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Os resultados e conclusões deste relatório são de responsabilidade dos autores e não representam, necessariamente, a opinião dos Centros de Controle e Prevenção de Doenças.
As superfícies apicais e basolateral das células epiteliais das vias aéreas demonstram respostas direcionais para exposição patógeno in vivo. Assim, em modelos in vitro ideal para análise de respostas celulares a patogénios respiratórios polarizar, formando superfícies apical e basolateral. Um tal modelo é diferenciado normais células epiteliais brônquicas humanas (NHBE). No entanto, este sistema requer amostras de tecido pulmonar perícia, isolamento e cultura de células epiteliais do tecido e, em vez de gerar uma cultura de interface ar-líquido.
Calu-3 células, derivadas de um adenocarcinoma humano brônquica, são um modelo alternativo para a análise da resposta das células das vias respiratórias epiteliais proximais ao insulto respiratório 1, os compostos farmacológicos 2-6, e 7-9 de bactérias e agentes patogénicos virais, incluindo o vírus da gripe, rinovírus e síndrome respiratória aguda grave - associada coronavírus 10-14. Recentemente, we demonstraram que as células Calu-3 são susceptíveis ao vírus respiratório sincicial (RSV) a infecção de uma forma consistente com NHBE 15,16. Aqui, detalhe o estabelecimento de um polarizado, cultura líquido coberto (LCC) da Calu-3 células, concentrando-se sobre os detalhes técnicos de cultivo e cultura Calu-3 células, mantendo as células que foram cultivadas em LCC, e nós apresentamos o Método para a realização de infecção por vírus respiratório de polarizadas Calu-3 células.
Para obter consistentemente polarizada Calu-3 LCC, Calu-3 células devem ser cuidadosamente repicadas antes de cultivo em inserções Transwell. Calu-3 culturas em monocamada deve permanecer abaixo de confluência de 90%, devem ser subcultivadas menos de 10 vezes do stock congelado, e devem ser regularmente fornecido com meio fresco. Uma vez cultivadas em transwells, Calu-3 LCC devem ser manuseados com cuidado. Alterações irregulares de mídia e ruptura mecânica ou física das camadas de células ou placas de impactar negativamente a polarização paravárias horas ou dias. A polarização é monitorizada através da avaliação de trans-epitelial de resistência eléctrica (TEER) e é verificada através da avaliação da equilibração passiva de fluoresceína de sódio entre os compartimentos 17,18 apical e basolateral. Uma vez que TEER planaltos em ou acima de 1000 Ω × 2 cm, Calu-3 LCC está pronto a ser usado para analisar a resposta celular a agentes patogénicos respiratórios.
1. Cultura Calu-3 células para uso em culturas Transwell
Medidas de segurança: Realizar todos os procedimentos em um armário de biossegurança utilizando a técnica de cultura estéril.
2. Crescimento polarizado Calu-3 líquido cobertas de Culturas (LCC)
Medidas de segurança: Realizar todos os procedimentos em um armário de biossegurança utilizando a técnica de cultura estéril.
3. Avaliação do Desenvolvimento da Resistência Calu-3 LCC
Medidas de segurança: Realizar todos os procedimentos em um armário de biossegurança utilizando a técnica de cultura estéril.
4. Infectando Polarized Calu-3 LCC com Vírus Respiratório
Medidas de Segurança: executar todos os procedimentos descritos em uma cabine de segurança biológica utilizando a técnica de cultura estéril, a um nível apropriado de segurança biológica para o vírus a ser utilizado.
Quando cultivados como líquido cobertas culturas (LCC), em sistemas de cultura Transwell, tal como ilustrado na Figura 1, as células Calu-3, polarizam desenvolvimento distintas superfícies apical e basolateral. Seguindo o método descrito aqui, a resistência eléctrica trans-epitelial (TEER) de Calu-3 LCC atinge um patamar igual ou superior a 1.000 Ω × cm 2 a 3 semanas depois da sementeira, a exemplo do que é mostrado na Figura 2. As junções formadas entre as células polarizadas prevenir equilíbrio passivo de pequenas moléculas entre os compartimentos apical e basolateral. Assim, uma modificação do ensaio de equilíbrio de sódio fluoresceína é utilizada para confirmar a polarização de Calu-3 LCC 15,17,18. À medida que o TEER de monocamadas de células Calu-3 em aumentos de LCC, a quantidade de fluoresceína que equilibra passivamente no compartimento basolateral diminui. Uma vez que o TEER é 1000 × Ω cm 2, a quantidade de fluoresceína, que se equilibra, empara o compartimento basolateral é ≤ 1%, como mostrado na Figura 3 e, portanto, Calu-3 LCC são consideradas totalmente polarizado quando o TEER é ≥ 1,000 Ω × 2 cm. A medição do pico de TEER Calu-3 LCC podem variar de experiência para experiência. No entanto, uma vez que os valores TEER plateau para qualquer dada experiência, um totalmente polarizado, uninfected Calu-3 LCC pode ser estável durante 5 a 12 semanas após a semeadura. A ausência de desenvolvimento de resistência em Transwell-cultivadas Calu-3 pode ser causada por diversos factores como descritas na Tabela 1. Uma vez que o TEER de Calu-3 planaltos LCC em ou acima de 1000 × Ω cm 2, o modelo está pronto para ser usado para examinar As respostas das células epiteliais das vias aéreas a agentes patogénicos respiratórios, incluindo o vírus sincicial respiratório (RSV). A exposição a resultados de RSV em um declínio mais rápido na integridade cultura polarizada em comparação com uma infecção simulada, de células (Figura 4).
Figura 1. Células secção transversal da representação Transwell-cultura de células. São cultivadas na superfície da membrana apical de inserção.
Figura 2. Desenvolvimento de trans-epitelial de resistência eléctrica (TEER) e polarização de células Calu-3 após a semeadura em inserções Transwell. Em cada ponto de tempo, TEER é apresentada como mediana Ω x cm 2 ± SEM de 32 poços independentes de uma experiência representativa.
Figura 3. Passiva equi bração de fluoresceína de sódio no compartimento basolateral de monocamadas de células Calu-3 é inibida como as células tornam-se polarizada. dados acumulados de quatro experiências independentes são apresentados. Cada ponto de dados representa uma medição individual.
Figura 4. RSV infecção de polarização Calu-3 LCC acelera um declínio na integridade monocamada. Polarizados Calu-3 células foram infectadas com RSV-A2 a uma MOI = 1, no dia 0, e a polaridade foi monitorizada durante 8 semanas após a infecção. Um experimento representativo é mostrado. Os dados são apresentados como média resistência de 8 poços independentes por infecção ± SEM por ponto de tempo. * P <0,05 entre as culturas falsamente e RSV-A2 infectados, como determinado pelo teste t de Student.
Tabela 1. Resolução de problemas problemas que podem surgir quando a cultura de Calu-3 células de transwells. Vários fatores contribuem para a polarização cheio de Calu-3 células em líquido cobertas de culturas, o mais provável de que são destaque na tabela.
Ao estabelecer Calu-3 LCC em inserções Transwell, as células não podem polarizar de todo, ou não pode polarizar completamente, tal como definido por um TEER ≥ 1,000 Ω × 2 cm e ≤ sódio a 1% de corante de fluoresceína de equilíbrio entre os compartimentos apical e basolateral. Além disso, Calu-3 células de LCC pode totalmente polarizar, mas TEER podem ser inconsistentes entre as medidas. Apesar de flutuações nas medidas de Teer Calu-3 LCC são normais do dia a dia, uma vez totalmente polarizados, oscilações dramáticas na TEER não se espera até a cultura naturalmente diminui com a idade, o que pode ser tão pouco como cinco semanas ou enquanto 12 semanas após a semeadura.
A capacidade de Calu-3 LCC para polarizar depende em parte da forma como as células são mantidas e subcultivados antes da sua utilização no sistema Transwell. As células que cresceram para além de 90% de confluência como uma monocamada durante a repicagem, que foram subcultivadas mais de 10 vezes do stock congelado, ou que não sejaen fornecido com meio fresco em uma programação regular são menos propensos a polarizar completamente, e qualquer polarização provavelmente diminuirá rapidamente. Falta incompleta ou total de polarização pode também ser atribuída à variação no material e tamanho de poro de transwells utilizados para Calu-3 LCC, e de lote para lote, em transwells variação de composição semelhante e de tamanho de poro pode também afectar a polarização. Tamanhos maiores de poro pode permitir Calu-3 a crescer através da membrana Transwell no compartimento basolateral, impedindo a cultura a partir de polarização. Uma ausência de polarização pode também ser devido ao crescimento bacteriano, indicado por meio de cultura turva, o que leva à destruição subsequente das junções apertadas entre as células Calu-3.
Medições TEER variáveis de Calu-3 LCC pode ser causada por perturbações mecânicas dos Calu-3 monocamadas de células LCC, as inserções, ou as placas propriamente ditas. Mudanças de médio e medições Teer deve ser realizada sem ponteiras ou electroleva de tocar nas células. Durante a realização destas operações, deve ser tomado cuidado para evitar a introdução de bolhas de ar nos compartimentos apical e basolateral, que perturbam a capacidade do voltohmmeter para detectar a resistência. A capacidade do voltohmmeter para detectar a resistência de uma cultura que é, na verdade, polarizada pode também limitada pela acumulação de proteínas sobre as pontas dos eléctrodos. Esta acumulação-podem ser removidos com lixa suave, ou pode ser corrigido através da substituição do eléctrodo.
Uma vez Calu-3 LCC completamente polarizar o TEER e já não está a aumentar, Calu-3 LCC está pronto para ser utilizado como um modelo in vitro para caracterizar as respostas das células hospedeiras pulmonares epiteliais de infecção respiratória. Este sistema permite uma melhor caracterização das respostas de direcção, para agentes patogénicos em comparação com monocamada de cultura de linhas celulares de pulmão, tradicionalmente usados para estudar agentes patogénicos respiratórios, tais como A549 e células HEp-2, com as vantagens adicionais de Calu-3 LCC being mais rápido para desenvolver, mais fácil de obter, e menos dispendioso para gerar de primário, NHBE, polarizada diferenciada. Semelhante a NHBE, polarizada Calu-3 demonstram a formação da junção apertado, e produzir mucinas. No entanto, ao contrário NHBE, polarizados Calu-3 células não se diferenciam em camadas de células basais e células ciliadas epiteliais colunares, e poucos polarizadas Calu-3 células se desenvolvem cílios-como projeções 19. Assim, apesar de serem úteis para o exame respostas polarizadas de células epiteliais das vias aéreas respiratórias a insulto, polarizado Calu-3 LCC não é um modelo ideal para examinar o desenvolvimento das vias aéreas ou de remodelação em resposta ao insulto ou ferimento respiratório. A produção de muco pelas células em cultura in vitro podem ter impacto infectividade celular, bem como a libertação de vírus infeccioso e propagação do vírus em um modelo de polarização, e uma comparação directa da produção de muco polarizada entre Calu-3 LCC e NHBE, polarizada diferenciada não foi relatada . A549 e células HEp-2 are mais fácil do que a cultura de células Calu-3, no entanto, ao contrário de Calu-3 LCC, elas não formam as culturas polarizadas, quando cultivada em inserções Transwell, e, portanto, não são modelos ideais para a análise in vitro das respostas das células epiteliais polarizadas a infecção por vírus respiratório .
Não há conflitos de interesse declarados.
Os autores agradecem a Elisabeth Blanchard, por sua assistência técnica. Os resultados e conclusões deste relatório são de responsabilidade dos autores e não representam, necessariamente, a opinião dos Centros de Controle e Prevenção de Doenças.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
REAGENTES | |||
Calu-3 | ATCC | HTB-55 | |
Tripsina a 0,05% - 0,02% de EDTA | Gibco / Invitrogen | 25300 | |
Meio Essencial Mínimo de Eagle (EMEM) | Gibco / Invitrogen | 07-00100DK | |
De soro fetal bovino (FBS) | HyClone | SH30070.03 | Heat-inactivam, 56 ° C, 30 min |
Não-aminoácidos essenciais 100X (10 mM) | Gibco / Invitrogen | 11140 | Armazenar a 4 ° C no escuro |
L-glutamina | Gibco / Invitrogen | 25030 | |
HEPES | Gibco / Invitrogen | 15630 | |
FBS a 10%-EMEM (EMEM-10%) | Suplemento EMEM com FBS inactivado pelo calor a 10% de soro, esterilizada por filtro | ||
EMEM-FBS a 20% + suplementos (% EMEM + S-20) | Suplemento EMEM para concentrações finais: FBS inactivado pelo calor, a 20%; 1X aminoácidos, 2 mM de L-glutamina, a 10 mM de HEPES; esterilizada por filtro | ||
Placas de 24 poços Transwell | Corning Costar | 3472 | Tamanho de poro 3 uM de poliéster, |
Trypan azul | Gibco / Invitrogen | 15250 | |
Etanol | Sigma | E7023 | Prepare-se para 70% utilizando dH2O estéril |
PBS de Dulbecco (D-PBS) | Invitrogen | 14040 | |
Não fluorescente tampão | 118 mM NaCl;4,75 mM de KCl; 2,53 mM CaCl 2 × H 2 O; 2,44 mM MgSO 4, 1,19 mM KH 2 PO 4, 25 mM de NaHCO3 em água estéril; esterilizada por filtro | ||
Fluoresceína | Sigma | 6377 | 1 mg / ml em tampão não fluorescente estéril; esterilizada por filtro, proteger da luz; armazenar a 4 ° C até 6 meses |
EQUIPAMENTOS | |||
Voltohmmeter | Instrumentos de Precisão mundo | ||
STX2 eletrodo | Instrumentos de Precisão mundo | ||
Leitor de placas ELISA | Capaz de medir um 486 ou um 490 |
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