JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Результаты и выводы в настоящем докладе, принадлежат авторам и не обязательно отражают точку зрения Центра по контролю и профилактике заболеваний.

Аннотация

Апикальной и базолатеральной поверхности эпителиальных клеток дыхательных путей продемонстрировать направленный ответ на воздействия болезнетворных микроорганизмов в естественных условиях. Таким образом, идеальный в пробирке моделей для изучения клеточных реакций на возбудителей инфекций дыхательных путей поляризуются, образуя апикальной и базальной поверхностей. Одной из таких моделей отличается нормальным человеческим бронхиальные эпителиальные клетки (NHBE). Тем не менее, эта система требует образцы легочной ткани, опыт выделения и культивирования эпителиальных клеток из тканей, и время для создания воздух-жидкость культуры.

Calu-3 клетки, полученные из человеческих бронхиальной аденокарциномы, являются альтернативной моделью для изучения реакции проксимального эпителия дыхательных путей клетки дыхательных оскорбление 1, фармакологических соединений 2-6, 7-9 и бактериальных и вирусных патогенов, включая вирус гриппа, риновирусы и тяжелого острого респираторного синдрома - ассоциированный коронавирус 10-14. Недавно Wэлектронной показал, что Calu-3 клетки чувствительны к респираторно-синцитиальный вирус (РСВ) инфекцией в соответствии с NHBE 15,16. Здесь мы подробно создание поляризованным, покрытые жидкой культуры (LCC) из Calu-3 клетки, ориентируясь на технические подробности выращивания и культивирования Calu-3 клетки, сохраняя клетки, культивированные в LCC, и мы представляем Способ выполнения респираторная вирусная инфекция поляризованного Calu-3 клетки.

Чтобы постоянно получать поляризованные Calu-3 LCC, Calu-3 клетки должны быть тщательно субкультивируют до культивирования в Transwell вставками. Calu-3 однослойные культуры должна оставаться ниже 90% слияния, должны быть субкультивируют менее 10 раз из замороженных акций, и должны регулярно снабжаться свежей среде. После культивировали в Transwells, Calu-3 LCC должны быть обработаны с осторожностью. Нерегулярные изменения средствах массовой информации и механические или физические нарушения клеточных слоев или пластин негативно сказаться поляризациинесколько часов или дней. Поляризация контролируется оценки транс-эпителиального электрического сопротивления (TEER) и проверяется путем оценки пассивного уравновешивания флуоресцеина натрия между апикальной и базолатеральной отсеков 17,18. После TEER плато на уровне или выше 1000 Ω × см 2, Calu-3 LCC готовы использовать для изучения клеточных реакций на возбудителей инфекций дыхательных путей.

протокол

1. Культивирование Calu-3 Ячейки для использования в культурах Transwell

Меры безопасности: Выполнить все процедуры в кабинете биологической безопасности с использованием стерильной техники культуры.

  1. Таять клеток из замороженной хранения:
    1. Подготовка минимальную поддерживающую среду Игла, содержащей 20% инактивированной эмбриональной телячьей сыворотки (FBS), 0,1 мМ не-незаменимых аминокислот, 2 мМ L-глутамина, и10 мМ HEPES рН 7,4 (EMEM-20% + S). Стерильный фильтр подготовленной среде с помощью 0,2 мкм размеров пор фильтра, и теплая на водяной бане до 37 ° C. Чтобы быть более отражать на месте окружающую среду эпителия дыхательных путей, среднего не дополняется с помощью антибиотиков или противогрибковых.
    2. Оттепель замороженных криопробирку из Calu-3 клетки быстро (<1 мин) при 37 ° С водяной бане.
    3. Передача талой клеток в 50 мл стерильной коническую трубку и добавить 30 мл подогретого EMEM-20% + S.
    4. Осаждения клеток путем центрифугирования в течение 5 мин при 1000-1200 × г,без охлаждения, так и с низкой скоростью тормоза.
    5. Слейте супернатант осторожно и ресуспендирования клеток в 5 мл подогретого EMEM-20% + S, осторожно пипеткой вверх и вниз. Семенной 2 до 5 × 10 6 клеток на лунку в 6-луночный планшет для культивирования тканей и инкубировать при 37 ° C, 7% CO 2 в атмосфере воздуха до клетки 75% - 80% вырожденная. Проверьте ежедневно, до 7 дней может потребоваться. Каждые 3-4 дня аспирации среды от клеток и заменить его свежим EMEM-20% + S.
  2. Для субкультуры клеток:
    1. Теплый 0,05% трипсина - 0,02% ЭДТА при 37 ° C водяной бане. Аспирируйте среды из клеток, клетки и мыть один раз с подогретой 0,05% трипсина - 0,02% ЭДТА для удаления избытка среды и сыворотки. Снимите стирки и добавляют 1 мл нагревают трипсина на хорошо клеток.
    2. Инкубировать при 37 ° C и 7% CO 2 и монитор под микроскопом каждые 5 минут по крайней мере до 75% клетки отделяются от хорошо (ы) пластины культуре ткани. Это можетзанять от 5 до 30 мин.
    3. Вымойте клетки в EMEM-20% + S, чтобы удалить лишний трипсин. Передача трипсинизированных клеток в 50 мл стерильной коническую трубку. Несколько скважин клеток из одного 6-а культура пластины могут быть объединены в один 50 мл стерильной коническую трубку. Добавить 30 мл EMEM-20% + S и осаждения клеток центрифугированием при 1000-1200 × г, без охлаждения, так и с низкой скоростью тормоза.
    4. Слейте супернатант осторожно и ресуспендирования клеток в свежей EMEM-20% + S, осторожно пипеткой вверх и вниз. Использование шаги 1.2.1 через 1.2.3 выше trypsinize клетки, продолжают субкультуры клеток в культуре тканей блюда как описано в пунктах 1.2.5 через 1.2.7, когда они находятся в пределах от 75 - 80% вырожденная.
    5. Субкультура из одной ямы в 6-луночный планшет до одного Т-25 см 2 колбы в конечном объеме 5 мл EMEM-20% + S, посев от 0,5 до 1 × 10 6 клеток / колбу.
    6. Используя 5 мл нагревают трипсина на Т-25 см 2 колбы чтобы отделить клетки, субкультураот одного Т-25 см 2 колбы до одного Т-75 см 2 колбы в конечном объеме 10 мл EMEM-20% + S, посева от 1 до 5 × 10 6 клеток / колбу.
    7. Использование 8 мл нагревают трипсина на Т-75 см 2 колбы чтобы отделить клетки, субкультура от одного Т-75 см 2 колбы на 2 T-75 см 2 колбы. Для оптимального роста клеток, не субкультуру клеток в колбах больше, чем Т-75 см 2 или субкультуры в соотношении больше, чем 1 родитель колбы: 3 новых колб.
  3. Как только клетки были субкультивируют, полностью удалить и заменить среду каждые 2 до 3 дней, пока они не достигают 75-90% слияния. Клетки может занять до 3 недель, чтобы достичь 75-90% слияния. Для оптимального поколение поляризованных культуры, субкультуры клеток, прежде чем они выходят за пределы 90% слияния в виде монослоя.
  4. Продолжайте субкультуре клеток, пока достаточное количество клеток выросли на семена нужного количества вставками Transwell. Каждая вставка Transwell требует 2 × 10 5 клеток. Для достижения оптимальной производительности генерации поляризованной культуры, использовать клетки, которые подверглись не более 10 субкультур.

2. Выращивание поляризованный Calu-3 Жидкий покрытые культур (LCC)

Меры безопасности: Выполнить все процедуры в кабинете биологической безопасности с использованием стерильной техники культуры.

  1. Подготовка EMEM, содержащей 10% FBS (EMEM-10%) и теплые на водяной бане до 37 ° C.
  2. Подготовка 24-а Transwell пластины для посева. Использование стерильного пинцета, переместить Transwell вставки с внутренней на внешнюю строк пластины, не касаясь вставки мембраны. Клетки должны быть только субкультивируют в скважины на внешние ряды пластины. Для предотвращения введения пузырьков воздуха в базолатеральной отсеков, добавить 600 мкл EMEM-10%, до каждого из них рыбалка пипетки к стенке каждого отделения и медленно выпуская среды в скважину.
  3. Отсоедините клетки из Т-75 см 2 ткани. Subculture колбы нагревают использованием трипсина, и мыть в 30 мл EMEM-20% + S на каждые 2 флакона трипсинизированных клеток, как описано в пункте 1.2.
  4. Тщательно промытые ресуспендирования клеток в 5 мл EMEM-10%, мягко пипетки вверх и вниз.
  5. Определить жизнеспособной и общее количество клеток по методу исключения трипанового синего. Продолжайте только если 80% - 90% являются жизнеспособными.
  6. В 50 мл стерильной коническую трубку, развести клеток в концентрации 2 × 10 6 жизнеспособных клеток / мл с EMEM-10%.
  7. Добавить клеток в апикальной отсеке каждого Transwell. Для скважин A1 и D1, который будет бесклеточной управления скважинами, то есть пробелы, добавьте 100 мкл EMEM-10% без клеток. Для каждого из остальных скважин, добавить 100 мкл ресуспендированных Calu-3 клетки, мягко рыбалка пипетки против внутренний канал руководство вкладыша стене и медленно выпуская клетки. Не касайтесь пипеткой вставки мембраны. Для поддержания однородной суспензии Calu-3 клетки, мягко агитировать клеточной суспензиив течение этого посева шаг.
  8. Инкубируйте Transwell пластины при температуре 37 ° C и 7% CO 2 в атмосфере воздуха. Место пластины в инкубатор, где физическое воздействие будет минимальным. Для повышения эффективности поляризации, не складываются плит друг на друга.
  9. Для поддержания культуры до поляризованным и готовы к использованию в экспериментах, полностью заменить среду в Transwells, как описано в шагах 2,10 через 2,13 ниже. Средний должны быть полностью заменены три дня после того, как субкультивируют в Transwells, а затем в цикле поочередно четвертая, а затем третий день после предыдущего кормления, пока клетки полностью поляризованным.
  10. Теплый EMEM-10% на водяной бане до 37 ° C.
  11. Аккуратно аспирации среды от вставки Transwell. С капиллярной пипетки прикреплены к вакуумной ловушки с нежным вакуум, или со стандартным 1 мл пипетки, аспират среды от бесклеточной скважин A1 и D1, то из посеянных скважин, в первую удаление апикальной среде от всех скважин, и тКурица удаления базолатеральную среду из всех лунок. Не прикасайтесь вставки мембран при аспирационных среды.
  12. Добавить 200 мкл EMEM-10% к апикальной отсек бесклеточной скважин A1 и D1, то к семенами скважин, направляя среды в апикальной отсека использованием стороны вставки для руководства пипетки. Не добавляйте среды непосредственно на клетки, и не прикасайтесь к вставкой мембраны.
  13. Добавить 600 мкл EMEM-10% к базолатеральной отсеков. Для предотвращения введения пузырьков воздуха в базолатеральной отсеков, добавить средне каждого из них рыбалка пипетки к стенке каждого отделения и медленно выпуская среды в скважину.

3. Оценка сопротивления развития Calu-3 LCC

Меры безопасности: Выполнить все процедуры в кабинете биологической безопасности с использованием стерильной техники культуры.

  1. Оцените транс-эпителиального электрического сопротивления (TEER) из Calu-3 LCC через 30 минут послесредние изменения; оценка может быть выполнена после каждой среде изменения, если это необходимо. Выполните измерения в стерильных условиях. Начало измерений с бесклеточной контрольные лунки А1 и D1 (заготовок) для получения базовых измерений, и продолжить измерения для каждой скважины.
    1. В стерильных условиях, передает Stx2 электродом в 50 мл центрифужные пробирки, содержащие 70% этанола в стерильной воде и стерилизуют 15 мин.
    2. Калибровка и тестирование voltohmmeter для использования в соответствии с инструкциями производителя.
    3. Выньте электрод из этанола, воздух сухой 5-10 сек, и промыть электрод с стерильной EMEM-10%.
    4. Установите переключатель режима в voltohmmeter к сопротивлению настройки и включить питание.
    5. Аккуратно поместите электрод в одном из 3-х портов, которые обеспечивают доступ в базолатеральной отделение одной культуры Transwell. Место электрода так, что чем больше свинца только слегка касается нижней части внешнего хорошо и остается в вертикальном положении,и короче свинца в среде тканевой культуры апикальной отсеке, не касаясь вставки мембраны.
    6. Нажмите "Мера R" кнопку, и дождаться стабилизации показаний. Повторите эти действия для других 2 портами для каждой скважины и записывать измерения всех трех портах, в общей сложности трех измерений на лунку. Продолжить для измерения сопротивления для всех скважин клеток.
    7. Очистите электроды путем замачивания 5-10 мин в 70% этаноле, промывка в стерильных дН 2 O и сушки тщательно. Хранить в оригинальной упаковке.
    8. Рассчитать сопротивление каждой скважины, с помощью уравнения 1.
      Ω = Ω фактической выборки - Ω пустым, уравнение 1
      где Ω образца измерения средней из посеянных хорошо и Ω бланка средний измерения от 2 скважины, A1 и D1, содержащие вставки и среднего, но не клетки.
    9. Рассчитать сопротивление на единицу площади, используя Equaния 2.
      Ω × фактическая эффективная площадь мембраны = Ω × см 2, уравнение 2
      где эффективная площадь мембраны составляет 0,33 см 2 в течение 24-и вставки Transwell.
  2. Убедитесь, что поляризация является полным путем проведения вторичного анализа, измерения пассивной диффузии флуоресцеина натрия между апикальной и базолатеральной отсеках, на 2:59 Transwell культур. Скважин, используемых для анализа флуоресцеина натрия должна быть отброшена сразу же после завершения анализа.
    1. Подготовка нефлуоресцентного буфера (118 мМ NaCl, KCl 4,75 мм, 2,53 мМ CaCl 2 · 2H 2 O, 2,44 мМ MgSO 4; 1,19 мм KH 2 PO 4, 25 мМ NaHCO 3 в стерильной воде, стерильный фильтр с устройством фильтрации 0,45 мкм ). Подготовка флуоресцеина натрия в дозе 1 мг / мл в нефлуоресцентного буфере, стерильный фильтр, завернуть в алюминиевую фольгу и хранить при 4 ° C, в защищенном от света. Нагреться до комнатной temperatuповторно перед использованием.
    2. После завершения измерения сопротивления, осторожно снимите средние и от базолатеральной и апикальной отделения от одного до трех отдельных культур Transwell.
    3. Промыть Transwell культур. Аккуратно добавить 600 мкл при комнатной температуре стерильной PBS Дульбекко (D-PBS) в базолатеральной отделений и 100 мкл при комнатной температуре стерильной D-PBS к апикальной отсеков.
    4. Аккуратно удалите D-PBS из скважин. Добавить 600 мкл стерильной нефлуоресцентного буфера в базолатеральной отсеков. Добавить 100 мкл стерильной 1 мг / мл натрия флуоресцеина к апикальной отсеков.
    5. Инкубировать при 37 ° С в течение 1 часа. CO 2 не требуется во время этой инкубации.
    6. Во время инкубации подготовить флуоресцеина натрия стандартной кривой в диапазоне от 20 мкг / мл и 0 мкг / мл, с использованием не-флуоресцентный буфера для разбавления натрия флуоресцеина. Подготовка по крайней мере 8 различных концентраций натрия флуоресцеина, каждый в конечном объеме не менее 600 мкл. Держатьстандартном разведении кривой защищенном от света до полной готовности для измерения оптической плотности.
    7. Передача нефлуоресцентного буфера для образцов с базолатеральной отсеке каждого теста Transwell в отдельную чистую пробирку для анализа. Извлеките тест-Transwells используется для изучения пассивной диффузии флуоресцеина натрия из пластины и выбросить. Вернуться пластины с остальными Transwells в инкубатор.
    8. Поместите 100 мкл каждого стандартного раствора в трех экземплярах в 96-и плоским дном тарелку.
    9. Подготовить три разведения каждого образца базолатеральной (1:2, 1:20 и 1:50) в нефлуоресцентного буфера, и добавить 100 мкл каждого неразбавленного образца и каждого разведения в двух экземплярах, в 96-и плоским Нижняя пластина.
    10. Измерение поглощения образца на читателя ИФА на 486 нм и 490 нм.
    11. Определить концентрацию натрия флуоресцеина в базолатеральной отсек путем сравнения оптической плотности образцов от значения абсорбции для флуоресцеина натрия йAndard кривой.

4. Заражение поляризованный Calu-3 LCC с дыхательными Вирус

Меры безопасности: Выполнить все процедуры в кабинете биологической безопасности с использованием стерильной техники культуры, на уровне биобезопасности подходит для вирусов используется.

  1. Развести вируса в сыворотке крови без EMEM, так что желаемого посевной бы в 100 мкл.
  2. Вымойте клетки в бессывороточной EMEM. Аккуратно аспирации среды из всех скважин, удаление апикальной среды, то базолатеральной среде. С капиллярной пипетки прикреплены к вакуумной ловушки с нежным вакуум, или со стандартным 1 мл пипетки, аспират среды от бесклеточной скважин A1 и D1, то из посеянных скважин, в первую удаление апикальной среднего из всех лунок, а затем удаление базолатеральную среду из всех лунок. Не прикасайтесь вставки мембран при аспирационных среды.
    1. Добавить 100 мкл бессывороточной EMEM к апикальной отсек бесклеточной скважин A1 и D1, а затем тОн посеян скважин, направляя среды в апикальной отсека использованием стороны вставки для руководства пипетки. Не добавляйте среды непосредственно на клетки, и не прикасайтесь к вставкой мембраны.
    2. Добавить 600 мкл бессывороточной EMEM к базолатеральной отсеков. Добавить среднего друг Transwell на рыбалку пипетки к стенке купе и медленно выпуская среды в скважину.
    3. Аккуратно аспирации бессывороточной среды из скважин.
  3. Начиная с незараженных или макет-инфицированных скважин, добавить соответствующие разведения вируса к апикальной отсек Transwells. Для неинфицированных скважин, добавить 100 мкл бессывороточной EMEM к апикальной отсек соответствующих Transwells, для макета-инфицированных скважин, добавить 100 мкл вирусов подготовки разводят в бессывороточной EMEM к апикальной отсек соответствующих Transwells, так и для вирусной инфекции, разбавить вирус в бессывороточной EMEM и добавить 100 мкл к апикальной отделений соответствующих Transwells.
  4. Добавить 600 мкл бессывороточной EMEM для всех базолатеральной отсеков.
  5. Инкубировать при 37 ° C и 7% CO 2 в течение 2 часов.
  6. Аспирируйте среды из скважин, первая из неинфицированных и макет-инфицированных скважины, то из зараженных колодцев. Удалить апикальной супернатантов первой, а затем базолатеральной супернатантах.
  7. Заменить среде с 200 мкл EMEM-10% в апикальной отделений и 600 мкл EMEM-10% в базолатеральной отсеков.

Результаты

При выращивании в жидкой покрытой культур (LCC) в системе Transwell культуры, как показано на рисунке 1, Calu-3 клетки поляризуются, развитие различных апикальной и базальной поверхностей. В соответствии с методом, описанным здесь, транс-эпителиального электрического сопротивления (TEER) из Calu-3 LCC достигает плато на уровне или выше 1000 Ω × см 2 в течение 3 недель после посева, пример которой показан на рисунке 2. Плотные соединения образуются между поляризованные клетки предотвращения пассивного уравновешивания малых молекул между апикальной и базолатеральной отсеков. Таким образом, изменение флуоресцеина натрия уравновешивания анализ используется для подтверждения поляризации Calu-3 LCC 15,17,18. Как TEER из Calu-3 монослоя клетки увеличивается в LCC, количество флуоресцеина, что пассивно уравновешивает в базолатеральной отсеке уменьшается. После того, TEER составляет 1000 Ω × см 2, количество флуоресцеина, что уравновешивает вв базолатеральной отсек ≤ 1%, как показано на рисунке 3, поэтому Calu-3 LCC считается полностью поляризован, когда TEER является ≥ 1000 Ω × см 2. Пик измерения TEER из Calu-3 LCC могут отличаться от эксперимента к эксперименту. Однако, как только TEER значения плато для любой эксперимент, полностью поляризован, неинфицированных Calu-3 LCC могут быть стабильными в течение 5 через 12 недель после посева. Отсутствие сопротивления развития в Transwell-культурный Calu-3 может быть вызвано несколькими факторами, как указано в таблице 1. Когда TEER из Calu-3 LCC плато на уровне или выше 1000 Ω × см 2, модель готова быть использован для изучения эпителия дыхательных путей клеточного ответа на возбудителей инфекций дыхательных путей, в том числе респираторно-синцитиальный вирус (RSV). Воздействие RSV приводит к более быстрому снижению в поляризованном целостности культуры по сравнению с макетом заражения клетки (рис. 4).

figure-results-2107
Рисунок 1. Сечение представление Transwell-культуре клеток. Клетки, выращенные на апикальной поверхности пластины мембраны.

figure-results-2388
Рисунок 2. Развитие транс-эпителиального электрического сопротивления (TEER) и поляризации Calu-3 после посева клеток в Transwell вставками. В каждый момент времени, TEER представлены как медиана Ω х см 2 ± SEM из 32 независимых скважин одного из представителей эксперимент.

figure-results-2908
Рисунок 3. Пассивный равновесия расслоения натрия флуоресцеина в базолатеральной отсек Calu-3 монослоя клетки подавляется, как клетки становятся поляризованными. полезных данных из четырех независимых экспериментов представлены. Каждая точка данных представляет собой отдельное измерение.

figure-results-3437
Рисунок 4. RSV инфекции поляризованного Calu-3 LCC ускоряет снижение монослоя целостности. Поляризованных Calu-3 клетки были инфицированы RSV-A2 в МВД = 1 на 0 день, и полярность следили в течение 8 недель после инфицирования. Один из представителей эксперимента. Данные представлены как среднее сопротивление 8 независимых скважин на инфекцию ± SEM в момент времени. * Р <0,05 между макетом и RSV-A2-инфицированных культур, как это определено Стьюдента-тест.

способы "> Вопрос Разрешение (ы) Сопротивление не поддается измерению
  • Удалите пузырьки воздуха в скважины
  • Используйте Calu-3 клетки, которые были субкультивируют из замороженных складе менее 10 раз
  • Не допускайте Calu-3 клетки до достижения 100% слияния в монослой субкультуры
  • Убедитесь, что клетки не растут на пластиковые значительно ниже вставки (о том, что клетки могут выросли через поры вставка)
  • Позвольте 2-3 недели после посева для полноценного развития сопротивления
  • Проверьте состав и размер пор вставки, измените, если это необходимо (рекомендуется вставки полиэстер, 0,3 мкм, размер пор, никаких покрытий, см. материалы для деталей)
  • Проверьте качество электрода, шлифование осторожно, чтобы удалить накопившийся белки от кончика, и заменить при необходимости
  • Проверьте средой для роста бактерий
Устойчивость развивается, но полная поляризация (≥ 1000 Ω × см 2) не достигается
  • Разрешить дополнительное время для поляризации на разработку (иногда может занять до 4 недель)
  • Используйте Calu-3 клетки, которые были субкультивируют из замороженных складе менее 10 раз
  • Не допускайте Calu-3 клетки до достижения 100% слияния в монослой субкультуры
  • Последовательно заменить среды в культурах Transwell, чередующихся между третьим и четвертый день после предыдущего кормления
  • Только клетки культуры на вставки, которые размещаются в наружных рядов пластинок
  • Используйте другой много вставок Transwell
Клетки полностью поляризовать, но сопротивления не согласуется с одного чтении на следующей
  • Не нарушать или стек пластин в инкубаторе
  • Не вызывают вибрацию в кабинет биобезопасности при Transwell платформыES решаются
  • Удалите пузырьки воздуха в скважины
  • Не беспокоить слой клеток с наконечников при изменении среды или при выполнении TEER чтениях
  • Используйте 200 мкл среды в апикальной отсека; меньший объем может привести к нестабильной показания TEER
  • Проверьте качество электрода, шлифование осторожно, чтобы удалить накопившийся белки от кончика, и при необходимости замените

Таблица 1. Устранение неисправностей проблемы, которые могут возникнуть при культивировании Calu-3 клеток в Transwells. Несколько факторов способствуют полной поляризации Calu-3 клеток в жидкой покрытой культур, наиболее вероятный из которых выделены в таблице.

Обсуждение

При установлении Calu-3 LCC вставки в Transwell, клетки не могут поляризовать вообще, либо не могут в полной мере поляризации, как это определено TEER ≥ 1000 Ω × см 2 и ≤ 1% натрия красителя флуоресцеина равновесия между апикальной и базолатеральной отсеков. Кроме того, Calu-3 клеток в LCC может полностью поляризовать, но TEER могут быть несовместимы между измерениями. Хотя колебания TEER измерений Calu-3 LCC нормальные изо дня в день, один раз полностью поляризован, драматические колебания в TEER не ожидается до культура естественно снижается с возрастом, которое может быть всего лишь 5 недель или до тех пор, как 12 недель после посева.

Способность Calu-3 LCC для поляризации зависит отчасти от того, как клетки сохраняются и субкультивируют перед использованием в системе Transwell. Клетки, которые выросли за 90% слияния в виде монослоя во время пересева, которые были субкультивируют более чем в 10 раз от замороженных акций, или, что еще не будетан поставляется с свежей среды на регулярной основе, менее вероятно, чтобы полностью поляризуются, и любой поляризации, скорее всего, быстро снижаться. Неполное или полное отсутствие поляризации может также быть связано с изменением материала и размера пор Transwells используется для Calu-3 LCC, и многие-к-много изменений в Transwells аналогичного состава и размера пор также может влиять на поляризацию. Большие размеры пор могут позволить Calu-3 расти через мембрану Transwell в базолатеральной отсека, предотвращая культуры с поляризационным. Отсутствие поляризации может быть также связано с бактериального роста, с указанием дымчатый культуральной среде, что приводит к последующей разбивкой плотных контактов между Calu-3 клетки.

Переменная измерений TEER из Calu-3 LCC может быть вызвано механическим нарушений Calu-3 LCC клетки монослоя, вставки, или сами таблички. Средние изменения и TEER измерения должны быть выполнены без наконечников пипеток или электроде приводит касаясь клетки. При выполнении этих операций, следует позаботиться, чтобы избежать введения пузырьков воздуха в апикальной и базолатеральной отсеков, которые будут нарушать способность voltohmmeter обнаружить сопротивление. Способность voltohmmeter для выявления сопротивления в культуре, которая на самом деле поляризованные также может ограничиваться белка отложений на электроде ведет. Этот нарост может быть удалена с нежной шлифовки, или может быть исправлена ​​путем замены электрода.

После Calu-3 LCC полностью поляризовать и TEER больше не растет, Calu-3 LCC готовы для использования в качестве модели в пробирке для характеристики хозяин легочного эпителия клеточный ответ на респираторные инфекции. Эта система позволяет лучше характеристику направленности ответов на возбудителей по сравнению с однослойной-культурный легких клеточных линий, традиционно используемые для изучения возбудителей инфекций дыхательных путей, таких как A549 и Нер-2 клеток, с дополнительными преимуществами Calu-3 LCC-байнг более быстрого развиваться, получить легче, и дешевле, чем генерировать первичный, поляризованные, дифференцированные NHBE. Как и в NHBE, поляризованный Calu-3 продемонстрировать плотным строем перехода, и производить муцина. Однако, в отличие NHBE, поляризованный Calu-3 клетки не дифференцируются в слоях базальных клеток и мерцательного цилиндрического эпителия клеток, и несколько поляризованные Calu-3 клетки развиваются реснички выступы 19. Таким образом, хотя полезен для изучения поляризованной реакции дыхательных путей, клетки эпителия дыхательных оскорбление, поляризованные Calu-3 LCC не являются идеальной моделью для изучения развития дыхательных путей или реконструкции в ответ на дыхательную оскорбление или травмы. Слизь производство культивируемых клеток в пробирке могут повлиять на сотовый инфекционной, а также выпуск инфекционного вируса и распространения вируса в поляризованном модели, и прямое сравнение слизи между поляризованными Calu-3 LCC и поляризованные, дифференцированные NHBE не сообщалось . A549 и Нер-2 клеткахповторно легче культуры, чем Calu-3 клетки, однако, в отличие от Calu-3 LCC, они не образуют поляризованные культур при выращивании на вставками Transwell, и, таким образом, не идеальными моделями для изучения в пробирке ответы поляризованных эпителиальных клеток респираторной вирусной инфекцией .

Раскрытие информации

Нет конфликта интересов объявлены.

Благодарности

Авторы хотели бы поблагодарить Элизабет Blanchard за техническую помощь. Результаты и выводы в настоящем докладе, принадлежат авторам и не обязательно отражают точку зрения Центра по контролю и профилактике заболеваний.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
РЕАГЕНТЫ
Calu-3 ATCC HTB-55
0,05% трипсина - 0,02% ЭДТА Gibco / Invitrogen 25300
Minimum Essential Орла Средний (EMEM) Gibco / Invitrogen 07-00100DK
Эмбриональной телячьей сыворотки (FBS) HyClone SH30070.03 Тепло-инактивации, 56 ° C, 30 мин
Номера для незаменимых аминокислот 100X (10 мМ) Gibco / Invitrogen 11140 Хранить при температуре 4 ° С в темноте
L-глютамин Gibco / Invitrogen 25030
HEPES Gibco / Invitrogen 15630
EMEM-10% FBS (EMEM-10%) Дополнение EMEM с инактивированной нагреванием FBS до 10% сыворотки, стерильный фильтр
EMEM-20% FBS + добавки (EMEM-20% + S) Дополнение EMEM до конечных концентраций: инактивированной нагреванием FBS, 20%; 1X аминокислот, 2 мМ L-глутамина, 10 мМ HEPES; стерильных фильтров
24-а Transwell пластин Corning Costar 3472 3 мкм, размер пор, полиэстер
Трипанового синего Gibco / Invitrogen 15250
Этанол Сигма E7023 Подготовить до 70%, используя стерильные дН 2 O
Дульбекко PBS (D-PBS) Invitrogen 14040
Non-флуоресцентный буфер 118 мм NaCl;4,75 мм KCl, 2,53 мМ CaCl 2 · H 2 O, 2,44 мМ MgSO 4; 1,19 мм KH 2 PO 4, 25 мМ NaHCO 3 в стерильной воде; стерильных фильтров
Натрий флуоресцеина Сигма 6377 1 мг / мл в стерильные нефлуоресцентного буфера; стерильным фильтром, защищенном от света месте, хранить при 4 ° C до 6 месяцев
ОБОРУДОВАНИЕ
Voltohmmeter Инструменты Всемирной Precision
Stx2 электрода Инструменты Всемирной Precision
ELISA ридер Возможность измерения 486 или 490

Ссылки

  1. Zhu, Y., Chidekel, A., Shaffer, T. H. Cultured human airway epithelial cells (calu-3): a model of human respiratory function, structure, and inflammatory responses. Critical care research and practice. 2010, (2010).
  2. Mukherjee, M., Pritchard, D. I., Bosquillon, C. Evaluation of air-interfaced Calu-3 cell layers for investigation of inhaled drug interactions with organic cation transporters in vitro. International journal of pharmaceutics. 426, 7-14 (2012).
  3. Baginski, L., et al. Investigations into the fate of inhaled salmon calcitonin at the respiratory epithelial barrier. Pharmaceutical research. 29, 332-341 (2012).
  4. Vllasaliu, D., Alexander, C., Garnett, M., Eaton, M., Stolnik, S. Fc-mediated transport of nanoparticles across airway epithelial cell layers. Journal of controlled release : official journal of the Controlled Release Society. , (2011).
  5. Vinhas, R., et al. Pollen proteases compromise the airway epithelial barrier through degradation of transmembrane adhesion proteins and lung bioactive peptides. Allergy. 66, 1088-1098 (2011).
  6. Hein, S., Bur, M., Schaefer, U. F., Lehr, C. M. A new Pharmaceutical Aerosol Deposition Device on Cell Cultures (PADDOCC) to evaluate pulmonary drug absorption for metered dose dry powder formulations. European journal of pharmaceutics and biopharmaceutics : official journal of Arbeitsgemeinschaft fur Pharmazeutische Verfahrenstechnik e. 77, 132-138 (2011).
  7. Huttunen, S., Toivanen, M., Arkko, S., Ruponen, M., Tikkanen-Kaukanen, C. Inhibition activity of wild berry juice fractions against Streptococcus pneumoniae binding to human bronchial cells. Phytotherapy research: PTR. 25, 122-127 (2011).
  8. Elm, C., Rohde, M., Vaerman, J. P., Chhatwal, G. S., Hammerschmidt, S. Characterization of the interaction of the pneumococcal surface protein SpsA with the human polymeric immunoglobulin receptor (hpIgR). The Indian journal of medical research. 119, 61-65 (2004).
  9. Sutherland, T. C., Quattroni, P., Exley, R. M., Tang, C. M. Transcellular passage of Neisseria meningitidis across a polarized respiratory epithelium. Infection and immunity. 78, 3832-3847 (2010).
  10. Grantham, M. L., et al. Palmitoylation of the influenza A virus M2 protein is not required for virus replication in vitro but contributes to virus virulence. Journal of. 83, 8655-8661 (2009).
  11. Saedisomeolia, A., Wood, L. G., Garg, M. L., Gibson, P. G., Wark, P. A. Lycopene enrichment of cultured airway epithelial cells decreases the inflammation induced by rhinovirus infection and lipopolysaccharide. The Journal of nutritional biochemistry. 20, 577-585 (2009).
  12. Yoshikawa, T., Hill, T., Li, K., Peters, C. J., Tseng, C. T. Severe acute respiratory syndrome (SARS) coronavirus-induced lung epithelial cytokines exacerbate SARS pathogenesis by modulating intrinsic functions of monocyte-derived macrophages and dendritic cells. Journal of virology. 83, 3039-3048 (2009).
  13. Yoshikawa, T., et al. Dynamic innate immune responses of human bronchial epithelial cells to severe acute respiratory syndrome-associated coronavirus infection. PloS one. 5, e8729 (2010).
  14. Hsu, A. C., et al. Critical role of constitutive type I interferon response in bronchial epithelial cell to influenza infection. PloS one. 7, e32947 (2012).
  15. Harcourt, J. L., Caidi, H., Anderson, L. J., Haynes, L. M. Evaluation of the Calu-3 cell line as a model of in vitro respiratory syncytial virus infection. Journal of virological methods. 174, 144-149 (2011).
  16. Zhang, L., Peeples, M. E., Boucher, R. C., Collins, P. L., Pickles, R. J. Respiratory syncytial virus infection of human airway epithelial cells is polarized, specific to ciliated cells, and without obvious cytopathology. Journal of virology. 76, 5654-5666 (2002).
  17. Geys, J., et al. In vitro study of the pulmonary translocation of nanoparticles: a preliminary study. Toxicology letters. 160, 218-226 (2006).
  18. Geys, J., Nemery, B., Hoet, P. H. Optimisation of culture conditions to develop an in vitro pulmonary permeability model. Toxicology in vitro : an international journal published in association with BIBRA. 21, 1215-1219 (2007).
  19. Grainger, C. I., Greenwell, L. L., Lockley, D. J., Martin, G. P., Forbes, B. Culture of Calu-3 cells at the air interface provides a representative model of the airway epithelial barrier. Pharmaceutical research. 23, 1482-1490 (2006).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

72Calu 3

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены