Creazione di un liquido coperto Cultura polarizzata Airway epiteliali umane Calu-3 celle per studio cellulare risposta dell&#39;ospite agli agenti patogeni delle vie respiratorie<em&gt; In vitro</em

Riepilogo

I risultati e le conclusioni di questo rapporto sono quelle degli autori e non rappresentano necessariamente il punto di vista dei Centri per il Controllo delle Malattie e la Prevenzione.

Abstract

Le superfici apicale e basolaterale delle cellule epiteliali delle vie aeree dimostrare risposte direzionali all'esposizione patogeno in vivo. Così, ideale modelli in vitro per l'esame di risposte cellulari patogeni respiratori polarizzare, formando superfici apicale e basolaterale. Uno di questi modelli è differenziato normali cellule epiteliali bronchiali umane (NHBE). Tuttavia, questo sistema richiede campioni di tessuto polmonare, competenze isolare e coltivazione di cellule epiteliali di tessuto, e il tempo per generare un aria-liquido cultura dell'interfaccia.

Calu-3, le cellule derivate da un adenocarcinoma umano bronchiale, sono un modello alternativo per esaminare la risposta delle cellule epiteliali delle vie aeree prossimali ad insulto respiratoria ^1, composti farmacologici ^2-6, e ^7-9 batteriche e virali patogeni, inclusi virus dell'influenza, rhinovirus e grave sindrome respiratoria acuta - coronavirus associato ^10-14. Recentemente, we ha dimostrato che le cellule Calu-3 sono soggetti a virus respiratorio sinciziale (RSV) infezione in un modo coerente con NHBE ^15,16. Qui, abbiamo dettaglio la creazione di un polarizzato, liquido coperto di cultura (LCC) di Calu-3 celle, concentrandosi sui dettagli tecnici di crescita e coltura Calu-3 celle, il mantenimento di cellule che sono state coltivate in LCC, e vi presentiamo la metodo per l'esecuzione di infezione da virus respiratorio polarizzati Calu-3 celle.

Per ottenere sempre polarizzato Calu-3 LCC, Calu-3 celle devono essere attentamente sottocoltura prima coltura in inserti Transwell. Calu-3 colture monostrato dovrebbe rimanere inferiore al 90% di confluenza, dovrebbe essere subcoltura meno di 10 volte da stock congelati, e dovrebbe essere regolarmente fornito con terreno fresco. Una volta coltivate in Transwells, Calu-3 LCC deve essere maneggiato con cura. Irregolari cambiamenti dei media e di una perturbazione meccanica o fisica degli strati di cellule o piastre di avere un impatto negativo per la polarizzazionediverse ore o giorni. Polarizzazione viene monitorata valutando trans-epiteliale resistenza elettrica (TEER) e viene verificato valutando l'equilibrazione passiva di fluoresceina di sodio tra i compartimenti apicale e basolaterale ^17,18. Altipiani volta TEER pari o superiore a 1000 Ω × ² cm, Calu-3 LCC sono pronti per l'uso per esaminare le risposte cellulari ai patogeni respiratori.

Protocollo

1. Colture Calu-3 celle per l'uso in Culture Transwell

Misure di sicurezza: Eseguire tutte le procedure in un armadio biosicurezza con tecnica sterile cultura.

1. Per scongelare le cellule di congelazione:
   1. Preparare terreno minimo essenziale di Eagle contenente 20% di siero di siero bovino fetale (FBS), 0,1 mM aminoacidi non essenziali, 2 mM L-glutammina, e 10 mM HEPES pH 7,4 (EMEM-20% + S). Sterile-filtro il terreno preparato con un 0,2 micron pori grandezza del filtro, e caldo in un bagno d'acqua a 37 ° C. Per essere più riflettente del contesto in situ epitelio delle vie aeree, mezzo non è integrato con antibiotici o antimicotici.
   2. Scongelare una provetta Microbank ™ congelata di Calu-3 celle rapidamente (<1 min) a 37 ° C bagnomaria.
   3. Trasferire le cellule scongelate in una provetta da 50 ml conica sterile ed aggiungere 30 ml di caldo EMEM-20% + S.
   4. Pellet le cellule mediante centrifugazione per 5 minuti a 1000-1200 × g,senza refrigerazione, con velocità e freni.
   5. Decantare il surnatante delicatamente e risospendere le cellule in 5 ml di caldo EMEM-20% + S delicatamente pipettando su e giù. Seed 2 a 5 x 10 ⁶ cellule per pozzetto in una piastra da 6 pozzetti di coltura e incubare a 37 ° C, 7% CO ₂ in atmosfera di aria fino a quando le cellule sono del 75% - 80% confluenti. Controllare tutti i giorni, fino a 7 giorni può essere richiesto. Ogni 3-4 giorni aspirare il terreno dalle cellule e sostituirlo con fresco EMEM-20% + S.
2. Per celle sottocultura:
   1. Caldo tripsina 0,05% - 0,02% EDTA in un bagno d'acqua a 37 ° C. Aspirare il terreno dalle cellule, cellule e lavare una volta con riscaldata tripsina 0,05% - 0,02% EDTA per rimuovere eccesso di terreno e siero. Rimuovere il lavaggio e aggiungere 1 ml di tripsina riscaldato per pozzetto alle cellule.
   2. Incubare a 37 ° C e il 7% di CO ₂ e monitor al microscopio ogni 5 min fino ad almeno il 75% delle cellule staccare dal pozzo (s) della piastra di coltura tissutale. Questo puòprendere tra 5 e 30 minuti.
   3. Lavare le cellule in EMEM-20% + S per rimuovere l'eccesso tripsina. Trasferire le cellule tripsinizzate in una provetta conica da 50 ml sterile. Più pozzetti di cellule da una piastra da 6 pozzetti coltura possono essere raggruppati in un unico tubo da 50 ml conica sterile. Aggiungere 30 ml di EMEM-20% + S e agglomerare le cellule per centrifugazione a 1000-1200 × g, senza refrigerazione, con velocità e freni.
   4. Decantare il surnatante delicatamente e risospendere le cellule in fresco EMEM-20% + S pipettando gentilmente su e giù. Utilizzando i passaggi attraverso 1.2.1 1.2.3 qui sopra per Tripsinizzare cellule, le cellule continuano a sottocultura in piatti di coltura di tessuti come descritto nei punti 1.2.5 tramite 1.2.7 quando sono tra il 75 - 80% confluenti.
   5. Subcoltura da un pozzetto di una piastra da 6 pozzetti fino ad un T-25 cm ² beuta in un volume finale di 5 ml di EMEM-20% + S, semina tra 0,5 a 1 x 10 ⁶ cellule / fiasco.
   6. Con 5 ml di tripsina riscaldato per T-25 cm ² pallone per staccare le cellule, subculturada un T-25 cm ² pallone a uno T-75 cm ² pallone in un volume finale di 10 ml di EMEM-20% + S, semina da 1 a 5 x 10 ⁶ cellule / fiasco.
   7. Utilizzo di 8 ml riscaldato tripsina per T-75 cm ² pallone per staccare le cellule, sottocultura da un T-75 ² cm pallone in 2 T-75 cm ² palloni. Per la crescita cellulare ottimale, non subcoltura cellule in fiasche grandi di T-75 cm ² o subcultura ad un rapporto maggiore di 1 pallone genitore: 3 flaconi nuovi.
3. Una volta che le cellule sono state subcolturate completamente rimuovere e sostituire medio ogni 2 o 3 giorni fino a raggiungere 75-90% di confluenza. Le cellule possono richiedere fino a 3 settimane per raggiungere il 75-90% confluenza. Per la generazione ottimale di culture polarizzati, cellule sottocultura prima di crescere oltre il 90% di confluenza in un monostrato.
4. Continuare a cellule sottocultura finché le cellule sono cresciute abbastanza per inizializzare il numero desiderato di inserti Transwell. Ogni inserto Transwell richiede 2 × 10 ⁵ cellule. Per prestazioni ottimali generando culture polarizzate, utilizzare cellule che hanno subito non più di 10 sottoculture.

2. Growing polarizzati Calu-3 Liquido coperte di Culture (LCC)

Misure di sicurezza: Eseguire tutte le procedure in un armadio biosicurezza con tecnica sterile cultura.

1. Preparare EMEM contenente 10% FBS (EMEM-10%) e caldo in un bagno d'acqua a 37 ° C.
2. Preparare un 24-pozzetti Transwell per la semina. Utilizzando pinze sterili, spostare inserisce Transwell dall'interno alle righe esterne della piastra senza toccare la membrana di inserimento. Cellule devono essere subcoltivate in pozzetti sulle righe esterne della piastra. Per evitare la formazione di bolle d'aria all'interno del vano basolaterali, aggiungere 600 microlitri di EMEM-10% a ciascuno inclinando la pipetta contro la parete di ciascun vano e rilasciando lentamente il mezzo nel pozzo.
3. Staccare le cellule di T-75 cm ² tessuti. Subcufiaschi lture utilizzando tripsina riscaldato, e lavare in 30 ml di EMEM-20% + S per ogni 2 fiaschi di cellule tripsinizzate, come descritto al punto 1.2.
4. Accuratamente risospendere le cellule lavate in 5 ml di EMEM-10% delicatamente pipettando su e giù.
5. Determinare conteggio delle cellule vitali e totale con il metodo di esclusione trypan blu. Procedere solo se l'80% - 90% sono vitali.
6. In una provetta conica da 50 ml sterile, diluire cellule ad una concentrazione di 2 x 10 ⁶ cellule vitali / ml con EMEM-10%.
7. Aggiungere celle al compartimento apicale di ogni Transwell. Per pozzetti A1 e D1, che saranno privi di cellule pozzetti di controllo, che è, spazi, aggiungere 100 microlitri di EMEM-10% senza cellule. A ciascuno dei rimanenti pozzetti, aggiungere 100 microlitri di sedimento Calu-3 celle, delicatamente inclinando la pipetta contro il canale di guida interno della parete dell'inserto e rilasciando lentamente le cellule. Non toccare la pipetta alla membrana inserto. Per mantenere una sospensione omogenea di cellule Calu-3, agitare delicatamente la sospensione cellularedurante questa fase semina.
8. Transwell incubare a 37 ° C e il 7% di CO ₂ in atmosfera di aria. Collocare la piastra in un incubatore dove disturbo fisico sarà minimo. Per migliorare l'efficienza di polarizzazione, non impilare piatti uno sopra l'altro.
9. Per mantenere culture fino polarizzata e pronto per l'uso in esperimenti, sostituire completamente medie Transwells, come descritto nei passaggi 2,10 a 2.13 di seguito. Terreno deve essere completamente sostituita tre giorni dopo essere subcoltura in Transwells, e quindi su un ciclo alternato tra il quarto giorno e poi terzo dopo la somministrazione precedente, finché le cellule sono completamente polarizzati.
10. Caldo EMEM-10% in un bagno d'acqua a 37 ° C.
11. Aspirare delicatamente media da inserti Transwell. Con una pipetta capillare collegato ad una trappola vuoto con un vuoto dolce, o con una pipetta da 1 ml, medie aspirato da cell-free pozzetti A1 e D1, poi da seeded pozzi, prima di rimuovere medio apicale da tutti i pozzetti, e tgallina rimozione media basolaterale da tutti i pozzetti. Non toccare le membrane inserti mentre aspirazione media.
12. Aggiungere 200 pl di EMEM-10% al compartimento apicale del cell-free pozzetti A1 e D1, quindi ai pozzetti seminato, dirigendo il mezzo nel vano apicale usando il lato dell'inserto per guidare la punta della pipetta. Non aggiungere mezzo direttamente su cellule, e non toccare la membrana di inserimento.
13. Aggiungere 600 pl di EMEM-10% ai compartimenti basolaterali. Per evitare la formazione di bolle d'aria all'interno del vano basolaterali, aggiungere mezzo a ciascuno inclinando la pipetta contro la parete di ciascun vano e rilasciando lentamente il mezzo nel pozzo.

3. Valutare lo sviluppo di resistenza di Calu-3 LCC

Misure di sicurezza: Eseguire tutte le procedure in un armadio biosicurezza con tecnica sterile cultura.

1. Valutare trans-epiteliale resistenza elettrica (TEER) di Calu-3 LCC 30 minuti dopocambia il supporto, la valutazione può essere eseguita dopo ogni cambio di mezzo se lo si desidera. Eseguire misure in condizioni sterili. Inizia misure con il cell-free dei pozzetti di controllo A1 e D1 (le frasi) per ottenere misurazioni di base, e proseguire con le misurazioni per ciascun pozzetto.
   1. In condizioni di sterilità, trasferire l'elettrodo Stx2 un tubo da centrifuga da 50 ml contenente 70% di etanolo in acqua sterile, e sterilizzare 15 min.
   2. Calibrare e provare il voltohmmeter per l'uso secondo le istruzioni del produttore.
   3. Rimuovere l'elettrodo dal etanolo, aria secca sec 5-10, e sciacquare l'elettrodo con sterile EMEM-10%.
   4. Impostare il selettore di modalità del voltohmmeter per l'impostazione della resistenza, e accendere l'unità.
   5. Posizionare delicatamente l'elettrodo in una delle tre porte che permettono l'accesso al vano basolaterale di una cultura Transwell. Elettrodo posto in modo che la portano più solo leggermente tocca il fondo del pozzo esterno e rimane verticale,e il terminale corto è nel mezzo di coltura tissutale del compartimento apicale, senza toccare la membrana inserto.
   6. Premere "Misura R" pulsante e attendere che la lettura si stabilizzi. Ripetere per le altre due porte per ciascun pozzetto e registrare le misure da tutte e tre porte, per un totale di tre misurazioni per pozzetto. Continuare a misurare la resistenza per tutti i pozzetti di cellule.
   7. Pulire l'elettrodo immergendolo 5-10 minuti in etanolo al 70%, risciacquo in sterile dH ₂ O, e asciugatura accuratamente. Conservare nel contenitore originale.
   8. Calcolare la resistenza di ogni pozzetto, con l'equazione 1.
      Ω = Ω _{attuale campione} - Ω _bianco, l'equazione 1
      cui il _campione Ω è la misura media da un pozzo privato dei semi e Ω _bianco è la misura media dei pozzi 2, A1 e D1, contenenti inserti e medie, ma non le cellule.
   9. Calcolare la resistenza unità di superficie, usando Equazione 2.
      Ω × area _effettiva della membrana effettiva = Ω × cm ^2, l'equazione 2
      in cui l'area effettiva della membrana è 0,33 cm ² per 24 pozzetti inserti Transwell.
2. Verificare che la polarizzazione è completa eseguendo un test secondario, che misura la diffusione passiva fluoresceina di sodio tra i compartimenti apicale e basolaterale, sul 1-3 culture Transwell. I pozzetti di siero umano fluoresceina di sodio deve essere eliminata immediatamente dopo il completamento del test.
   1. Preparare non fluorescente tampone (118 mM NaCl, 4,75 mM KCl, 2,53 mM CaCl ₂ .2 H ₂ O, 2,44 mM MgSO _4, 1,19 mM KH ₂ PO _4, 25 mM NaHCO ₃ in acqua sterile; filtro sterile con 0,45 micron dispositivo di filtrazione ). Preparare fluoresceina di sodio a 1 mg / ml in tampone non fluorescente, filtro sterile, avvolgerlo in un foglio di alluminio, e conservare a 4 ° C, al riparo dalla luce. Riscaldare a temperature ambientenuovamente prima dell'uso.
   2. Dopo aver completato misure di resistenza, rimuovere accuratamente medio da entrambi i compartimenti basolaterali e apicale di 1-3 singole culture Transwell.
   3. Sciacquare culture Transwell. Delicatamente aggiungere 600 microlitri temperatura ambiente sterile PBS di Dulbecco (D-PBS) ai compartimenti basolaterali e 100 pl temperatura ambiente sterile D-PBS ai compartimenti apicali.
   4. Rimuovere delicatamente D-PBS dai pozzi. Aggiungere 600 microlitri sterile non fluorescente tampone ai vani basolaterali. Aggiungere 100 pl sterile 1 mg / ml di sodio fluoresceina ai compartimenti apicali.
   5. Incubare la piastra a 37 ° C per 1 ora. CO ₂ non è richiesto durante l'incubazione.
   6. Durante l'incubazione, preparare una curva standard di sodio fluoresceina compresa tra 20 mg / ml e 0 microgrammi / ml, utilizzando non fluorescente tampone per diluire fluoresceina di sodio. Preparare almeno 8 diverse concentrazioni di sodio fluoresceina, ciascuna in un volume finale di almeno 600 microlitri. Mantenerediluizioni della curva standard al riparo dalla luce fino al momento di misurare l'assorbanza.
   7. Trasferire il campione non fluorescente tampone dal vano basolaterale di ogni Transwell test per un tubo separato pulito per l'analisi. Rimuovere il test Transwells utilizzato per esaminare diffusione passiva fluoresceina di sodio dalla piastra e scartare. Riportare la piastra con Transwells restanti l'incubatrice.
   8. Mettere 100 ml di ciascuna soluzione standard in triplice copia in una da 96 pozzetti a fondo piatto piatto.
   9. Preparare tre diluizioni di ciascun campione basolaterale (1:02, 1:20 e 1:50) in non-fluorescente tampone, e aggiungere 100 ml di ciascun campione diluito e di ogni diluizione, in duplice copia, in un 96-ben piatto piastra inferiore.
   10. Misura assorbanza del campione su un lettore di piastre ELISA a 486 nm o 490 nm.
   11. Determinare la concentrazione di sodio fluoresceina nel vano basolaterale confrontando l'assorbanza dei campioni con i valori di assorbanza per il sodio fluoresceina stcurva Andard.

4. Infezione polarizzata Calu-3 LCC con Virus Respiratorio

Misure di sicurezza: Eseguire tutte le procedure in un armadio biosicurezza utilizzando una tecnica sterile cultura, ad un livello adeguato di biosicurezza per il virus in uso.

1. Diluire virus nel siero privo EMEM modo che inoculi desiderata sarebbe in 100 pl.
2. Lavare le cellule nel siero senza EMEM. Aspirare delicatamente media da tutti i pozzetti, rimuovere il mezzo apicale poi il mezzo basolaterale. Con una pipetta capillare collegato ad una trappola vuoto con un vuoto dolce, o con una pipetta da 1 ml, medie aspirato da cell-free pozzetti A1 e D1, poi da seeded pozzi, prima rimuovere il mezzo apicale da tutti i pozzetti, e quindi rimuovendo il mezzo basolaterale da tutti i pozzetti. Non toccare le membrane inserti mentre aspirazione media.
   1. Aggiungere 100 pl di siero privo EMEM al compartimento apicale del cell-free pozzetti A1 e D1, e quindi tegli seeded pozzi, dirigendo medie nel vano apicale usando il lato dell'inserto per guidare la punta della pipetta. Non aggiungere mezzo direttamente sulle cellule, e non toccare la membrana di inserimento.
   2. Aggiungere 600 microlitri di siero privo EMEM ai compartimenti basolaterali. Aggiungere mezzo a ciascuna Transwell inclinando la pipetta contro la parete del vano e rilasciando lentamente il mezzo nel pozzo.
   3. Aspirare delicatamente terreno privo di siero da pozzi.
3. A partire da pozzi non infetti o mock-infetto, aggiungere diluizioni virus appropriate al compartimento apicale Transwells. Per i pozzi non infetti, aggiungere 100 microlitri di siero-free EMEM al compartimento apicale di Transwells appropriate, per mock-infettate pozzetti, aggiungere 100 ml di virus diluito in preparazione privo di siero EMEM al compartimento apicale di Transwells caso, e per infezione da virus, diluire virus nel siero senza EMEM e aggiungere 100 microlitri ai compartimenti apicali delle Transwells appropriati.
4. Aggiungere 600 ml di siero-free EMEM in tutti i comparti basolaterali.
5. Incubare a 37 ° C e il 7% CO ₂ per 2 h.
6. Aspirare il terreno da pozzi, in primo luogo da pozzi non infetti e mock-infetto, quindi dai pozzi infetti. Rimuovere surnatanti apicali prima, seguita da surnatanti basolaterali.
7. Sostituire medio con 200 pl di EMEM-10% in compartimenti apicali e 600 pl di EMEM-10% in compartimenti basolaterali.

Risultati

Quando coltivata come liquido ricoperte culture (LCC) in sistemi di coltura Transwell, come illustrato in figura 1, Calu-3 cellule polarizzano, sviluppo distinte superfici apicale e basolaterale. Seguendo il metodo qui descritto, il trans-epiteliale resistenza elettrica (TEER) di Calu-3 LCC raggiunge un plateau a 1000 Ω o sopra × ² cm entro 3 settimane dopo la semina, di cui un esempio è mostrato in figura 2. Le giunzioni strette formate tra cellule polarizzate impedire equilibrazione passiva di piccole molecole tra i compartimenti apicale e basolaterale. Così, un saggio modificato di sodio fluoresceina equilibrazione viene utilizzato per confermare polarizzazione di Calu-3 LCC ^15,17,18. Come TEER di Calu-3 monostrati cellulari in LCC aumenta, la quantità di fluoresceina che equilibra passivamente nel compartimento basolaterale diminuisce. Una volta che il TEER è 1000 × Ω cm ^2, la quantità di fluoresceina che equilibra inal vano basolaterale è ≤ 1%, come mostrato in figura 3, pertanto, Calu-3 LCC sono considerati completamente polarizzato quando il TEER è ≥ 1000 Ω cm ² ×. La misurazione TEER picco di Calu-3 LCC può variare dalla fase sperimentale alla sperimentazione. Tuttavia, una volta plateau TEER valori per qualsiasi dato esperimento, completamente polarizzata, non infetto Calu-3 LCC può essere stabile per 5 a 12 settimane dopo la semina. Assenza di sviluppo di resistenza in Transwell-colta Calu-3 può essere causato da diversi fattori come indicato nella Tabella 1. Dopo l'TEER di Calu-3 plateau LCC pari o superiore 1000 Ω × ² cm, il modello è pronto per essere utilizzato per esaminare le risposte delle cellule epiteliali delle vie aeree da patogeni respiratori, tra cui il virus respiratorio sinciziale (RSV). Esposizione a risultati RSV in una più rapida diminuzione dell'integrità cultura polarizzata rispetto a un mock-infezione di cellule (Figura 4).

Figura 1. Sezione rappresentazione di Transwell-colture di cellule. Le cellule sono cresciute sulla superficie apicale della membrana dell'inserto.

Figura 2. Sviluppo di trans-epiteliale resistenza elettrica (TEER) e polarizzazione di cellule Calu-3 dopo la semina in inserti Transwell. A ciascun punto di tempo TEER si presenta come mediana Ω x cm ² ± SEM di 32 pozzetti indipendenti di un esperimento rappresentativo.

Figura 3. Passivo equili brazione di fluoresceina sodio nel comparto basolaterale di Calu-3 monostrati di cellule viene inibita come cellule si polarizzano. dati cumulati di quattro esperimenti indipendenti è presentato. Ciascun punto di dati rappresenta una singola misurazione.

Figura 4. Infezione da VRS di Calu-3 polarizzato LCC accelera un calo integrità monostrato. Polarizzati Calu-3 cellule sono state infettate con RSV-A2 ad una MOI = 1 al giorno 0, e la polarità è stata monitorata per 8 settimane dopo l'infezione. Un esperimento rappresentativo è mostrato. I dati sono presentati come media di resistenza 8 pozzetti indipendenti per infezione ± SEM per punto temporale. * P <0.05 tra le culture e mock-RSV-A2-infetti, come determinato da Student t-test.

modi "> Problema Risoluzione (s) La resistenza non è misurabile

• Rimuovere eventuali bolle d'aria nei pozzetti
• Utilizzare Calu-3 celle che sono state congelate subcoltura da magazzino meno di 10 volte
• Non permettere Calu-3 celle per raggiungere il 100% di confluenza in sottocultura monostrato
• Controllare che le cellule non crescono sulla plastica ben al di sotto l'inserto (che indica che le cellule possono essere coltivate attraverso i pori dell'inserto)
• Lasciare 2-3 settimane post-semina dello sviluppo della resistenza totale
• Controllare la composizione e la dimensione dei pori di inserti usati, modificare se necessario (inserto poliestere consigliato, 0.3 micron dimensioni dei pori, senza rivestimenti, materiali per vedere i dettagli)
• Controllare la qualità dell'elettrodo, levigatura delicatamente per rimuovere le proteine ​​accumulate dalla punta, e se necessario sostituendo
• Controllare terreno per la crescita batterica

Sviluppa la resistenza, ma polarizzazione completo (≥ 1000 Ω × cm ²⁾ non è raggiunto

• Il tempo di attesa per la polarizzazione per lo sviluppo (può occasionalmente richiedere fino a 4 settimane)
• Utilizzare Calu-3 celle che sono state congelate subcoltura da magazzino meno di 10 volte
• Non permettere Calu-3 celle per raggiungere il 100% di confluenza in sottocultura monostrato
• Coerentemente sostituire medie culture Transwell, alternando tra il terzo giorno e poi quarto dopo l'alimentazione precedente
• Solo le cellule di coltura su inserti che vengono inseriti nelle righe esterne di piastre
• Utilizzare un lotto di inserti Transwell

Polarizzare cellule completamente, ma la resistenza non è coerente da una lettura all'altra

• Non disturbare o impilare piastre in incubatrice
• Non provocare vibrazioni nell'armadio biosicurezza mentre Transwell plates sono affidate
• Rimuovere eventuali bolle d'aria nei pozzetti
• Non disturbare lo strato di cellule con puntali se si cambia supporto o l'esecuzione di letture Teer
• Usare 200 microlitri media nel vano apicale; abbassare il volume potrebbe causare letture Teer instabili
• Controllare la qualità dell'elettrodo, levigatura delicatamente per rimuovere le proteine ​​accumulate dalla punta, e sostituire, se necessario,

Tabella 1. Ricerca guasti problemi che possono sorgere quando la coltura di Calu-3 celle in Transwells. Molteplici fattori contribuiscono alla polarizzazione pieno di Calu-3 celle in un liquido ricoperte di culture, la più probabile delle quali sono evidenziate in questa tabella.

Discussione

Nello stabilire Calu-3 LCC in inserti Transwell, cellule non polarizzare affatto, o non completamente polarizzare, come definito da una TEER ≥ 1000 Ω × ² cm e ≤ 1% equilibrazione sodio fluoresceina tra i compartimenti apicale e basolaterale. Inoltre, Calu-3 celle in LCC può polarizzare completamente, ma TEER potrebbe non essere coerente tra le misurazioni. Anche se le fluttuazioni nelle misure Teer di Calu-3 LCC sono normali di giorno in giorno, una volta completamente polarizzati, scombussolato in modo drammatico in TEER non sono previsti fino a quando la cultura diminuisce naturalmente con l'età, che può essere un minimo di 5 settimane o finché 12 settimane dopo la semina.

La capacità di Calu-3 LCC per polarizzare dipende in parte come le cellule vengono mantenute e subcoltivate prima dell'uso nel sistema Transwell. Le cellule che sono cresciuti oltre il 90% di confluenza in un monostrato in subcoltura, che sono state subcoltura più di 10 volte da stock congelati, o che non sono inen fornito con mezzo fresco su un programma normale sono meno propensi a polarizzare pienamente, e qualsiasi polarizzazione è probabile un rapido declino. Incompleta o totale assenza di polarizzazione può essere attribuita alla variazione nel materiale e la dimensione dei pori di Transwells utilizzati per Calu-3 LCC, e da lotto a lotto variazione Transwells di composizione simile dimensione dei pori può anche influenzare la polarizzazione. Dimensioni dei pori più grandi possono permettere Calu-3 di crescere attraverso la membrana Transwell nel vano basolaterale, impedendo la cultura di polarizzazione. L'assenza di polarizzazione può anche essere dovuta alla crescita batterica, indicato dal terreno di coltura nebuloso, che porta alla successiva ripartizione delle giunzioni strette tra Calu-3 celle.

Misurazioni Teer variabili di Calu-3 LCC possono essere causati da perturbazioni meccaniche dei Calu-3 monostrati cellulari LCC, gli inserti o le piastre stesse. Cambiamenti a medio e misurazioni Teer devono essere eseguiti senza puntali o elettrode conduce toccare le cellule. Durante l'esecuzione di queste operazioni, si dovrebbe aver cura di evitare l'introduzione di bolle d'aria all'interno del vano apicale e basolaterale, che disturbano la capacità del voltohmmeter per rilevare la resistenza. La capacità del voltohmmeter per rilevare la resistenza in una cultura che è in realtà polarizzata può anche limitata da accumulo di proteine ​​sui cavi elettrodi. Questo accumulo può essere rimosso con sabbiatura dolce, o può essere corretto sostituendo l'elettrodo.

Una volta Calu-3 LCC completamente polarizzare e la TEER non aumenta più, Calu-3 LCC sono pronte per l'uso come un modello in vitro per caratterizzare ospitanti risposte cellulari epiteliali polmonari di infezioni respiratorie. Questo sistema permette una migliore caratterizzazione delle risposte direzionali per patogeni rispetto alle linee polmone-coltura monostrato di cellule tradizionalmente utilizzati per studiare patogeni respiratori, come A549 e cellule HEp-2, con i vantaggi supplementari di Calu-3 LCC being più rapido per sviluppare, più facilmente ottenuta, e meno costoso da produrre rispetto primaria, polarizzata, NHBE differenziata. Simile a NHBE, polarizzato Calu-3 dimostrano formazione serrata di giunzione, e produrre mucine. Tuttavia, a differenza NHBE, polarizzate Calu-3 cellule non si differenziano in strati di cellule basali e cellule ciliate colonnari epiteliali, e pochi polarizzati Calu-3 le cellule si sviluppano le ciglia-come le proiezioni ^19. Così, anche se utile per esaminare le risposte di cellule polarizzate epiteliali delle vie aeree per insulto respiratoria, polarizzato Calu-3 LCC non sono un modello ideale per esaminare lo sviluppo delle vie aeree o di rimodellamento in risposta a insulto respiratorie o lesioni. Produzione di muco da cellule coltivate in vitro possono influenzare infettività cellulare, così come la liberazione del virus infettivo e diffusione del virus in un modello polarizzato, e un confronto diretto della produzione di muco tra polarizzata Calu-3 LCC e polarizzata, NHBE differenziata non è stata riportata . A549 e cellule HEp-2 ari più facile rispetto alla cultura Calu-3 cellule, tuttavia, a differenza Calu-3 LCC, non formano culture polarizzati quando coltivate su inserti Transwell, e quindi non sono modelli ideali per l'esame in vitro le risposte delle cellule epiteliali polarizzate di infezione del virus respiratorio .

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
			REAGENTI
Calu-3	ATCC	HTB-55
Tripsina 0,05% - 0,02% EDTA	Gibco / Invitrogen	25300
Medio Minimum Essential Eagle (EMEM)	Gibco / Invitrogen	07-00100DK
Siero bovino fetale (FBS)	HyClone	SH30070.03	Calore inattivano, 56 ° C, 30 min
Aminoacidi non essenziali 100X (10 mM)	Gibco / Invitrogen	11140	Conservare a 4 ° C al buio
L-glutammina	Gibco / Invitrogen	25030
HEPES	Gibco / Invitrogen	15630
EMEM-10% FBS (EMEM-10%)			Supplemento EMEM con FBS inattivato al calore al 10% di siero,-filtro sterile
EMEM-20% FBS + integratori (EMEM-20% + S)			Supplemento EMEM a concentrazioni finali: FBS inattivato al calore, 20%; 1X amminoacidi, 2 mM L-glutammina; HEPES 10 mM;-filtro sterile
Da 24 pozzetti Transwell piastre	Corning Costar	3472	3 Dimensione dei pori micron, poliestere
Blu Trypan	Gibco / Invitrogen	15250
Etanolo	Sigma	E7023	Preparare al 70% con sterili dH 2 O
PBS di Dulbecco (D-PBS)	Invitrogen	14040
Non fluorescente tampone			118 mM NaCl;4,75 mM KCl, 2,53 mM CaCl 2 × H 2 O, 2,44 mM MgSO 4, 1,19 mM KH 2 PO 4, 25 mM NaHCO 3 in acqua sterile;-filtro sterile
Sodio fluoresceina	Sigma	6377	1 mg / ml in sterile non fluorescente buffer;-filtro sterile, proteggere dalla luce, conservare a 4 ° C fino a 6 mesi
			ATTREZZATURE
Voltohmmeter	Mondo Strumenti di precisione
Stx2 elettrodo	Mondo Strumenti di precisione
Lettore di piastra ELISA			Grado di misurare A 486 o A 490