Method Article
النتائج والاستنتاجات الواردة في هذا التقرير هي آراء أصحابها ولا تمثل بالضرورة وجهة نظر مراكز السيطرة على الأمراض والوقاية منها.
السطوح قمية وbasolateral من الخلايا الظهارية الهوائية تظهر الاستجابات الاتجاه إلى التعرض الممرض في الجسم الحي. وهكذا، مثالية نماذج في المختبر لدراسة الاستجابات الخلوية لمسببات الأمراض التنفسية استقطاب، وتشكيل السطوح قمية وbasolateral. ويتمايز نموذج واحد مثل الإنسان الطبيعي الخلايا الظهارية القصبية (NHBE). ومع ذلك، فإن هذا النظام يتطلب عينات أنسجة الرئة والخبرات وعزل الخلايا الظهارية زراعة الأنسجة من، والوقت لإنشاء واجهة الثقافة الهواء السائل.
Calu-3 خلايا، والمستمدة من الشعب الهوائية والسرطان الغدي الإنسان، هي النموذج البديل للنظر في استجابة الخلايا الظهارية الهوائية القريبة لإهانة الجهاز التنفسي 1، مركبات الدوائية 2-6 و 7-9 والبكتيرية والفيروسية مسببات الأمراض، بما في ذلك فيروس الأنفلونزا، فيروسات الانف والمتلازمة التنفسية الحادة - المرتبطة التاجى 10-14. مؤخرا، ثأظهرت الإلكتروني التي Calu-3 خلايا عرضة لفيروس الجهاز التنفسي المخلوي (RSV) في العدوى على نحو يتفق مع NHBE 15،16. هنا، ونحن من التفصيل إرساء ثقافة الاستقطاب السائل المغطاة، (LCC) من الخلايا-3 Calu، مع التركيز على التفاصيل التقنية لزراعة الخلايا والنمو Calu-3، والحفاظ على الخلايا التي تم زرعها في LCC، ونقدم الأسلوب لتنفيذ عدوى فيروس الجهاز التنفسي من الاستقطاب خلايا-3 Calu.
للحصول على الاستقطاب باستمرار Calu LCC-3، Calu-3 يجب خلايا subcultured بعناية قبل زراعة في إدراج Transwell. يجب Calu-3 الثقافات أحادي الطبقة تظل دون التقاء 90٪، وينبغي subcultured أقل من 10 مرات من المخزون المجمدة، ويجب أن يتم توفير بانتظام مع المتوسط الطازجة. مثقف مرة واحدة في Transwells، لا بد من التعامل معها Calu-3 LCC بعناية. عدم انتظام وسائل الإعلام وتعطيل التغييرات الميكانيكية أو المادية للطبقات الخلية أو لوحات تؤثر سلبا الاستقطاب للعدة ساعات أو أيام. ويتم رصد الاستقطاب من خلال تقييم عبر الظهارية المقاومة الكهربائية (طير) ويتم التحقق من خلال تقييم السلبي للموازنة الصوديوم فلوريسئين بين حجرات قمية وbasolateral 17،18. الهضاب طير مرة واحدة عند أو فوق 1000 سم 2 × Ω، Calu-3 LCC على استعداد لاستخدامها لدراسة الاستجابات الخلوية لمسببات الأمراض في الجهاز التنفسي.
1. زراعة خلايا Calu-3 للاستخدام في الثقافات Transwell
تدابير السلامة: تنفيذ جميع الإجراءات في مجلس الوزراء للسلامة الأحيائية باستخدام تقنية معقمة الثقافة.
2. تزايد الاستقطاب Calu-3 السائل المغطاة الثقافات (LCC)
تدابير السلامة: تنفيذ جميع الإجراءات في مجلس الوزراء للسلامة الأحيائية باستخدام تقنية معقمة الثقافة.
3. تقييم التنمية مقاومة Calu-3 LCC
تدابير السلامة: تنفيذ جميع الإجراءات في مجلس الوزراء للسلامة الأحيائية باستخدام تقنية معقمة الثقافة.
4. اصابة المستقطب Calu-3 LCC مع فيروس الجهاز التنفسي
تدابير السلامة: تنفيذ جميع الإجراءات في مجلس الوزراء للسلامة الأحيائية باستخدام تقنية معقمة والثقافة، وعلى مستوى السلامة الحيوية المناسبة لتستخدم الفيروس.
عندما نمت وسائل المغطاة الثقافات (LCC) في نظم الثقافة Transwell، كما هو موضح في الشكل 1، Calu-3 خلايا استقطاب وتطوير متميزة السطوح قمية وbasolateral. وفقا للطريقة الموصوفة هنا، المقاومة الكهربائية عبر الظهارية (طير) من Calu LCC-3 تصل إلى الهضبة عند أو فوق 1000 سم 2 × Ω في غضون 3 أسابيع بعد الغرس ومثال الذي يظهر في الشكل 2. وشكلت منعطفات ضيقة بين الخلايا الاستقطاب السلبي موازنة منع من جزيئات صغيرة بين حجرات قمية وbasolateral. وبالتالي، يتم استخدام فلوريسئين الصوديوم تعديل موازنة فحص للتأكد من الاستقطاب Calu-3 LCC 15،17،18. كما طير من monolayers الخلية Calu-3 في زيادات LCC، ومقدار فلوريسئين أن equilibrates بشكل سلبي في مقصورة basolateral النقصان. مرة واحدة في طير هو 1،000 × Ω سم 2، ومقدار فلوريسئين أن equilibrates في إلى المقصورة basolateral و≤ 1٪، كما هو موضح في الشكل 3، وبالتالي، تعتبر Calu-3 LCC أن تكون مستقطبة بشكل كامل عندما هو طير ≥ Ω × 1000 سم 2. قد طير قياس ذروة Calu-3 LCC تختلف من تجربة إلى تجربة. ومع ذلك، مرة واحدة هضبة القيم طير لأي تجربة معينة، قد، غير مصاب تماما الاستقطاب Calu-3 LCC تكون مستقرة لمدة 5 إلى 12 أسابيع بعد البذر. قد يكون سبب غياب التنمية المقاومة في Transwell-مثقف Calu-3 من قبل عدة عوامل على النحو المبين في الجدول 1. مرة واحدة في طير من Calu-3 الهضاب LCC عند أو فوق 1000 سم 2 × Ω، هذا النموذج هو على استعداد لاستخدامها لفحص ردود الخلايا الظهارية الهوائية لمسببات الأمراض التنفسية، بما في ذلك فيروس الجهاز التنفسي المخلوي (RSV). التعرض لنتائج RSV في انخفاض أسرع في نزاهة ثقافة الاستقطاب مقارنة العدوى وهمية من الخلايا (الشكل 4).
= "دائما">
الشكل 1. تزرع الخلايا المقطع العرضي تمثيل Transwell-مثقف الخلايا. على سطح الغشاء القمي إدراج.
الشكل 2. التنمية العابرة للالظهارية المقاومة الكهربائية (طير) واستقطاب Calu-3 الخلايا بعد البذر في إدراج Transwell. وفي كل نقطة الوقت، كما يتم تقديم طير متوسط سم × Ω ± 2 SEM من 32 بئرا مستقلة عن التجربة ممثل واحد.
الشكل 3. السلبي equili هو تحول دون bration من فلوريسئين الصوديوم في مقصورة basolateral من monolayers الخلية Calu-3 كما تصبح الخلايا الاستقطاب. يتم تقديم البيانات التراكمية من أربع تجارب مستقلة. كل نقطة بيانات يمثل القياس الفردية.
الشكل 4. RSV إصابة LCC Calu-3 الاستقطاب تسارع انخفاض في سلامة أحادي الطبقة. المستقطب Calu-3 خلايا والمصابين RSV-A2 في وزارة الداخلية 1 = في يوم 0، وتمت مراقبة القطبية لمدة 8 أسابيع بعد العدوى. ويرد ممثل تجربة واحدة. يتم عرض البيانات في مقاومة متوسط من 8 آبار مستقلة في الإصابة ± SEM في نقطة زمنية. * P <0.05 بين الثقافات وهمية وRSV-A2 المصابين، على النحو الذي يحدده للطالب اختبار t.
الجدول 1. حل المشاكل التي قد تنشأ المشاكل عندما زراعة الخلايا Calu-3 في Transwells. عوامل متعددة تسهم في استقطاب كاملة من خلايا-3 Calu في السائل المغطاة الثقافات، وعلى الأرجح من التي أبرزت في هذا الجدول.
عند إنشاء Calu-3 LCC في إدراج Transwell، قد لا خلايا استقطاب في كل شيء، أو لا استقطاب بالكامل، كما تم تعريفها من قبل طير ≥ Ω × 1000 سم 2 و≤ 1٪ موازنة الصوديوم فلوريسئين صبغ بين حجرات قمية وbasolateral. وبالإضافة إلى ذلك، قد Calu-3 خلايا في استقطاب LCC تماما، ولكن قد تكون غير متناسقة طير بين القياسات. على الرغم من التقلبات في القياسات طير من Calu-3 LCC طبيعية من يوم لآخر، ومن غير المتوقع تماما مرة واحدة الاستقطاب، وتقلب كبير في طير حتى ينخفض بشكل طبيعي ثقافة مع التقدم في السن، والتي قد تكون اقل من 5 أسابيع أو ما دامت 12 أسبوعا بعد البذر.
قدرة Calu-3 LCC لاستقطاب يعتمد في جزء منه على كيفية الحفاظ على الخلايا وsubcultured قبل الاستخدام في نظام Transwell. الخلايا التي نمت خارج التقاء 90٪ وأحادي الطبقة خلال subculturing، التي تم subcultured أكثر من 10 مرات من المخزون المجمدة، أو التي لا تكونEN المتوفرة مع الطازجة المتوسطة على جدول منتظم هم أقل عرضة للاستقطاب بالكامل، والاستقطاب أي من المرجح أن ينخفض بسرعة. ويمكن أيضا عدم ناقصة أو الكلي من الاستقطاب يمكن أن يعزى إلى اختلاف في حجم المسام والمواد من Transwells تستخدم لCalu LCC-3، وإلى الكثير الكثير من التباين في تركيبة مماثلة Transwells وحجم المسام قد تؤثر أيضا الاستقطاب. يمكن أحجام أكبر المسام تسمح Calu-3 في النمو من خلال الغشاء Transwell في مقصورة basolateral، ومنع الثقافة من الاستقطاب. وأشار إلى عدم وجود الاستقطاب قد يكون أيضا بسبب نمو البكتيريا، من خلال ثقافة المتوسط بظلالها، مما يؤدي إلى انهيار اللاحقة للمنعطفات ضيقة بين الخلايا Calu-3.
قد يكون سبب القياسات طير متغير من Calu-3 LCC عن اضطرابات الميكانيكية للmonolayers Calu-3 خلية LCC، إدراج، أو لوحات أنفسهم. يجب أن يتم تنفيذ التغييرات والقياسات المتوسطة طير بدون نصائح أو ماصة الكهربائيةدي يؤدي لمس الخلايا. أثناء تنفيذ هذه العمليات، ينبغي الحرص على تجنب إدخال فقاعات الهواء إلى حجرات قمية وbasolateral، والتي سوف تعطيل قدرة voltohmmeter للكشف عن المقاومة. قد يقتصر أيضا على قدرة voltohmmeter للكشف عن المقاومة في ثقافة الاستقطاب التي هي في الواقع من تراكم البروتين يؤدي على القطب. قد تتم إزالة هذا تراكم مع طيف الرملي، أو قد يتم تصحيحها عن طريق الاستعاضة عن القطب.
مرة واحدة Calu-3 LCC استقطاب تماما وطير في تزايد لم يعد، Calu-3 LCC على استعداد لاستخدامها كعامل في المختبر نموذج لوصف ردود المضيف الرئة الخلايا الظهارية لعدوى الجهاز التنفسي. هذا النظام يسمح أفضل توصيف الردود الاتجاه لمسببات الأمراض مقارنة أحادي الطبقة، خطوط الخلايا المستزرعة الرئة تستخدم عادة لدراسة مسببات الأمراض التنفسية، مثل التهاب الكبد وخلايا A549-2، مع مزايا إضافية من Calu-3 باي LCCنانوغرام أسرع لتطوير وبسهولة أكبر الحصول عليها، وأقل تكلفة لتوليد من الابتدائي، NHBE، الاستقطاب متباينة. مماثلة لNHBE، الاستقطاب Calu-3 إثبات مشددة تشكيل تقاطع، وإنتاج mucins. ولكن، خلافا NHBE، الاستقطاب Calu-3 خلايا لا تفرق في طبقات من الخلايا القاعدية والخلايا المهدبة العمودية الطلائية، وعدد قليل الاستقطاب Calu-3-أهداب الخلايا تطوير مثل التوقعات 19. وهكذا، على الرغم من المفيد لدراسة الردود الاستقطاب من الخلايا الظهارية الهوائية لإهانة الجهاز التنفسي، والاستقطاب Calu-3 LCC ليست نموذجا مثاليا لدراسة التنمية مجرى الهواء أو إعادة عرض ردا على إهانة أو إصابة الجهاز التنفسي. قد إنتاج المخاط من قبل الخلايا المستزرعة في المختبر تؤثر العدوى الخلوية، وكذلك الإفراج عن فيروس المعدية وانتشار الفيروس في نموذج الاستقطاب، وإجراء مقارنة مباشرة للإنتاج المخاط بين الاستقطاب LCC-3 Calu ولم تبلغ الاستقطاب، NHBE متباينة تم . A549 والخلايا التهاب الكبد A-2إعادة أسهل للثقافة من الخلايا-3 Calu، ولكن، خلافا Calu-3 LCC، فإنها لا تشكل الثقافات الاستقطاب عندما نمت على إدراج Transwell، وبالتالي هي نماذج مثالية لا لفحص في المختبر ردود الخلايا الظهارية المستقطبة لعدوى فيروس الجهاز التنفسي .
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
الكتاب أود أن أشكر اليزابيث بلانشارد للحصول على المساعدة الفنية لها. النتائج والاستنتاجات الواردة في هذا التقرير هي آراء أصحابها ولا تمثل بالضرورة وجهة نظر مراكز السيطرة على الأمراض والوقاية منها.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
الكواشف | |||
Calu-3 | ATCC | HTB-55 | |
0،05٪ التربسين - EDTA 0.02٪ | Gibco / إينفيتروجن | 25300 | |
النسر متوسطة الأساسية الدنيا (EMEM) | Gibco / إينفيتروجن | 07-00100DK | |
الجنين المصل البقري (FBS) | HyClone | SH30070.03 | حرارة تعطيل، 56 ° C، 30 دقيقة |
غير الضرورية الأحماض الأمينية 100X (10 ملم) | Gibco / إينفيتروجن | 11140 | متجر في C ° 4 في الظلام |
الجلوتامين L- | Gibco / إينفيتروجن | 25030 | |
HEPES | Gibco / إينفيتروجن | 15630 | |
EMEM-10٪ FBS (EMEM-10٪) | تكملة EMEM مع FBS المعطل للحرارة إلى 10٪ مصل، مرشح العقيمة | ||
EMEM-20٪ FBS + ملاحق (EMEM-20٪ + S) | تكملة EMEM لتركيزات النهائي: FBS المعطل للحرارة بنسبة 20٪ 1X الأحماض الأمينية؛ 2 مم L-الجلوتامين؛ HEPES ملي 10؛ العقيمة مرشح | ||
24-وحات جيدة Transwell | كورنينج COSTAR | 3472 | 3 المساحة المسام ميكرومتر، والبوليستر |
التريبان الأزرق | Gibco / إينفيتروجن | 15250 | |
الإيثانول | سيجما | E7023 | إعداد إلى 70٪ باستخدام معقم DH 2 O |
Dulbecco في PBS (D-PBS) | إينفيتروجن | 14040 | |
غير الفلورسنت العازلة | 118 مم كلوريد الصوديوم؛4،75 بوكل مم؛ 2.53 ملي CaCl 2 × H 2 O؛ 2،44 ملم MgSO 4؛ 1،19 ملم KH 2 PO 4؛ 25 مم NaHCO 3 في الماء المعقم؛ العقيمة مرشح | ||
الصوديوم فلوريسئين | سيجما | 6377 | 1 ملغ / مل في المخزن المؤقت غير معقمة الفلورية؛ العقيمة مرشح، بعيدا عن الضوء؛ المحل في 4 درجات مئوية تصل إلى 6 أشهر |
EQUIPMENT | |||
Voltohmmeter | أدوات الدقة العالم | ||
STX2 الكهربائي | أدوات الدقة العالم | ||
ELISA لوحة قارئ | قادرة على قياس 486 أو 490 A A |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved