Polarize İnsan Havayolu bir sıvı kaplı Kültürünün Oluşturulması Solunum Patojenler için Host Hücre Yanıtı Okumak Epitel Calu-3 Hücreler<em&gt; In vitro</em

Özet

Bu rapordaki bulgular ve sonuçlar yazarlara aittir ve Hastalık Kontrol ve Önleme Merkezleri görüşlerini temsil etmemektedir.

Özet

Havayolu epitel hücrelerinin apikal ve bazolateral yüzeyler in vivo patojen maruziyeti yönlü tepkiler göstermektedir. Böylece, apikal ve bazolateral yüzeyler oluşturarak, Polarize solunum patojenlere hücresel cevaplarının incelenmesi için in vitro modeller idealdir. Böyle bir modelin normal insan bronşiyal epitel hücreleri (NHBE) farklılaşıyor. Ancak, bu sistem izole akciğer doku örnekleri, uzmanlık ve doku kültürü epitel hücreleri, ve bir hava-sıvı arayüzü kültürü oluşturmak için zaman gerektirir.

Bir insan bronşiyal adenokarsinom türetilen Calu-3 hücreleri, solunum hakaret ^1, farmakolojik bileşikler ^2-6 proksimal hava yolu epitel hücrelerinin tepkisi inceleyerek ve bakteriyel ^7-9 ve viral patojenler, grip virüsü, rinovirüs dahil olmak için alternatif bir model olarak ve şiddetli akut solunum sendromu - ilişkili koronavirüs ^10-14. Son zamanlarda, wE Calu-3 hücreleri NHBE ^15,16 ile tutarlı bir şekilde solunum sinsityal virüs (RSV) enfeksiyona duyarlı olduğu gösterilmiştir. Burada, ayrıntılı büyüyen ve kültür Calu-3 hücreleri LCC içine kültüre oylandı hücreleri korumak teknik detayları üzerinde duruluyor Calu-3 hücre polarize, sıvı kaplı kültürü (LCC), kurulması ve biz sunuyoruz polarize Calu-3 hücrelerinin solunum virüsü enfeksiyonu gerçekleştirmek için yöntem.

Sürekli polarize Calu-3 LCC, Calu-3 hücreleri dikkatli Transwell ekler kültürleme önce pasajlandı yapmalısınız edinin. Hazır Calu-3 tek tabaka kültürleri,% 90 izdiham altında kalmalı dondurulmuş stok az 10 kez pasajlandı edilmeli ve düzenli olarak taze ortam ile sağlanmalıdır. Bir kez Transwells kültüre, Calu-3 LCC dikkatle ele alınması gerekir. Düzensiz ortam değişiklikleri ve hücre katmanları veya levhaların mekanik veya fiziksel bozulma olumsuz için polarizasyon etkisibirkaç saat veya gün. Polarizasyon trans-epitelyal elektriksel direnç (Teer) değerlendirilerek izlenir ve apikal ve bazolateral bölmeleri ^17,18 arasında sodyum fluoresein pasif dengeleme değerlendirerek doğrulanır. Ω × cm ² veya 1,000 Yukarıdaki kez Teer yaylaları, Calu-3 LCC solunum patojenlere hücresel yanıtları incelemek için kullanıma hazırdır.

Protokol

1. Transwell Kültürleri Kullanım için Kültürleme Calu-3 Hücreler

Güvenlik Önlemleri: steril kültür tekniği kullanarak bir biyogüvenlik kabini tüm prosedürleri gerçekleştirin.

1. Donmuş depolama hücreleri çözülme için:
   1. % 20 ısı ile inaktive edilmiş fetal bovin serumu (FBS), 0.1 mM temel olmayan amino asitler, 2 mM L-glutamin, and10 mM HEPES pH 7.4 (EMEM-% 20 + S) içeren Minimum Essential Eagle Medium hazırlayın. 37 ile steril filtre hazırlanmış bir 0.2 um gözenek boyutlu bir filtre kullanılmak üzere, orta, ve bir su banyosu içinde sıcak ° C. In situ havayolu epitel ortam içinde daha fazla yansıtıcı olmak için, antibiyotikler veya antimiyotikler orta ile desteklenmiş değildir.
   2. Bir 37 ° C su banyosu içinde hızla Calu-3 hücreleri (<1 dk), bir donmuş cryovial çözülme.
   3. 50 ml'lik steril konik tüpe çözülmüş hücreleri aktarın ve ısıtılmış EMEM +% 20-S, 30 ml eklemek
   4. 1,000-1,200 az 5 dakika süreyle santrifüj yoluyla topak hücrelere x g,soğutma olmadan ve düşük fren hızı ile.
   5. Nazikçe süpernatant süzün ve yavaşça aşağı yukarı ve pipetleme ile ısıtılmış EMEM +% 20-S, 5 ml içinde tekrar süspansiyon hücreleri. Tohum 2 ila 5 × 10 37 6-iyi doku kültürü plaka ve inkübe içine kuyu başına ⁶ hücre ° C, hücreler% 75 kadar hava atmosferinde% 7 CO ₂ - 80% konfluent. Günlük olarak kontrol edin; 7 güne kadar gerekli olabilir. Her 3-4 günde hücrelerin medyumuyla aspire ve taze EMEM-% 20 + S. ile değiştirin
2. : Altkültür hücreleri için
   1. Sıcak% 0.05 tripsin - 37 ° C su banyosunda% 0.02 EDTA. Fazla orta ve serum çıkarmak için% 0.02 EDTA - hücrelerin medyumuyla aspire ısıtılmış ve% 0.05 tripsin ile bir kere yıkayın hücrelerini. Yıkama çıkarın ve hücreler tripsin ısıtıldı kuyu başına 1 ml ekleyin.
   2. 37 ° C'de inkübe edin ve bir mikroskop altında% 7 _CO2 ve monitör hücrelerin en azından% 75 doku kültür plakasının da (lar) dan ayırmak kadar her 5 dak. Bu olabilir5 ila 30 dakika sürer.
   3. Aşırı tripsin kaldırmak EMEM-% 20 + S hücreleri yıkayın. 50 ml'lik steril konik tüpe hücreler tripsinize aktarın. Bir 6-kültür plakasının bir hücre Çoklu kuyular ve bir steril 50 ml konik bir tüp içine toplanmış olabilir. Soğutma olmaksızın 1,000-1,200 santrifüje edilerek EMEM-% 20 + S ve pelet hücreler 30 ml x g, ekleme, ve düşük fren hızı ile.
   4. Yavaşça süpernatant Durusu ve hafifçe aşağı yukarı pipetleme ve taze olarak EMEM-% 20 + S hücreleri tekrar süspansiyon haline getirin. 80% birleşik - onlar 75 arasında olduğunda 1.2.7 adımlarda 1.2.5 açıklandığı gibi doku kültür kaplarına altkültür hücrelere devam hücreleri Trypsinize için yukarıda 1.2.3 adımları 1.2.1.
   5. Yukarı 6-kuyulu plakanın iyi bir ikinci EMEM +% 20-S, 5 ml'lik bir nihai hacim içinde bir T-25 ^cm2 şişeye Alt kültür, 0.5 ila 1 x 10 ⁶ hücre / şişeye arasında tohumlama.
   6. 5 ml kullanarak hücreleri, altkültür ayırmak için T-25 cm ² balon başına tripsin ısındıbir T-25 ^cm2 şişeye yukarı bir ila EMEM +% 20-S, 10 ml'lik bir nihai hacim içinde T-75 ^cm2 şişeye, tohum 5-1 arasında x 10 ⁶ hücre / flask.
   7. 8 ml Kullanımı 2 T-75 cm ² şişeler içine bir T-75 cm ² balon hücreleri, altkültür ayırmak için T-75 cm ² balon başına tripsin ısındı. 3 yeni şişeler: Optimum hücre büyümesi için, alt kültür hücreleri 1 ebeveyn şişeyi daha büyük bir oranda T-75 cm ² veya altkültür daha büyük ölçülü balona yok.
3. Sonra hücreler ekilerek oylandı, tamamen kaldırmak ve% 75-90 izdiham ulaşıncaya kadar her 2 ila 3 gün orta değiştirin. Hücreler% 75-90 izdiham ulaşmak için 3 hafta kadar sürebilir. Polarize kültürler, alt kültür hücreleri bir tek tabaka olarak% 90 izdiham ötesinde büyümeye öncesi optimal kuşak için.
4. Hücreleri yeterince tohum Transwell ekler istenilen sayıda büyüdü kadar altkültür hücreleri devam edin. Her Transwell insert 2 × 10 ⁵ hücre gerektirir. Optimum performans polarize kültürler üretebilmek için, en fazla 10 altkültürler uğramıştır hücreleri kullanır.

2. Büyüyen Polarize Calu-3 Sıvı kaplı Kültürleri (LCC)

Güvenlik Önlemleri: steril kültür tekniği kullanarak bir biyogüvenlik kabini tüm prosedürleri gerçekleştirin.

1. 37 EMEM bir su banyosu içinde% 10 FBS (EMEM-% 10) ihtiva eden ve sıcak hazırlanması ° C.
2. Tohumlama için 24-kuyu Transwell plaka hazırlayın. Steril forseps kullanarak, insert membran dokunmadan iç kısmından plakasının dış satırlara Transwell ekler taşıyın. Hücreler sadece plakanın dış satırlar üzerinde kuyu içine ekilerek olmalıdır. Bazolateral bölme içine hava kabarcıklarının girişini önlemek için, her bir bölme duvarına karşı pipet olta ve yavaş yavaş kuyuya orta serbest bırakarak, her biri için EMEM-% 10, 600 ul ilave edin.
3. T-75 cm ² doku hücreleri ayırın. SubcuLTURE şişeler ısıtıldı tripsin kullanılarak, ve-EMEM +% 20, adım 1.2 'de tanımlanan tripsinize hücreleri, her 2 şişeler başına S, 30 ml ile yıkanır.
4. İyice hafifçe aşağı yukarı ve pipetleme ile EMEM-% 10, 5 mL içinde yıkanmış hücrelerin tekrar süspansiyon.
5. Tripan mavi dışlama yöntemi ile uygulanabilir ve total hücre sayısı belirleyin. Yalnızca% 80 devam - 90% yaşayabilir.
6. 50 ml'lik steril bir konik boru, 2'lik bir konsantrasyonda x EMEM-% 10 ile 10 ⁶ canlı hücre / ml 'ye sulandırın hücre.
7. Her Transwell ve apikal bölmeye hücreleri ekleyin. , Boşlukları, hücreleri olmadan EMEM-10% 100 ul ekleyin hücre içermeyen kontrol kuyuları, olacak kuyu A1 ve D1, için. Kalan kuyularının her biri için hafifçe uç duvarın iç kılavuz kanal karşı pipet olta ve yavaş yavaş salan hücreler, yeniden süspanse Calu-3 hücreler 100 ul ilave edin. Insert membrana pipet dokunmayın. Calu-3 hücrelerinin, homojen bir süspansiyon sağlamak için hafifçe ajite hücre süspansiyonuBu tohum çekilebilir.
8. 37 ° C ve% 7 hava atmosferde CO ₂ de inkübe Transwell plakası. Fiziksel rahatsızlık minimal olacaktır küvözde plakayı. Polarizasyon verimliliğini artırmak için, birbirlerinin üstüne tabak yığmayın.
9. Polarize ve tamamen, deneylerinde kullanıma hazır olarak aşağıda 2.13 adımlarda 2.10 açıklandığı Transwells orta yerine kadar kültürleri korumak. Hücreleri tamamen polarize kadar Orta tamamen, önceki beslendikten sonra dördüncü ve sonra üçüncü gün arasında değişen bir döngü daha sonra üç gün Transwells içine ekilerek sonra değiştirilir, ve olmalıdır.
10. Sıcak EMEM-10 37 ile bir su banyosu içinde% ° C.
11. Yavaşça Transwell ekler orta aspire. Bir hafif vakumlu bir vakum tuzak bağlı bir kılcal pipet ile, ya da bir standart 1 ml birinci her kuyudan apikal orta kaldırma sonra pipet, hücre içermeyen kuyu A1 ve D1 aspirat orta taneli kuyulardan, ve ttavuk bütün kuyulardan bazolateral orta çıkarmadan. Orta aspire ederken insert membranlar dokunmayın.
12. Pipet ucu kılavuz ucun yan kullanarak apikal bölmeye yönlendiren ortamı, daha sonra tohumlu kuyulara, hücre içermeyen kuyu A1 ve D1 apikal bölmeye EMEM-10% 200 ul ekle. Doğrudan hücreleri üzerine orta katmayın ve ekleme membran dokunmayın.
13. Bazolateral bölmelere EMEM-% 10, 600 ul ekle. Bazolateral bölmeleri içine hava kabarcıkları girmesini önlemek için, her bölmenin duvara karşı pipet olta ve yavaş yavaş kuyunun içine orta bırakarak her biri orta ekleyin.

3. Calu-3 LCC Direnç Gelişimi Değerlendirilmesi

Güvenlik Önlemleri: steril kültür tekniği kullanarak bir biyogüvenlik kabini tüm prosedürleri gerçekleştirin.

1. Trans-epitelyal elektrik Calu-3 direnci (Teer) sonra LCC 30 dk Değerlendirinorta değişiklikler; eğer istenirse değerlendirme her bir ortam değişikliği yapılabilir. Steril koşullar altında ölçüm yapın. Bazal ölçümler elde etmek için hücre içermeyen kontrol kuyuları A1 ve D1 (boşluklar) ile ölçümler başlayın ve her iyi için ölçümler ile devam edin.
   1. Steril koşullar altında, steril su içinde% 70 etanol ihtiva eden 50 ml'lik bir santrifüj tüpüne STX2 elektrot aktarmak ve 15 dakika sterilize edin.
   2. Kalibre ve üreticinin talimatlarına göre kullanıma voltohmmeter sınayın.
   3. Etanol, hava kurusu 5-10 sn elektrot çıkarın ve steril EMEM-% 10 ile elektrot durulayın.
   4. DİRENÇ ayara voltohmmeter şekli anahtarını ayarlayın ve gücü AÇIK konuma getirin.
   5. Bezin bir Transwell kültür bazolateral bölmesine erişim sağlayan 3 girişlerinden birine elektrot yerleştirin. Sıra elektrot yüzden artık kurşun yavaþca, dış kuyunun dibine dokunur ve dikey kalmasınıve kısa kurşun uç zar dokunmadan, apikal bölmesinin doku kültür ortamı içinde.
   6. "Tedbir R" düğmesine basın ve stabilize etmek için okuma için bekleyin. Her kuyucuk için diğer 2 bağlantı noktaları için tekrarlayın ve her üç limanlarından, kuyu başına üç ölçümün toplam ölçümleri kaydetmek. Hücrelerin bütün kuyuları için direncini ölçmek için devam edin.
   7. ,% 70 etanol içinde 5-10 dk iliklerine steril dH ₂ O, durulama ve iyice kurutulması ile elektrot temizleyin. Orijinal ambalajında ​​saklayın.
   8. Eşitlik 1 kullanılarak, her bir kuyunun dayanıklılığını hesaplayın.
      Ω _fiili = Ω _örnek - Ω _boş, Denklem 1
      Ω _numune seribaşı iyi ve Ω _boş gelen ortalama ölçüm nerede ekler ve orta içeren 2 kuyu, A1 ve D1 ortalama ölçüm, ancak hiçbir hücredir.
   9. Denklemleri kullanılarak, birim alan direnç hesaplamation 2.
      Ω _gerçek × efektif membran alanı = Ω × cm ^2, Denklem 2
      efektif membran alanı 24-kuyu Transwell uçlar için 0.33 cm ² olduğu.
2. Bu kutuplaşma esasına 02:59 Transwell kültürleri, apikal ve bazolateral bölmeleri arasında pasif sodyum fluorescein difüzyon ölçümü, ikinci bir tahlil yaparak tamamlandıktan doğrulayın. Sodyum fluoresein testi için kullanılan kuyu hemen tahlil tamamlanmasından sonra atılmalıdır.
   1. 4.75 mM KCl;; 2.53 mM CaCl ₂ .2 H ₂ O; 2.44 mM _MgSO4; 1.19 mM KH ₂ PO _4, 25 mM steril su içinde NaHCO _3; 0.45 mikron filtrasyon cihazı ile steril filtre (118 mM NaCl floresan olmayan tampon hazırlayın ). 4 ışıktan korunmalıdır ° C'de floresan olmayan tampon, steril filtre, alüminyum folyo ile sarın, ve mağaza içinde 1 mg / ml sodyum fluorescein hazırlayın. Oda sıcaklıkları için SıcakKullanmadan önce yeniden.
   2. Direnç ölçümleri tamamladıktan sonra, dikkatlice 02:59 bireysel Transwell kültürlerin bazolateral ve apikal bölümlerinde hem orta kaldırmak.
   3. Transwell kültürleri durulayın. Yavaşça apikal bölmelere bazolateral bölmeleri ve 100 ul oda sıcaklığında steril D-PBS 600 ul oda sıcaklığında steril Dulbecco PBS (D-PBS) ekleyin.
   4. Yavaşça kuyulardan D-PBS çıkarın. Bazolateral bölmelere 600 ul steril floresan olmayan tampon ekleyin. Apikal bölmelere 100 ul steril 1 mg / ml sodyum fluoresein ekleyin.
   5. 1 saat boyunca 37 ° C'de inkübe plaka. _CO2 kuluçka sırasında bu gerekli değildir.
   6. İnkübasyon sırasında, sodyum floresein sulandırmak için floresan olmayan tampon kullanılarak, 20 ug / ml ve 0 ug / ml arasında değişen bir sodyum fluoresein standart bir eğri hazırlanır. En az 600 ul nihai hacim içinde sodyum fluoresein, en az 8 farklı konsantrasyonda, her hazırlayın. TutmakStandart eğri dilüsyonları absorbans ölçmek için hazır olana kadar ışıktan korunmalıdır.
   7. Her bir test Transwell arasında bazolateral bölme Analiz için bir temiz tüpe floresan olmayan tampon numune aktarın. Plaka pasif sodyum fluorescein difüzyon incelemek ve atmak için kullanılan test Transwells çıkarın. Inkübatör kalan Transwells ile plaka dönün.
   8. 96 çukurlu bir düz tabanlı plaka içine üç kopya halinde her bir standart çözelti 100 ul koyun.
   9. Floresan olmayan tampon içinde her bir bazolateral numunenin üç dilüsyonları (1:2, 1:20 ve 1:50) hazırlanması, ve içine, iki kopya halinde her bir sulandırılmamış numune seyreltme ve her biri 100 ul ekle bir 96-gözlü düz alt plaka.
   10. 486 nm veya 490 nm dalga boyunda ELISA plaka okuyucu Tedbir numune absorbansı.
   11. Floresein st için sodyum absorbans değerleri karşı örneklerin absorbans karşılaştırarak bazolateral bölme içinde sodyum fluoresein konsantrasyonunun belirlenmesiandard eğrisi.

4. Solunum Virüs ile birlikte polarize Calu-3 LCC Infecting

Güvenlik Önlemleri: Virüs kullanılan uygun bir biyogüvenlik düzeyde steril kültür tekniği kullanarak bir biyogüvenlik kabini tüm prosedürleri gerçekleştirin.

1. İstediğiniz inokulum 100 ul olurdu böylece serumsuz EMEM virüs seyreltin.
2. Serumsuz EMEM hücreleri yıkayın. Yavaşça o bazolateral orta apikal orta kaldırarak, tüm kuyulardan orta aspire. Bir hafif vakumlu bir vakum tuzak bağlı bir kılcal pipet ile, ya da bir standart 1 ml pipet, hücre içermeyen kuyu A1 ve D1 aspirat orta, sonra ayrılmış kuyularda, her şeyden önce kuyusundan apikal orta kaldırma ve sonra kaldırma her kuyudan bazolateral ortamı. Orta aspire ederken insert membranlar dokunmayın.
   1. T sonra hücre içermeyen kuyuları A1 ve D1 apikal bölmeye serumsuz EMEM 100 ul ekleyin veO seribaşı kuyuları, pipet rehberlik etmek ucun tarafı kullanılarak apikal bölmeye orta yönetmenlik. Doğrudan hücreler üzerinde orta katmayın ve ekleme membran dokunmayın.
   2. Bazolateral bölmelere serumsuz EMEM 600 ul ekleyin. Bölmesinin duvara karşı pipet olta ve yavaş yavaş kuyunun içine orta bırakarak her Transwell orta ekleyin.
   3. Yavaşça kuyulardan serum orta aspire.
3. Bulaşmamış veya mock-enfekte kuyuları ile başlayarak, Transwells ve apikal bölmeye uygun olan virüs dilüsyon ekleyin. Bulaşmamış kuyuları, mock-enfekte kuyuları için, uygun Transwells ve apikal bölmeye serumsuz EMEM 100 ul ekleyin uygun Transwells arasında apikal bölmeye serumsuz EMEM seyreltilir virüssüz hazırlık 100 ul ekleyin ve için virüs enfeksiyonu, serum serbest EMEM virüs sulandırmak ve uygun Transwells ve apikal bölmelere 100 ul ekleyin.
4. Her bazolateral bölmelere serumsuz EMEM 600 ul ekle.
5. 37 ° C'de inkübe edin ve 2 saat boyunca% 7 _CO2.
6. Sonra enfekte kuyulardan, ilk bulaşmamış ve mock-enfekte kuyulardan, kuyulardan orta aspire. Bazolateral süpernatantlar ardından ilk apikal süpernatantlar, çıkarın.
7. Apikal bölmeleri ve bazolateral bölümlerinde EMEM-% 10 ve 600 ul içinde EMEM-% 10 ile 200 ul ortam değiştirin.

Sonuçlar

Şekil 1, farklı apikal ve bazolateral yüzeylerinin geliştirilmesi polarize Calu-3 hücreleri, gösterildiği gibi, Transwell kültür sistemleri içinde sıvı kaplı kültürler (LCC) olarak büyümüş zaman. Yöntem sonra burada açıklandığı gibi, Calu-3 LCC, trans-epitelyal elektrik rezistansı (Teer) tohumlama sonraki 3 hafta içinde Ω x cm ² ya da 1.000 'üzerinde bir plato, Şekil 2' de gösterildiği üzere bir örnek ulaşır. Polarize hücreleri arasında oluşan sıkı kavşaklar apikal ve bazolateral bölmeler arasındaki küçük moleküllerin pasif dengeleme engeller. Bu nedenle, bir değiştirilmiş sodyum fluoresein dengeleme tahlil Calu-3 LCC ^15,17,18 polarizasyon doğrulamak için kullanılır. LCC artar Calu-3 hücre mono tabakaları Teer olarak, pasif bazolateral bölmesine equilibrates floresan miktarı azalır. Teer 1.000 Ω cm x ^2, equilibrates floresan miktarı kezbazolateral bölmesine olarak Şekil 3'te gösterildiği gibi ≤% 1, bu nedenle, Calu-3 LCC Teer ≥ 1000 Ω cm x ² iken tam olarak polarize edilmiş olarak kabul edilir. Calu-3 LCC pik Teer ölçüm deneyden deneye değişebilir. Ancak, herhangi bir deney için bir kere Teer değerleri plato, tam polarize, enfekte olmamış Calu-3 LCC 12 hafta sonrası tohumlama ile 5 arasındaki için kararlı olabilirler. Transwell kültürlü Calu-3 direnç gelişme olmaması Tablo 1'de özetlendiği gibi çeşitli faktörler neden olabilir. Ω × cm ² veya 1,000 Yukarıda Calu-3 LCC platolar Teer, modeli incelemek için kullanılmaya hazır olduğunu bir kez respiratuvar sinsityal virüs (RSV) dahil solunum patojenlere hava yolu epitel hücre yanıtlarının. Hücrelerin bir mock-enfeksiyonu (Şekil 4) ile karşılaştırıldığında polarize kültür bütünlüğü içinde daha hızlı bir düşüş RSV sonuçları Poz.

Şekil 1. Transwell-kültür hücrelerinin kesiti temsil. Hücreleri ekleme membran apikal yüzeyinde yetiştirilmektedir.

Şekil 2. Trans-epitelyal elektriksel direnç (Teer) ve Transwell ekler tohumlama sonrası Calu-3 hücrelerinin polarizasyon Gelişimi. Her zaman noktasında, Teer ortanca Ω x cm ² olarak sunulan bir temsilci deneyden 32 bağımsız kuyuların ± SEM.

Şekil 3,. Pasif equili hücreleri gibi polarize olur Calu-3 hücre mono tabakaları bazolateral bölmesine sodyum fluoresein ration inhibe edilir. dört bağımsız deneyin kümülatif veri sunulmuştur. Her veri noktası tek bir ölçüm temsil eder.

Şekil 4. Polarize Calu-3 LCC RSV enfeksiyonu tek tabaka bütünlüğü bir düşüş hızlanır. Polarize Calu-3 hücreleri 0. gün bir İçişleri Bakanlığı = 1 RSV-A2 ile enfekte edildi ve polarite 8 hafta sonrası enfeksiyon yönünden takip edildi. Bir temsilci deneme gösterilir. Veri infeksiyon başına 8 bağımsız kuyuları ± SEM zaman noktası başına medyan direnç olarak sunulmaktadır. * P olarak Student t-testi ile tespit mock-ve RSV-A2-enfekte kültürler arasındaki <0.05.

yolları "> Konu Çözünürlük (ler) Direnç ölçülebilir değildir

• Kuyularda herhangi bir hava kabarcıklarını çıkarın
• Dondurulmuş stok daha az 10 kez pasajlandı oylandı Calu-3 hücreleri kullan
• Calu-3 hücre monolayer altkültür% 100 izdiham ulaşmasına izin vermeyin
• Hücreler (ucun gözenekler aracılığıyla büyümüş olabileceğini belirten) sıra insert altında plastik üzerinde büyüyen olmadığını kontrol edin
• Tam direnç gelişimi için 2-3 hafta sonrası tohumlama izin ver
• Değiştirmek, kullanılan ekler kompozisyon ve gözenek boyutu kontrol edin, gerekiyorsa (önerilen polyester insert, 0,3 mikron gözenek boyutu, hayır kaplamalar, ayrıntılar için malzemeler bakınız)
• Ucundan biriken proteinler kaldırmak için hafifçe zımpara ve gerekirse değiştirilmesi, elektrodun kalitesini kontrol edin
• Bakteriyel büyüme için orta kontrol

Direnç geliştirir, ama tam polarizasyon (≥ 1.000 Ω × cm ²⁾ elde edilememesi

• Geliştirmek için polarizasyon (bazen 4 hafta kadar sürebilir) için ek süre tanıyınız
• Dondurulmuş stok daha az 10 kez pasajlandı oylandı Calu-3 hücreleri kullan
• Calu-3 hücre monolayer altkültür% 100 izdiham ulaşmasına izin vermeyin
• Sürekli önceki beslendikten sonra ardından üçüncü ve dördüncü gün arasında değişen, Transwell kültürlerde orta yerine
• Plakaların dış sıra halinde yerleştirilen uçları üzerinde sadece kültür hücreleri
• Transwell ekler farklı bir sürü kullanın

Hücreler tamamen polarize, ancak direnç bir okuma diğerine tutarlı değil

• Bozabilir veya inkübatör plakaları yığmayın
• Biyogüvenlik kabininde titreşime sebep yok iken Transwell plates ele alındığını
• Kuyularda herhangi bir hava kabarcıklarını çıkarın
• Ortam değiştirme veya Teer okumaları yapan pipet uçları ile hücre tabakası rahatsız etmeyin
• Apikal bölmeye 200 ul ortamı kullanın; düşük ses dengesiz Teer okumalara neden olabilir
• , Elektrodun kalitesini kontrol ucundan biriken proteinler kaldırmak için hafifçe zımpara ve gerekirse değiştirin

Transwells içinde zaman kültür Calu-3 hücreleri oluşabilir Tablo 1. Sorun giderme sorunları. Çoklu faktörler sıvı kaplı kültürleri, bu tabloda ortaya koyan en muhtemel olarak Calu-3 hücreleri dolu kutuplaşmaya katkıda bulunur.

Tartışmalar

Transwell ekler Calu-3 LCC oluştururken, hücrelerin hiç kutuplaştırma olabilir, veya tam olarak polarize etmek değil, gibi bir Teer tarafından tanımlanan ≥ 1000 Ω x ² cm ve apikal ve bazolateral bölmeleri arasındaki ≤% 1 sodyum fluoresein boyası dengeleme. Buna ek olarak, LCC içinde Calu-3 hücreleri tam kutuplaştırma olabilir, fakat Teer ölçümler arasında tutarsız olabilir. Calu-3 LCC Teer ölçümlerinde dalgalanmalar, günlük normal olmasına rağmen kültür, doğal olarak az 5 hafta veya sürece 12 hafta olabilecek, yaşla birlikte azalır kadar Teer kez tamamen polarize, dramatik değişim beklenmemektedir tohumlama sonrası.

Polarize Calu-3 LCC yeteneği hücreler hazırlanmış ve Transwell sistem içinde kullanım öncesinde pasajlandı nasıl kısmen bağlıdır. Alt kültür sırasında bir tek tabaka olarak% 90 izdiham ötesinde büyüdü Hücreler, dondurulmuş stoktan fazla 10 kat ekilerek oylandı, ya da değil kidüzenli olarak taze besiyeri ile birlikte en tam kutuplaştırmaya az olasıdır, ve herhangi bir polarizasyon hızla düşecek. Polarizasyon Eksik veya toplam eksikliği de malzeme ve Calu-3 LCC için kullanılan Transwells gözenek boyutu varyasyon atfedilen olabilir, ve benzeri kompozisyon ve gözenek büyüklüğüne Transwells içinde sürü-için-çok varyasyon ayrıca polarizasyon etkileyebilir. Latacağız Calu-3 polarize gelen kültürü korumak, bazolateral bölmeye Transwell zarından büyümesine izin verebilirsiniz. Kutuplaşma olmayışı da bakteriyel büyüme nedeniyle olabilir, Calu-3 hücreleri arasındaki sıkı bağlantıları müteakip parçalanmasına yol bulutlu kültür ortamı ile gösterilir.

Calu-3 LCC değişken Teer ölçümleri Calu-3 LCC hücre mono tabakaları, insert, ya da levha kendileri mekanik kesintileri neden olabilir. Orta değişiklikler ve Teer ölçümleri pipet uçları veya elektro olmadan yapılmalıdırde hücrelerin temas yol açar. Bu işlemleri gerçekleştirirken, bakım direnci tespit voltohmmeter yeteneği bozacak apikal ve bazolateral bölmeleri, içine hava kabarcıkları tanıtmak önlemek için alınmalıdır. Aslında kutuplaşmış bir kültürde direniş tespit voltohmmeter yeteneği de elektrot kablolarında protein birikmesi ile sınırlı olabilir. Bu birikme nazik zımpara ile kaldırılabilir veya elektrot değiştirerek düzeltilebilir.

Bir kez Calu-3 LCC tamamen polarize ve Teer artık artmaktadır, Calu-3 LCC solunum yolu enfeksiyonuna konak akciğer epitel hücre yanıtlarını karakterize etmek için bir in vitro model olarak kullanılmak için hazır. Bu sistem Calu-3 LCC bei ek avantajlarıyla birlikte, geleneksel olarak bu tür A549 ve HEp-2 hücreleri gibi solunum patojenleri incelemek için kullanılan tek tabaka-kültürlü akciğer hücre hatları ile karşılaştırıldığında patojenlere yönlü tepkilerin iyi karekterinigeliştirmek için ng daha hızlı, daha kolay elde edilebilir ve primer, kutuplaşmış, farklılaştırılmış NHBE daha üretmek için daha az pahalı. NHBE benzer polarize Calu-3 sıkı kavşak oluşumu göstermek ve müsin üretirler. Ancak, NHBE aksine, polarize Calu-3 hücreleri bazal hücreler ve kirpikli kolumnar epitel hücrelerinin katmanlarına ayrım yoktur, ve birkaç polarize Calu-3 hücreleri kirpikler şeklinde çıkıntılar ¹⁹ gelişir. Solunum hakaret havayolu epitel hücrelerinin polarize tepkilerin test için yararlı rağmen Böylece, polarize Calu-3 LCC solunum hakaret veya yaralanmaya yanıt olarak hava yolu geliştirme veya yeniden incelemek için ideal bir model değil. In vitro olarak kültür hücreleri, mukus üretimini hücresel enfektivite yanı sıra, bir polarize modelinde bulaşıcı virüs yayılması ve virüs salınması ve polarize Calu-3 LCC ve polarize, farklılaşmış NHBE rapor edilmemiştir arasında mukus üretiminin doğrudan karşılaştırma etkileyebilir . A549 ve HEp-2 hücreleriCalu-3 hücreleri daha kültürüne kolay yeniden, ancak, Transwell ekler üzerinde büyüdüğü zaman Calu-3 LCC aksine, onlar polarize kültürleri kurmazlar, ve böylece ideal değil modelleri solunum virüs enfeksiyonu, in vitro polarize epitel hücrelerinin yanıtları inceleyerek içindir .

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
			REAKTİFLER
Calu-3	ATCC	HTB-55
% 0.05 tripsin -% 0.02 EDTA	Gibco / Invitrogen	25300
Eagle Minimum Essential Medium (EMEM)	Gibco / Invitrogen	07-00100DK
Fetal bovin serumu (FBS)	HyClone	SH30070.03	Isı inaktive, 56 ° C, 30 dakika
100X olmayan esansiyel amino asitler (10 mM)	Gibco / Invitrogen	11140	Karanlıkta 4 ° C'de depolayın
L-glutamin	Gibco / Invitrogen	25030
HEPES	Gibco / Invitrogen	15630
EMEM-% 10 FBS (EMEM% 10)			Steril-filtre, serum% 10 ısı-inaktif FBS ile EMEM Ek
EMEM-% 20 FBS + takviyeleri (EMEM-% 20 + S)			; 1X amino asitler, 2 mM L-glutamin, 10 mM HEPES, steril-filtre ısı-inaktif FBS,% 20: son konsantrasyonları için EMEM Ek
24-iyi Transwell plakaları	Corning Costar	3472	3 mikron gözenek boyutu, polyester
Tripan mavisi	Gibco / Invitrogen	15250
Etanol	Sigma	E7023	Steril dH 2 O kullanarak% 70 hazırlayın
Dulbecco PBS (D-PBS)	Invitrogen	14040
Sigara floresan tampon			118 mM NaCl;4.75 mM KCl; 2.53 mM CaCl2 × H 2 O; 2.44 mM MgSO4; 1.19 mM KH 2 PO 4, steril su içinde 25 mM NaHCO 3; steril filtre
Sodyum floresein	Sigma	6377	Steril olmayan floresan tamponu içinde 1 mg / ml steril filtre, ışıktan korumak; 4 mağaza ° C 6 aya kadar
			EKİPMAN
Voltohmmeter	Dünya Hassas Aletler
STX2 elektrot	Dünya Hassas Aletler
ELISA plaka okuyucu			A 486 veya A 490 ölçebilen