3 mm electrodes	BTX, Harvard Apparatus	45-0162
pulse generator, ECM 830	BTX, Harvard Apparatus	45-0002
OCT (Optimal Cutting Temperature) Compound	Tissue-Tek Sakura	4583 O.C.T. Compound
Nail Polish	From Any Commercial Supplier