Estabelecer uma cultura líquida, coberta de vias respiratórias humanas epiteliais Polarized Calu-3 células para estudar a resposta Cell Host para patógenos respiratórios<em&gt; In vitro</em

Resumo

Os resultados e conclusões deste relatório são de responsabilidade dos autores e não representam, necessariamente, a opinião dos Centros de Controle e Prevenção de Doenças.

Resumo

As superfícies apicais e basolateral das células epiteliais das vias aéreas demonstram respostas direcionais para exposição patógeno in vivo. Assim, em modelos in vitro ideal para análise de respostas celulares a patogénios respiratórios polarizar, formando superfícies apical e basolateral. Um tal modelo é diferenciado normais células epiteliais brônquicas humanas (NHBE). No entanto, este sistema requer amostras de tecido pulmonar perícia, isolamento e cultura de células epiteliais do tecido e, em vez de gerar uma cultura de interface ar-líquido.

Calu-3 células, derivadas de um adenocarcinoma humano brônquica, são um modelo alternativo para a análise da resposta das células das vias respiratórias epiteliais proximais ao insulto respiratório ^1, os compostos farmacológicos ^2-6, e ^7-9 de bactérias e agentes patogénicos virais, incluindo o vírus da gripe, rinovírus e síndrome respiratória aguda grave - associada coronavírus ^10-14. Recentemente, we demonstraram que as células Calu-3 são susceptíveis ao vírus respiratório sincicial (RSV) a infecção de uma forma consistente com NHBE ^15,16. Aqui, detalhe o estabelecimento de um polarizado, cultura líquido coberto (LCC) da Calu-3 células, concentrando-se sobre os detalhes técnicos de cultivo e cultura Calu-3 células, mantendo as células que foram cultivadas em LCC, e nós apresentamos o Método para a realização de infecção por vírus respiratório de polarizadas Calu-3 células.

Para obter consistentemente polarizada Calu-3 LCC, Calu-3 células devem ser cuidadosamente repicadas antes de cultivo em inserções Transwell. Calu-3 culturas em monocamada deve permanecer abaixo de confluência de 90%, devem ser subcultivadas menos de 10 vezes do stock congelado, e devem ser regularmente fornecido com meio fresco. Uma vez cultivadas em transwells, Calu-3 LCC devem ser manuseados com cuidado. Alterações irregulares de mídia e ruptura mecânica ou física das camadas de células ou placas de impactar negativamente a polarização paravárias horas ou dias. A polarização é monitorizada através da avaliação de trans-epitelial de resistência eléctrica (TEER) e é verificada através da avaliação da equilibração passiva de fluoresceína de sódio entre os compartimentos ^17,18 apical e basolateral. Uma vez que TEER planaltos em ou acima de 1000 Ω × ² cm, Calu-3 LCC está pronto a ser usado para analisar a resposta celular a agentes patogénicos respiratórios.

Protocolo

1. Cultura Calu-3 células para uso em culturas Transwell

Medidas de segurança: Realizar todos os procedimentos em um armário de biossegurança utilizando a técnica de cultura estéril.

1. Para descongelar as células de armazenamento de congelados:
   1. Prepare Meio Mínimo Essencial de Eagle contendo 20% inactivado pelo calor de soro fetal bovino (FBS), 0,1 mM de não-aminoácidos essenciais, 2 mM de L-glutamina, e 10 mM de HEPES pH 7,4 (EMEM-20% + S). Esterilizada por filtro de média a preparada utilizando um filtro de 0,2 um de tamanho de poro, e aquecido num banho de água a 37 ° C. Para ser mais reflectora do ambiente em situ das vias aéreas epitélio, o meio não é suplementado com antibióticos ou antimicóticos.
   2. Descongelar um criotubo gelado de células Calu-3 rapidamente (<1 min) num banho de água a 37 ° C.
   3. Transferir as células descongeladas a um tubo de 50 ml estéril cónico e adicionar 30 ml de EMEM-aquecido a 20% + S.
   4. Pellet as células por centrifugação durante 5 min a 1,000-1,200 × g,sem refrigeração, e com uma velocidade baixa de freio.
   5. Decantar o sobrenadante cuidadosamente e ressuspender as células em 5 ml de EMEM-20% + S aquecido suavemente pipetando para cima e para baixo. Semente 2-5 x 10 ⁶ células por poço numa placa de cultura de tecidos de 6 poços e incuba-se a 37 ° C, 7% CO ₂ em ar ambiente até que as células são de 75% - 80% confluentes. Verifique diariamente; até 7 dias podem ser necessários. A cada 3-4 dias, aspirar o meio das células e substitui-lo com EMEM fresco, 20% + S.
2. Para subcultura de células:
   1. 0,05% de tripsina quente - 0,02% de EDTA em um banho de água a 37 ° C. Aspirar o meio das células, uma vez que as células e lava-se com tripsina a 0,05% aquecida - EDTA a 0,02% para remover o excesso de meio e soro. Remover a solução de lavagem e adicionar 1 ml de tripsina aquecido por poço para as células.
   2. Incubar a 37 ° C e CO _2, e 7% de monitor sob um microscópio a cada 5 min até que pelo menos 75% das células destacam do poço (s) da placa de cultura de tecidos. Isso podeter entre 5 e 30 min.
   3. Lave as células em EMEM-20% + S para remover o excesso de tripsina. Transferir as células tripsinizadas em um tubo de 50 ml estéril cónico. Múltiplos poços de células a partir de uma placa de cultura de 6 poços podem ser reunidos numa única tubo estéril de 50 ml de Erlenmeyer. Adicionar 30 ml de células de EMEM a 20% +-S e de sedimento por centrifugação a 1,000-1,200 × g, sem refrigeração, e com uma velocidade baixa de freio.
   4. Decantar o sobrenadante com cuidado e ressuspender as células em% EMEM-20 fresco + S cuidado pipetando para cima e para baixo. Usando etapas 1.2.1 1.2.3 acima através de Tripsinizar as células, as células continuarão a subcultura em placas de cultura de tecidos, tal como descrito nos passos 1.2.5 1.2.7 através quando estão entre 75 - 80% confluentes.
   5. Subcultura a partir de um poço de uma placa de 6 poços até um T-25 centímetros balão ^2, num volume final de 5 ml de EMEM a 20% +-S, semeando entre 0,5 a 1 x 10 ⁶ células / frasco.
   6. Usando 5 ml de tripsina aquecido por T de 25 cm ² balão para separar células de subcultura,a partir de um frasco de T-25 ^cm2 até um T-75 cm ² balão num volume final de 10 ml de EMEM a 20% +-S, semeando entre 1 e 5 x 10 ⁶ células / frasco.
   7. Utilizando 8 ml de tripsina aquecido por T de 75 cm ² balão para separar células de subcultura, a partir de um T-75 cm ² em 2 frasco T-75 cm ² frascos. Para o crescimento celular óptimo, não se células de subcultura em frascos maiores do que T-75 cm ² ou subcultura a uma proporção maior do que um frasco de pai: 3 frascos novos.
3. Uma vez que as células foram subcultivadas, remover completamente e substitua meio a cada 2 a 3 dias até atingirem a confluência de 75-90%. As células podem levar até 3 semanas para chegar a confluência de 75-90%. Para a geração óptima de culturas polarizadas, células de subcultura antes que crescem para além de 90% de confluência como uma camada única.
4. Continue a células de subcultura até um número suficiente de células cresceram até o número desejado de sementes de inserções Transwell. Cada pastilha Transwell requer 2 × 10 ⁵ células. Para um desempenho ideal gerando culturas polarizadas, utilize células que sofreram mais de 10 subculturas.

2. Crescimento polarizado Calu-3 líquido cobertas de Culturas (LCC)

Medidas de segurança: Realizar todos os procedimentos em um armário de biossegurança utilizando a técnica de cultura estéril.

1. Prepare EMEM contendo FBS a 10% (EMEM-10%) e aquecido num banho de água a 37 ° C.
2. Prepare uma placa de 24 poços Transwell para a semeadura. Utilizando fórceps estéreis, mover inserções Transwell do interior para as linhas exteriores da placa, sem tocar na membrana de inserção. As células devem ser subcultivadas apenas em poços sobre as linhas exteriores da placa. Para evitar a introdução de bolhas de ar nos compartimentos basolateral, adicionar 600 uL de EMEM a 10%, para cada uma a dobrar a pipeta contra a parede de cada compartimento e, lentamente, libertar o suporte para dentro do poço.
3. Separar as células T a partir de 75 cm ² de tecido. Subcufrascos LTURE utilizando tripsina aquecido, e lavar com 30 ml de EMEM-20% + S por cada 2 frascos de células tripsinizadas, tal como descrito no passo 1.2.
4. Completamente ressuspender as células lavadas em 5 ml de EMEM a 10%, com cuidado pipetando para cima e para baixo.
5. Determinar a contagem de células viáveis ​​e total pelo método de exclusão de azul de tripano. Prossiga apenas se a 80% - 90% são viáveis.
6. Num tubo de 50 ml estéril cónico, diluir as células a uma concentração de 2 x 10 ⁶ células viáveis ​​/ ml, com EMEM-10%.
7. Adicionar células para o compartimento apical de cada Transwell. Para poços A1 e D1, o qual será poços de controlo isentos de células, isto é, espaços em branco, adicionar 100 uL de EMEM a 10%, sem células. Para cada uma das cavidades restantes, adicionar 100 ul de ressuspensos Calu-3 células, gentilmente dobrando a pipeta contra o canal de guia interior da parede da inserção e, lentamente, libertando as células. Não toque a pipeta para a membrana de inserção. Para manter uma suspensão homogénea de células Calu-3, agite suavemente a suspensão de célulasdurante este passo de semeadura.
8. Incubar a placa Transwell a 37 ° C e 7% CO ₂ em ar atmosférico. Coloque a placa em uma incubadora onde perturbação física será mínimo. Para melhorar a eficiência de polarização, não se acumulam chapas em cima uns dos outros.
9. Para manter as culturas até polarizado e pronto para uso em experimentos, substituir completamente no meio transwells, como descrito nos passos a 2,10 2,13 a seguir. Meio deve ser completamente substituído três dias depois de ter sido subcultivados em transwells, e, em seguida, em um ciclo alternado entre o quarto dia e, em seguida, após a terceira alimentação anterior, até que as células são totalmente polarizado.
10. Quente EMEM-10% em um banho de água a 37 ° C.
11. Aspirar cuidadosamente meio de inserções Transwell. Com uma pipeta capilar ligado a uma armadilha de vácuo com um vácuo suave, ou com um padrão de pipeta de 1 ml, o meio aspirado a partir de células livres de poços A1 e D1, em seguida, a partir de poços semeados, antes de remover o meio apical de todos os poços, e tgalinha de remover o meio basolateral de todos os poços. Não toque membranas inserção enquanto aspiração médio.
12. Adicionar 200 uL de EMEM a 10%, para o compartimento apical de células livres de poços A1 e D1, em seguida, aos poços semeados, dirigindo o meio no compartimento apical usando o lado da inserção para guiar a ponta da pipeta. Não adicione médio diretamente sobre as células, e não tocar a membrana de inserção.
13. Adicionar 600 uL de EMEM a 10%, para os compartimentos basolateral. Para evitar a introdução de bolhas de ar nos compartimentos basolateral, adicionar meio de cada um por dobrar a pipeta contra a parede de cada compartimento e, lentamente, libertar o suporte para dentro do poço.

3. Avaliação do Desenvolvimento da Resistência Calu-3 LCC

Medidas de segurança: Realizar todos os procedimentos em um armário de biossegurança utilizando a técnica de cultura estéril.

1. Trans-epitelial avaliar a resistência eléctrica (TEER) de Calu-3 LCC 30 min depoismudanças médio, a avaliação pode ser realizada após cada mudança de meio, se desejar. Realizar medições em condições estéreis. Comece medições com o controle livre de células poços A1 e D1 (os espaços em branco) para obter medidas de base, e continuar com as medidas para cada poço.
   1. Sob condições estéreis, transferir o eléctrodo STX2 para um tubo de centrífuga de 50 ml contendo 70% de etanol em água estéril, e esterilizar 15 min.
   2. Calibrar e testar o voltohmmeter para uso de acordo com as instruções do fabricante.
   3. Retire o eletrodo a partir do etanol, o ar seco 5-10 segundos, e enxaguar o eletrodo com% EMEM-10 estéril.
   4. Defina o modo do voltohmmeter para a definição de resistência, e ligar o rádio.
   5. Coloque suavemente o eléctrodo numa das três portas que permitem o acesso ao compartimento basolateral de uma cultura Transwell. Eléctrodo lugar de modo que o fio mais apenas tocar levemente na parte inferior do poço e exterior permanece vertical,e o mais curto é no meio de cultura de tecido do compartimento apical, sem tocar na membrana de inserção.
   6. Push "Medida R" botão, e aguarde a leitura estabilize. Repetir para as outras duas portas de cada poço e registar as medições de todos os três portas, para um total de três medições por poço. Continuar a medir a resistência de todos os poços de células.
   7. Limpar o eléctrodo por imersão 5-10 min em etanol a 70%, enxaguando em _dH2O estéril, e secagem cuidadosamente. Conservar na embalagem original.
   8. Calcula-se a resistência de cada poço, usando a Equação 1.
      Ω = Ω _{amostra real} - Equação Ω _{em branco,} 1
      onde a _amostra Ω é a medição média de um poço e semeado _{em branco} Ω é a medição média da 2 poços, A1 e D1, contendo inserções e médios, mas sem células.
   9. Calcular a resistência por unidade de área, utilizando Equação 2.
      Ω _real × área efectiva de membrana Equação = Ω × cm ^{2, 2}
      em que a área efectiva da membrana é de 0,33 cm ² para inserções Transwell de 24 cavidades.
2. Verificar que a polarização é completa através da realização de um ensaio secundário, medindo a difusão passiva de fluoresceína de sódio entre os compartimentos apical e basolateral, em 1-3 culturas Transwell. Os poços utilizados para o ensaio de fluoresceína de sódio deverá ser descartado imediatamente após a conclusão do ensaio.
   1. Preparar tampão não fluorescente (118 mM NaCl; 4,75 mM KCl, 2,53 mM de CaCl ₂ .2 H ₂ O; 2,44 mM MgSO _4, 1,19 mM KH ₂ PO _4, 25 mM _de NaHCO3 em água estéril; filtro estéril com 0,45 uM dispositivo de filtração ). Prepare fluoresceína de sódio a 1 mg / ml em tampão não fluorescente, o filtro esterilizado, envoltório em folha de alumínio, e armazenar a 4 ° C, protegidos da luz. Quente para o quarto de temperature antes da utilização.
   2. Depois de completar as medições de resistência, remova cuidadosamente médio de ambos os compartimentos basolateral e apical de um a três culturas individuais Transwell.
   3. Lavar culturas Transwell. Suavemente adicionar 600 ul à temperatura ambiente estéril PBS Dulbecco (D-PBS) para os compartimentos basolateral e 100 uL à temperatura ambiente estéril D-PBS para os compartimentos apicais.
   4. Remova cuidadosamente D-PBS dos poços. Adicionar 600 ul de tampão não fluorescente estéril para os compartimentos basolateral. Adicionam-se 100 ul de uma estéril de fluoresceina de sódio mg / ml para os compartimentos apicais.
   5. Incubar a placa a 37 ° C durante 1 h. CO ₂ não é necessário durante a incubação.
   6. Durante a incubação, preparar uma curva padrão de fluoresceína de sódio que varia entre 20 ng / ml e 0 ng / mL, utilizando tampão não fluorescente para diluir fluoresceína de sódio. Preparar pelo menos 8 concentrações diferentes de fluoresceína de sódio, cada um em um volume final de, pelo menos, 600 ul. Manterdiluições da curva padrão protegido da luz até que esteja pronto para medir a absorbância.
   7. Transfira a amostra tampão não fluorescente a partir do compartimento basolateral de cada Transwell de teste para um tubo limpo separado para análise. Remover o teste transwells usado para examinar a difusão passiva de fluoresceína de sódio a partir da placa e descartar. Regressar a placa com transwells restantes para a incubadora.
   8. Coloque 100 ul de cada solução padrão em triplicado numa placa de 96 poços de fundo plano.
   9. Preparar três diluições de cada amostra basolateral (1:2, 1:20, e 1:50) em tampão não fluorescente, e adicionar 100 uL de cada amostra não diluída e de cada uma das diluições, em duplicado, para um de 96 poços plana placa de fundo.
   10. Absorvância medida da amostra num leitor de placas de ELISA a 486 nm ou 490 nm.
   11. Determinar a concentração de fluoresceina de sódio no compartimento basolateral através da comparação da absorvância das amostras contra os valores de absorvância para a fluoresceína sódica standard curva.

4. Infectando Polarized Calu-3 LCC com Vírus Respiratório

Medidas de Segurança: executar todos os procedimentos descritos em uma cabine de segurança biológica utilizando a técnica de cultura estéril, a um nível apropriado de segurança biológica para o vírus a ser utilizado.

1. Diluir vírus em EMEM livre de soro, de modo que seria desejado inóculos em 100 ul.
2. Lave as células em EMEM livre de soro. Aspirar cuidadosamente meio de todos os poços, o meio de remoção apical então o meio basolateral. Com uma pipeta capilar ligado a uma armadilha de vácuo com um vácuo suave, ou com um padrão de pipeta de 1 ml, o meio aspirado a partir de células livres de poços A1 e D1, em seguida, a partir de poços semeados, em primeiro lugar remoção do meio apical de todos os poços, e em seguida removendo o meio basolateral de todos os poços. Não toque membranas inserção enquanto aspiração médio.
   1. Adicionar 100 uL de EMEM livre de soro para o compartimento apical de células livres de poços A1 e D1, e depois a tele seeded poços, dirigindo meio no compartimento apical usando o lado da inserção para guiar a ponta da pipeta. Não adicione meio diretamente sobre as células, e não tocar a membrana de inserção.
   2. Adicionar 600 uL de EMEM livre de soro para os compartimentos basolateral. Adicionar meio de cada Transwell pela angulação da pipeta contra a parede do compartimento e, lentamente, libertar o suporte para dentro do poço.
   3. Aspirar cuidadosamente meio isento de soro dos poços.
3. Começando com os poços não infectadas ou falsamente infectadas, adicionar as diluições de vírus apropriadas para o compartimento apical do transwells. Para poços não infectados, adicionar 100 uL de EMEM livre de soro para o compartimento apical do transwells apropriados, por falsamente infectadas poços, adicionar 100 ul de vírus livre de preparação diluída em EMEM livre de soro para o compartimento apical do transwells adequadas, por infecção por vírus, vírus diluído em EMEM livre de soro e adicionar 100 ul para os compartimentos apicais de transwells apropriados.
4. Adicionar 600 uL de EMEM livre de soro de todos os compartimentos basolateral.
5. Incubar a 37 ° C e 7% CO _2, durante 2 horas.
6. Aspirar meio de poços, em primeiro lugar a partir de poços não infectados e falsamente infectadas, em seguida, a partir de poços infectados. Remover sobrenadantes apicais primeiro lugar, seguido por sobrenadantes basolateral.
7. Substituir meio com 200 uL de EMEM a 10%, nos compartimentos apicais e 600 uL de EMEM a 10%, nos compartimentos basolateral.

Resultados

Quando cultivados como líquido cobertas culturas (LCC), em sistemas de cultura Transwell, tal como ilustrado na Figura 1, as células Calu-3, polarizam desenvolvimento distintas superfícies apical e basolateral. Seguindo o método descrito aqui, a resistência eléctrica trans-epitelial (TEER) de Calu-3 LCC atinge um patamar igual ou superior a 1.000 Ω × cm ² a 3 semanas depois da sementeira, a exemplo do que é mostrado na Figura 2. As junções formadas entre as células polarizadas prevenir equilíbrio passivo de pequenas moléculas entre os compartimentos apical e basolateral. Assim, uma modificação do ensaio de equilíbrio de sódio fluoresceína é utilizada para confirmar a polarização de Calu-3 LCC ^15,17,18. À medida que o TEER de monocamadas de células Calu-3 em aumentos de LCC, a quantidade de fluoresceína que equilibra passivamente no compartimento basolateral diminui. Uma vez que o TEER é 1000 × Ω cm ^2, a quantidade de fluoresceína, que se equilibra, empara o compartimento basolateral é ≤ 1%, como mostrado na Figura 3 e, portanto, Calu-3 LCC são consideradas totalmente polarizado quando o TEER é ≥ 1,000 Ω × ² cm. A medição do pico de TEER Calu-3 LCC podem variar de experiência para experiência. No entanto, uma vez que os valores TEER plateau para qualquer dada experiência, um totalmente polarizado, uninfected Calu-3 LCC pode ser estável durante 5 a 12 semanas após a semeadura. A ausência de desenvolvimento de resistência em Transwell-cultivadas Calu-3 pode ser causada por diversos factores como descritas na Tabela 1. Uma vez que o TEER de Calu-3 planaltos LCC em ou acima de 1000 × Ω cm ^2, o modelo está pronto para ser usado para examinar As respostas das células epiteliais das vias aéreas a agentes patogénicos respiratórios, incluindo o vírus sincicial respiratório (RSV). A exposição a resultados de RSV em um declínio mais rápido na integridade cultura polarizada em comparação com uma infecção simulada, de células (Figura 4).

Figura 1. Células secção transversal da representação Transwell-cultura de células. São cultivadas na superfície da membrana apical de inserção.

Figura 2. Desenvolvimento de trans-epitelial de resistência eléctrica (TEER) e polarização de células Calu-3 após a semeadura em inserções Transwell. Em cada ponto de tempo, TEER é apresentada como mediana Ω x cm ² ± SEM de 32 poços independentes de uma experiência representativa.

Figura 3. Passiva equi bração de fluoresceína de sódio no compartimento basolateral de monocamadas de células Calu-3 é inibida como as células tornam-se polarizada. dados acumulados de quatro experiências independentes são apresentados. Cada ponto de dados representa uma medição individual.

Figura 4. RSV infecção de polarização Calu-3 LCC acelera um declínio na integridade monocamada. Polarizados Calu-3 células foram infectadas com RSV-A2 a uma MOI = 1, no dia 0, e a polaridade foi monitorizada durante 8 semanas após a infecção. Um experimento representativo é mostrado. Os dados são apresentados como média resistência de 8 poços independentes por infecção ± SEM por ponto de tempo. * P <0,05 entre as culturas falsamente e RSV-A2 infectados, como determinado pelo teste t de Student.

maneiras "> Questão Resolução (s) A resistência não é mensurável

• Remova todas as bolhas de ar nos poços
• Use Calu-3 células que foram subcultivadas a partir de estoque congelada a menos de 10 vezes
• Não permitir que as células Calu-3 para atingir 100% de confluência em subcultura monocamada
• Verificar que as células não estão em crescimento sobre o plástico bem abaixo do elemento de inserção (o que indica que as células podem ter crescido através dos poros da pastilha)
• Permitir 2-3 semanas pós-sementeira para o desenvolvimento de resistência plena
• Verifique a composição e tamanho de poro de pastilhas usadas, se necessário, alterar (insert poliéster recomendada, 0,3 ^ M de tamanho de poro, sem revestimentos, ver materiais para detalhes)
• Verificar a qualidade do eléctrodo, lixar suavemente para remover proteínas acumuladas a partir da ponta, e substituindo, se necessário
• Verifique meio para o crescimento de bactérias

Resistência desenvolve, mas polarização plena (≥ 1,000 Ω × cm ²⁾ não é alcançada

• Permitir tempo adicional para a polarização de desenvolver (ocasionalmente pode levar até 4 semanas)
• Use Calu-3 células que foram subcultivadas a partir de estoque congelada a menos de 10 vezes
• Não permitir que as células Calu-3 para atingir 100% de confluência em subcultura monocamada
• Consistentemente substituir médio em culturas Transwell, alternando entre o terceiro dia e depois quarto após a alimentação anterior
• Apenas as células de cultura de inserções que são colocados nas linhas exteriores das placas
• Use muito diferente de inserções Transwell

Células totalmente polarizar, mas a resistência não é consistente de uma leitura para a próxima

• Não perturbar ou empilhar placas na incubadora
• Não causam vibrações na cabine de segurança biológica, enquanto Transwell plates estão sendo manipulados
• Remova todas as bolhas de ar nos poços
• Não perturbe a camada de células com ponteiras ao mudar de mídia ou realizar leituras Teer
• Usar 200 ul de meio no compartimento apical; menor volume pode resultar em leituras instáveis ​​TEER
• Verifique a qualidade do eletrodo, lixar suavemente para remover proteínas acumulados a partir da ponta, e se necessário, substituir

Tabela 1. Resolução de problemas problemas que podem surgir quando a cultura de Calu-3 células de transwells. Vários fatores contribuem para a polarização cheio de Calu-3 células em líquido cobertas de culturas, o mais provável de que são destaque na tabela.

Discussão

Ao estabelecer Calu-3 LCC em inserções Transwell, as células não podem polarizar de todo, ou não pode polarizar completamente, tal como definido por um TEER ≥ 1,000 Ω × ² cm e ≤ sódio a 1% de corante de fluoresceína de equilíbrio entre os compartimentos apical e basolateral. Além disso, Calu-3 células de LCC pode totalmente polarizar, mas TEER podem ser inconsistentes entre as medidas. Apesar de flutuações nas medidas de Teer Calu-3 LCC são normais do dia a dia, uma vez totalmente polarizados, oscilações dramáticas na TEER não se espera até a cultura naturalmente diminui com a idade, o que pode ser tão pouco como cinco semanas ou enquanto 12 semanas após a semeadura.

A capacidade de Calu-3 LCC para polarizar depende em parte da forma como as células são mantidas e subcultivados antes da sua utilização no sistema Transwell. As células que cresceram para além de 90% de confluência como uma monocamada durante a repicagem, que foram subcultivadas mais de 10 vezes do stock congelado, ou que não sejaen fornecido com meio fresco em uma programação regular são menos propensos a polarizar completamente, e qualquer polarização provavelmente diminuirá rapidamente. Falta incompleta ou total de polarização pode também ser atribuída à variação no material e tamanho de poro de transwells utilizados para Calu-3 LCC, e de lote para lote, em transwells variação de composição semelhante e de tamanho de poro pode também afectar a polarização. Tamanhos maiores de poro pode permitir Calu-3 a crescer através da membrana Transwell no compartimento basolateral, impedindo a cultura a partir de polarização. Uma ausência de polarização pode também ser devido ao crescimento bacteriano, indicado por meio de cultura turva, o que leva à destruição subsequente das junções apertadas entre as células Calu-3.

Medições TEER variáveis ​​de Calu-3 LCC pode ser causada por perturbações mecânicas dos Calu-3 monocamadas de células LCC, as inserções, ou as placas propriamente ditas. Mudanças de médio e medições Teer deve ser realizada sem ponteiras ou electroleva de tocar nas células. Durante a realização destas operações, deve ser tomado cuidado para evitar a introdução de bolhas de ar nos compartimentos apical e basolateral, que perturbam a capacidade do voltohmmeter para detectar a resistência. A capacidade do voltohmmeter para detectar a resistência de uma cultura que é, na verdade, polarizada pode também limitada pela acumulação de proteínas sobre as pontas dos eléctrodos. Esta acumulação-podem ser removidos com lixa suave, ou pode ser corrigido através da substituição do eléctrodo.

Uma vez Calu-3 LCC completamente polarizar o TEER e já não está a aumentar, Calu-3 LCC está pronto para ser utilizado como um modelo in vitro para caracterizar as respostas das células hospedeiras pulmonares epiteliais de infecção respiratória. Este sistema permite uma melhor caracterização das respostas de direcção, para agentes patogénicos em comparação com monocamada de cultura de linhas celulares de pulmão, tradicionalmente usados ​​para estudar agentes patogénicos respiratórios, tais como A549 e células HEp-2, com as vantagens adicionais de Calu-3 LCC being mais rápido para desenvolver, mais fácil de obter, e menos dispendioso para gerar de primário, NHBE, polarizada diferenciada. Semelhante a NHBE, polarizada Calu-3 demonstram a formação da junção apertado, e produzir mucinas. No entanto, ao contrário NHBE, polarizados Calu-3 células não se diferenciam em camadas de células basais e células ciliadas epiteliais colunares, e poucos polarizadas Calu-3 células se desenvolvem cílios-como projeções ^19. Assim, apesar de serem úteis para o exame respostas polarizadas de células epiteliais das vias aéreas respiratórias a insulto, polarizado Calu-3 LCC não é um modelo ideal para examinar o desenvolvimento das vias aéreas ou de remodelação em resposta ao insulto ou ferimento respiratório. A produção de muco pelas células em cultura in vitro podem ter impacto infectividade celular, bem como a libertação de vírus infeccioso e propagação do vírus em um modelo de polarização, e uma comparação directa da produção de muco polarizada entre Calu-3 LCC e NHBE, polarizada diferenciada não foi relatada . A549 e células HEp-2 are mais fácil do que a cultura de células Calu-3, no entanto, ao contrário de Calu-3 LCC, elas não formam as culturas polarizadas, quando cultivada em inserções Transwell, e, portanto, não são modelos ideais para a análise in vitro das respostas das células epiteliais polarizadas a infecção por vírus respiratório .

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
			REAGENTES
Calu-3	ATCC	HTB-55
Tripsina a 0,05% - 0,02% de EDTA	Gibco / Invitrogen	25300
Meio Essencial Mínimo de Eagle (EMEM)	Gibco / Invitrogen	07-00100DK
De soro fetal bovino (FBS)	HyClone	SH30070.03	Heat-inactivam, 56 ° C, 30 min
Não-aminoácidos essenciais 100X (10 mM)	Gibco / Invitrogen	11140	Armazenar a 4 ° C no escuro
L-glutamina	Gibco / Invitrogen	25030
HEPES	Gibco / Invitrogen	15630
FBS a 10%-EMEM (EMEM-10%)			Suplemento EMEM com FBS inactivado pelo calor a 10% de soro, esterilizada por filtro
EMEM-FBS a 20% + suplementos (% EMEM + S-20)			Suplemento EMEM para concentrações finais: FBS inactivado pelo calor, a 20%; 1X aminoácidos, 2 mM de L-glutamina, a 10 mM de HEPES; esterilizada por filtro
Placas de 24 poços Transwell	Corning Costar	3472	Tamanho de poro 3 uM de poliéster,
Trypan azul	Gibco / Invitrogen	15250
Etanol	Sigma	E7023	Prepare-se para 70% utilizando dH2O estéril
PBS de Dulbecco (D-PBS)	Invitrogen	14040
Não fluorescente tampão			118 mM NaCl;4,75 mM de KCl; 2,53 mM CaCl 2 × H 2 O; 2,44 mM MgSO 4, 1,19 mM KH 2 PO 4, 25 mM de NaHCO3 em água estéril; esterilizada por filtro
Fluoresceína	Sigma	6377	1 mg / ml em tampão não fluorescente estéril; esterilizada por filtro, proteger da luz; armazenar a 4 ° C até 6 meses
			EQUIPAMENTOS
Voltohmmeter	Instrumentos de Precisão mundo
STX2 eletrodo	Instrumentos de Precisão mundo
Leitor de placas ELISA			Capaz de medir um 486 ou um 490