הקמת תרבות הנוזלית מכוסית של Airway האנושי המקוטב-3 Calu תאי אפיתל ללמוד תגובת תא מארחת לפתוגנים נשימה<em&gt; במבחנה</em

Summary

הממצאים והמסקנות בדו"ח זה הם של הכותבים ואינם מייצגים בהכרח את הדעות של המרכז לבקרת מחלות ומניעתן.

Abstract

משטחי apical וbasolateral של תאי האפיתל של דרך נשימה להפגין תגובות כיוונית לחשיפת הפתוגן בגוף חי. לפיכך, אידיאלי במודלים חוץ גופייה לבחינת תגובות תאיות לפתוגנים נשימה לקטב, ויצר משטחי apical וbasolateral. מודל אחד כזה הוא מובחן תאים נורמלים אדם סימפונות אפיתל (NHBE). עם זאת, מערכת זו דורשת דגימות רקמת ריאה, מומחיות ובידוד תאי האפיתל culturing מרקמות, וזמן כדי ליצור תרבות ממשק אוויר נוזלית.

-3 Calu תאים, הנגזרים מאדנוקרצינומה סימפונות אנושיות, הם מודל חלופי לבחינת התגובה של תאי האפיתל של דרך נשימה הפרוקסימלי לעלבון נשימה ^1, תרכובות תרופתיות ^{2-6, ו7-9} חיידקים ופתוגנים נגיפיים, כוללים וירוס שפעת, rhinovirus ותסמונת חמורה נשימתית חריפה - המשויכת קורונה ^10-14. לאחרונה, Wהדואר הוכיח ש- 3 Calu תאים רגישים לוירוס בדרך נשימת סינסיציאלי (RSV) זיהום באופן עקבי עם NHBE ^15,16. הנה, אנחנו פירוט הקמת התרבות המקוטבת, נוזל מכוסה (LCC) של-3 Calu תאים, תוך התמקדות בפרטים הטכניים של גידול ו- 3 Calu תאי culturing, שמירה על תאים שתרבית לLCC, ואנו מציגים את שיטה לביצוע זיהום וירוס בדרך נשימה של-3 Calu תאים מקוטבים.

עקביות להשיג Calu-3 מקוטב LCC, Calu-3 תאים יש subcultured בקפידה לפני culturing במוסיף Transwell. Calu 3-תרבויות monolayer צריכות להישאר מתחת למפגש 90%, יש subcultured פחות מ 10 פעמים ממניות קפוא, וצריכים להיות מסופקות באופן סדיר עם מדיום חדש. תרבית לאחר בTranswells, Calu-3 LCC חייב להיות מטופל בזהירות. שינויים בתקשורת לא סדירים והגבלה מכאנית או פיזית של שכבות תאים או צלחות להשפיע לרעה על קיטוב עבורכמה שעות או ימים. קיטוב הוא פיקוח על ידי הערכת התנגדות חשמלית טרנס אפיתל (TEER) ומאומת על ידי הערכת האיזון הפסיבי של fluorescein נתרן בין תאי apical וbasolateral ^17,18. המישורים לאחר TEER או מעל 1000 Ω × ² סנטימטר, Calu-3 LCC מוכנים להשתמש כדי לבחון תגובות תאיות לפתוגנים בדרכי נשימה.

Protocol

1. -3 Calu תאי culturing לשימוש בתרבויות Transwell

אמצעי בטיחות: ביצוע כל הפרוצדורות בארון בטיחות ביולוגית באמצעות טכניקת תרבות סטרילי.

1. כדי להפשיר מתאי אחסון קפוא:
   1. הכן בינוני החיוני המינימאלי של הנשר המכיל 20% pH and10 mM HEPES 7.4 (20-EMEM% + S) סרום חום מומת עוברי שור (FBS), 0.1 חומצות אמינו לא חיוני מ"מ, 2 מ"מ L-גלוטמין,. סטרילית-מסנן בינוני המוכן באמצעות מסנן 0.2 מיקרומטר גודל נקבובי, וחם באמבט מים עד 37 ° C. להיות מהורהרים יותר של דרך אוויר בסביבת אפיתל אתר, בינוני לא השלים עם אנטיביוטיקה או antimycotics.
   2. הפשר cryovial קפוא של-3 Calu תאים במהירות (<דקות 1) באמבטית ° C 37 מים.
   3. להעביר את התאים הפשירו לצינור חרוטי מ"ל סטרילי 50 ולהוסיף 30 מ"ל של מחומם EMEM-20% + S.
   4. גלולת התאים על ידי צנטריפוגה במשך 5 דקות ב1,000-1,200 × g,ללא קירור, ועם מהירות בלם נמוכה.
   5. למזוג supernatant עדינות וresuspend התאים ב5 מ"ל של EMEM-20% מחוממים + S על ידי pipetting בעדינות מעלה ומטה. זרעים 2-5 × 10 ⁶ תאים לכל היטב לתוך צלחת 6-גם רקמת תרבות ולדגור על 37 המעלות צלזיוס, CO ₂ 7% באווירת אוויר עד שהתאים הם 75% - 80% confluent. בדקו יומי; עד 7 ימים ייתכן שיידרשו. כל 3-4 ימים לשאוב הבינוניים מהתאים ולהחליף אותו טרי EMEM-20% + S.
2. לתאים תת:
   1. 0.05% טריפסין חם - 0.02% EDTA באמבטית ° C 37 מים. לשאוב את המדיום מהתאים, ולשטוף את התאים פעם אחת עם טריפסין 0.05% מחוממים - 0.02% EDTA להסיר עודפים בינוניים וסרום. הסר לשטוף ולהוסיף 1 מ"ל של טריפסין חמם לכל גם לתאים.
   2. לדגור על 37 ° C ו 7% CO ₂ ולפקח תחת מיקרוסקופ כל 5 דקות עד שלפחות 75% מתאים להתנתק מהבאר (הים) של צלחת תרבית הרקמה. זה עשויתיקח בין 5 ל 30 דקות.
   3. שטוף תאים ב- 20 EMEM% + S כדי להסיר טריפסין העודף. להעביר את תאי trypsinized לצינור חרוטי סטרילי 50 מ"ל. בארות רבות של תאים מצלחת התרבות 6 גם אחד יכולות להיות נקוות לתוך צינור אחד 50 מ"ל סטרילי חרוטים. הוסף 30 מ"ל של EMEM-20% + S וגלולת התאים על ידי צנטריפוגה ב1,000-1,200 × גרם, ללא קירור, ועם מהירות בלם נמוכה.
   4. למזוג supernatant עדינות וresuspend התאים בEMEM-20% טריים + S על ידי pipetting בעדינות מעלה ומטה. באמצעות צעדים 1.2.1 באמצעות 1.2.3 לעיל כדי trypsinize תאים, ימשיך תאים תת לתוך צלחות תרבית רקמה כמתואר בשלבים 1.2.5 באמצעות 1.2.7 כאשר הם בין 75 - confluent 80%.
   5. תת מטיפוס אחד המוכר היטב של צלחת 6-היטב עד 1 T-25 סנטימטר ² בקבוק בנפח סופי של 5 מ"ל של EMEM-20% + S, זריעה בין 0.5-1 × 10 ⁶ תאים / בקבוק.
   6. שימוש 5 מ"ל חמם טריפסין לT-25 ² סנטימטר בקבוק לנתק את התאים, תת תרבותמאחד ² סנטימטר בקבוק T-25 עד 1 T ^75-2 סנטימטר בקבוק בנפח סופי של 10 מ"ל של-20 EMEM% + S, זריעה בין 1 ל 5 × 10 ⁶ תאים / בקבוק.
   7. באמצעות 8 מ"ל חמם טריפסין לT-75 סנטימטר ² בקבוק לנתק את התאים, תת מאחד ² בקבוק T-75 סנטימטר ל 2 T-75 ² צלוחיות סנטימטר. לצמיחת תאים אופטימליות, לא תאים תת לתוך צלוחיות גדולות יותר מסנטימטר T-75 ² או בתת יחס גדול יותר מבקבוק 1 הורה: 3 צלוחיות חדשות.
3. ברגע שתאים כבר subcultured, להסיר לחלוטין ולהחליף את המדיום כל 2 עד 3 ימים עד שהם מגיעים מפגש 75-90%. תאים עשויים להימשך עד 3 שבועות כדי להגיע לנקודת מפגש 75-90%. עבור דור האופטימלי של תרבויות מקוטבות, תאים תת לפני שהם יגדלו מעבר למפגש 90% כmonolayer.
4. המשך לתאים תת עד מספיק תאי זרע גדלו מספר הרצוי של Transwell מוסיף. כל הוספת Transwell דורשת 2 × 10 ⁵ תאים. לקבלת ביצועים מיטביים יצירת תרבויות מקוטבות, להשתמש בתאים שעברו לא יותר מ 10 תת תרבות.

2. -3 Calu תרבויות מקוטבות גידול נוזלי מכוסות (LCC)

אמצעי בטיחות: ביצוע כל הפרוצדורות בארון בטיחות ביולוגית באמצעות טכניקת תרבות סטרילי.

1. הכן EMEM המכיל 10% FBS (EMEM-10%) וחם באמבט מים עד 37 ° C.
2. הכן צלחת Transwell 24 גם לזריעה. שימוש במלקחיים סטריליים, להעביר מוסיף Transwell מהפנים אל השורות החיצוניות של הצלחת בלי לגעת בקרום להוסיף. תאים צריכים להיות subcultured רק לתוך בארות בשורות החיצוניות של הצלחת. כדי למנוע החדרת בועות אוויר אל תאי basolateral, להוסיף 600% μl של EMEM-10 לכל אחד מהם על ידי מטה את פיפטה על הקיר של כל תא ומשחרר את המדיום באיטיות לתוך הבאר.
3. ניתוק מתאי T-75 ² רקמות סנטימטר. Subcuצלוחיות lture באמצעות טריפסין חמם, ולשטוף ב30 מ"ל של-20 EMEM% + S לכל 2 צלוחיות של תאי trypsinized, כפי שמתוארים בשלב 1.2.
4. יסודיות resuspend התאים השטופים ב5 מ"ל של% EMEM-10 על ידי pipetting בעדינות מעלה ומטה.
5. קבע ספירת תאי קיימא וכוללת בשיטת ההדרה הכחולה trypan. להמשיך רק אם 80% - 90% הם בנות קיימא.
6. בצינור חרוטים 50 מ"ל סטרילי, לדלל את התאים לריכוז של 2 × 10 ⁶ תאים / מיליליטר קיימא עם% EMEM-10.
7. הוסף תאים לתא האפיקלי של כל Transwell. לבארות A1 ו D1, אשר יהיו בארות בקרה סלולרית חינם, כלומר, חסרים, להוסיף 100 μl של EMEM-10% ללא תאים. לכל אחת מהבארות שנותרו, להוסיף 100 μl של-3 Calu תאי resuspended, עדינות לדוג פיפטה נגד ערוץ המדריך הפנימי של הקיר להוסיף ומשחרר את התאים לאט. אל תיגע בפיפטה לממברנה להוסיף. כדי לשמור על השעיה הומוגנית של-3 Calu תאים, בעדינות להתסיס השעית התאבמהלך שלב זה זריעה.
8. צלחת דגירת Transwell על 37 מעלות צלזיוס ו% 7 CO ₂ באטמוספרת אוויר. צלחת מקום בחממה שבו הפרעה פיזית תהיה מינימאלית. כדי לשפר את היעילות של קיטוב, אל תערמו צלחות על גבי זה.
9. כדי לשמור על תרבויות עד מקוטב ומוכן לשימוש בניסויים, להחליף לחלוטין בינוני בTranswells, כמתואר בשלבים 2.10 דרך 2.13 להלן. בינוני יש להחליף לחלוטין שלושה ימים לאחר שsubcultured לTranswells, ולאחר מכן במחזור לסירוגין בין היום הרביעי ואז השלישי לאחר ההאכלה הקודמת, עד שתאים הם מקוטבים באופן מלא.
10. חם EMEM-10% באמבט מים עד 37 ° C.
11. בעדינות לשאוב בינוני ממוסיף Transwell. עם פיפטה נימים מצורפות למלכודת ואקום עם ואקום עדין, או עם תקן המ"ל פיפטה 1, בינוני aspirate מהבארות A1 תא חינם וD1, אז מseeded בארות, הסרה בינוני פסגה ראשונה מכל הבארות, ולאתרנגולת הסרה בינונית basolateral מכל הבארות. אל תיגעו קרומים להוסיף תוך aspirating בינוני.
12. הוסף 200% μl של EMEM-10 לתא הקודקוד של הבארות A1 תא חינם וD1, ולאחר מכן לseeded הבארות, בימוי הבינוני לתוך התא האפיקלי באמצעות הצד של הכנסה כדי להנחות את קצה פיפטה. אל תוסיף בינוני ישירות על גבי תאים, ולא נוגע בקרום להוסיף.
13. הוסף 600% μl של EMEM-10 לתאי basolateral. כדי למנוע החדרת בועות אוויר אל תאי basolateral, להוסיף את המקור לכל אחד מהם על ידי מטה את פיפטה על הקיר של כל תא ומשחרר את המדיום באיטיות לתוך הבאר.

3. הערכת התפתחות התנגדות של Calu-3 LCC

אמצעי בטיחות: ביצוע כל הפרוצדורות בארון בטיחות ביולוגית באמצעות טכניקת תרבות סטרילי.

1. הערך את התנגדות החוצה אפיתל חשמלית (TEER) של Calu-3 30 דקות לאחר LCCשינויים בינוניים; ההערכה ניתן לבצע לאחר כל שינוי בינוני אם ירצה. לבצע מדידות בתנאים סטריליים. בגין מדידות עם שליטת תא חינם בארות A1 ו D1 (את החסר) להשיג מידות בסיסיות, ולהמשיך במדידה של כל טובה.
   1. בתנאים סטריליים, להעביר את האלקטרודה STX2 לצינור צנטריפוגה 50 מ"ל המכיל 70% אתנול במים סטריליים, ולעקר 15 דקות.
   2. לכייל ולבדוק voltohmmeter לשימוש בהתאם להוראות יצרן.
   3. הסר את האלקטרודה מאתנול, אוויר יבשות שניות 5-10, ולשטוף את האלקטרודה ב% סטרילי EMEM-10.
   4. הגדר את מתג המצב של voltohmmeter להגדרת ההתנגדות, ולהפוך את הכח על.
   5. מניח בעדינות את האלקטרודה לאחד 3 היציאות המאפשרות גישה לתא basolateral של תרבות אחת Transwell. האלקטרודה מקום, כך שכבר הוביל בקלילות רק יגעה בתחתית גם החיצוני ונשארה אנכי,ולהוביל הקצרים הוא בטווח הבינוני תרביות הרקמה של התא האפיקלי, בלי לגעת בקרום להוסיף.
   6. לחץ על כפתור "מדוד R", ולחכות לקריאה לייצוב. חזור עבור 2 יציאות האחרות לכל באר ולהקליט את המדידות מכל השלוש היציאות, עבור סכום כולל של שלוש מדידות לטובות. המשך למדוד את ההתנגדות לכל הבארות של תאים.
   7. נקה את האלקטרודה על ידי שריית דקות 5-10 באתנול 70%, שטיפה בDH ₂ O סטרילי, וייבוש ביסודיות. אחסן במכל המקורי.
   8. חשבתי את ההתנגדות של כל אחד וכן, באמצעות משוואה 1.
      Ω = Ω _{בפועל מדגם} - Ω _ריק, משוואת 1
      בי _מדגם Ω הוא המדידה הממוצעת מseeded היטב וΩ _ריק היא מדידה ממוצעת מ2 הבארות, A1 ו-D1, המכילה מוסיף ובינוני, אך לא תאים.
   9. חשבתי את התנגדות יחידת השטח, תוך שימוש בEquation 2.
      _בפועל Ω × שטח הממברנה יעילה = Ω × ² סנטימטר, משוואת 2
      שבו שטח הממברנה היעיל הוא 0.33 סנטימטר ² למוסיף Transwell 24 כן.
2. ודא קיטוב שהושלם על ידי ביצוע בדיקה משנית, מדידת דיפוזיה fluorescein נתרן פסיבית בין תאי apical וbasolateral, על 1-3 תרבויות Transwell. הבארות המשמשות לבדיקת fluorescein נתרן אמורות להיות מושלכות מייד לאחר השלמת הבדיקה.
   1. הכן את החיץ הלא ניאון (118 mM NaCl, 4.75 mM KCl; 2.53 mM CaCl ₂ 0.2 H ₂ O; 2.44 mM MgSO _4; 1.19 mM KH ₂ PO _4, 25 מ"מ ₃ NaHCO במים סטריליים; סינון סטרילי עם מכשיר סינון מיקרומטר 0.45 ). הכן fluorescein נתרן ב1 ​​מ"ג / מ"ל ​​בחיץ שאינו ניאון, סינון סטרילי, עוטפים בנייר כסף, וחנות ב 4 ° C, מוגן מפני אור. חם לחדר temperatuמחדש לפני השימוש.
   2. לאחר שסיים את המדידות של התנגדות, להסיר בזהירות בינונית משני תאי basolateral וקודקוד של 1-3 תרבויות Transwell בודדות.
   3. שטוף תרבויות Transwell. בעדינות להוסיף 600 μl טמפרטורת חדר PBS של סטרילי Dulbecco (D-PBS) לתאי basolateral ו100 μl טמפרטורת חדר סטריליים D-PBS לתאי apical.
   4. בעדינות להסיר D-PBS מבארות. הוסף 600 חיץ הלא ניאון הסטרילי μl לתאי basolateral. הוסף fluorescein 100 μl סטרילי 1 מ"ג / מיליליטר נתרן לתאי apical.
   5. דגירה את הצלחת על 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1. CO ₂ אינו נדרש במהלך דגירה זה.
   6. במהלך דגירה, להכין עקומת נתרן fluorescein סטנדרטי נעה בין 20 מיקרוגרם / מ"ל ​​ו 0 מיקרוגרם / מ"ל, באמצעות חיץ הלא ניאון לדלל fluorescein נתרן. הכן לפחות 8 ריכוזים שונים של fluorescein נתרן, כל אחד בנפח סופי של לפחות 600 μl. לשמורדילולי עקומת סטנדרט מוגנים מפני אור עד מוכן למדידת ספיגה.
   7. להעביר את מדגם החיץ הלא ניאון מתא basolateral של כל Transwell בדיקה לצינור נקי נפרד לניתוח. הסר את מבחן Transwells משמש כדי לבחון דיפוזיה fluorescein נתרן פסיבית מהצלחת וזורקים. להחזיר את הצלחת עם Transwells שנותר לחממה.
   8. הנח 100 μl של כל פתרון סטנדרטי בשלושה עותקים לצלחת 96-היטב שטוחה תחתית.
   9. הכן 3 דילולים של כל דגימת basolateral (1:2, 1:20, ו01:50) במאגר שאינו ניאון, ולהוסיף 100 μl של כל דגימת דילול מלאה ובכל דילול, בשני עותקים, ל96-היטב שטוח צלחת תחתונה.
   10. ספיגת מדגם מידה על קורא צלחת ELISA ב486 מייל ימי או 490 ננומטר.
   11. לקבוע את הריכוז של fluorescein נתרן בתא basolateral על ידי השוואת דגימות הספיגה כנגד ערכי הספיגה לנתרן fluorescein stעקומת andard.

4. מדביק Calu-3 המקוטבים LCC עם וירוס בדרך נשימה

אמצעי בטיחות: ביצוע כל הפרוצדורות בארון בטיחות ביולוגית באמצעות טכניקה סטרילית תרבות, ברמת בטיחות ביולוגית מתאימה לוירוס בשימוש.

1. דלל וירוס בEMEM סרום נטול כך שinocula הרצוי יהיה ב100 μl.
2. שטוף תאים בEMEM סרום חינם. בעדינות לשאוב בינוני מכל הבארות, הסרה בינוני קודקוד אז בינוני basolateral. עם פיפטה נימים מצורפות למלכודת ואקום עם ואקום עדין, או עם תקן המ"ל פיפטה 1, בינוני aspirate מהבארות A1 תא חינם וD1, אז מseeded בארות, להסיר תחילה בינוני קודקוד מכל הבארות, ולאחר מכן להסיר הבינוני basolateral מכל הבארות. אל תיגעו קרומים להוסיף תוך aspirating בינוני.
   1. הוסף 100 μl של EMEM סרום נטול לתא הקודקוד של הבארות A1 תא חינם וD1, ולאחר מכן ל-tהוא seeded בארות, בימוי בינוני לתוך התא האפיקלי באמצעות הצד של הכנסה כדי להנחות את קצה פיפטה. אל תוסיף בינוני ישירות על תאים, ולא נוגע בקרום להוסיף.
   2. הוסף 600 μl של EMEM סרום נטול לתאי basolateral. הוסף לכל מדיום Transwell ידי לדוג פיפטה על הקיר של התא ומשחרר את המדיום באיטיות לתוך הבאר.
   3. בעדינות לשאוב בינוני סרום ללא מבאר.
3. מתחיל עם בארות נגועות או מדומה-נגועות, להוסיף דילולי וירוס מתאימים לתא הקודקוד של Transwells. לבארות נגועות, להוסיף 100 μl של EMEM סרום נטול לתא הקודקוד של Transwells המתאים, לבארות מדומה נגועות, להוסיף 100 μl הכנת וירוס ללא דילול בEMEM סרום נטול לתא הקודקוד של Transwells המתאים, ועבור הידבקות בוירוס, לדלל את הווירוס בEMEM סרום חופשי, ומוסיפה 100 μl לתאי apical של Transwells המתאים.
4. הוסף 600 μl של EMEM סרום חופשי לכל מדורי basolateral.
5. לדגור על 37 ° C ו-CO _2% 7 עבור 2 שעות.
6. לשאוב בינוני מבאר, ראשון מבארות נגועות ומדומה-נגועות, אז מבארות נגועות. הסר supernatants 1 apical, ואחרי supernatants basolateral.
7. החלף בינוני עם 200% μl של EMEM-10 בתאי apical ו600 μl של EMEM-10% בתאי basolateral.

תוצאות

כשגדל כתרבויות נוזליות מכוסות (LCC) במערכות תרבות Transwell, כפי שמודגם באיור 1,-3 Calu תאים לקטב, פיתוח משטחי apical וbasolateral מובחנים. בעקבות שיטה המתוארת כאן, התנגדות החוצה אפיתל החשמלית (TEER) של Calu-3 LCC מגיעה לרמה או מעל 1000 Ω × ² סנטימטר תוך 3 שבועות לאחר זריעה, דוגמה שמוצגת באיור 2. צומת ההדוקים שנוצרו בין תאים מקוטבים למנוע איזון פסיבי של מולקולות קטנות בין תאי apical וbasolateral. לפיכך, בדיקת איזון fluorescein נתרן שונה משמשת כדי לאשר את הקיטוב של Calu-3 LCC ^15,17,18. כTEER של Calu-3 monolayers הסלולרי בעליות LCC, כמות שfluorescein פסיבי equilibrates לתוך תא basolateral פוחתת. ברגע TEER הוא 1,000 Ω × ² סנטימטר, כמות fluorescein שequilibrates ב לתא basolateral הוא ≤ 1%, כפי שמוצגים באיור 3, ולכן Calu-3 LCC נחשבים למקוטב באופן מלא כאשר TEER הוא ≥ Ω 1000 × ² סנטימטר. מדידת TEER השיא של Calu-3 LCC עשויה להשתנות מניסוי לניסוי. עם זאת, ברגע שרמת ערכי TEER לכל ניסוי נתון, מקוטב באופן מלא, אינו נגוע Calu-3 LCC עשוי להיות יציב במשך 5 עד 12 שבועות לאחר זריעה. העדר פיתוח התנגדות בTranswell-מתורבתים Calu-3 עשוי להיגרם על ידי מספר גורמים כמפורטים בטבלה 1. רגע TEER מישורי Calu-3 LCC או מעל 1000 Ω × ² סנטימטר, המודל מוכן לשמש לבדיקה תגובות נשימת אפיתל תאים לפתוגנים בדרכי נשימה, כולל וירוס סינסיציאלי נשימה (RSV). חשיפה לתוצאות RSV בירידה מהירה יותר בשלמות התרבות מקוטבת בהשוואה לזיהום מדומה של תאים (איור 4).

= "תמיד">
איור 1. ייצוג חתך של תאי Transwell-תרבית. תאים גדלים על משטח הפסגה של הקרום להוסיף.

איור 2. התפתחות של עמידות טרנס אפיתל החשמלי (TEER) וקיטוב של Calu-3 תאים לאחר זריעה במוסיפה Transwell. בכל נקודת זמן, TEER מוצגת כΩ x סנטימטר חציון ² ± SEM של 32 בארות עצמאיות מניסוי נציג אחד.

איור 3. הפסיבי equili bration של fluorescein נתרן לתוך תא basolateral של Calu-3 monolayers הסלולרי מעוכב כתאים הופכים מקוטבים. נתונים מצטברים מארבעה ניסויים העצמאיים הוא מוצג. כל נקודת נתונים מייצגים מדידה בודדה.

איור 4. זיהום RSV של Calu-3 LCC המקוטב מאיץ ירידה בשלמות monolayer. Calu-3 תאים מקוטבים היו נגוע בRSV-A2 במשרד פנים = 1 ביום 0, והקוטביות הייתה פיקוח במשך 8 שבועות לאחר הדבקה. ניסוי נציג אחד מוצג. נתונים מוצגים כהתנגדות ממוצעת של 8 בארות עצמאיות לזיהום ± SEM כל נקודת זמן. * P <0.05 בין תרבויות חיקוי ו- A2 הנגועות-RSV, כפי שנקבעו על ידי מבחן t של סטודנט.

דרכים "> גיליון רזולוציה (ים) התנגדות אינה מדידה

• הסר את כל בועות אוויר בבארות
• השתמש-3 Calu תאים שsubcultured ממניות קפוא פחות מ 10 פעמים
• אל תאפשרו ל- 3 Calu תאים להגיע למפגש 100% בתת monolayer
• בדקו שתאים אינם גדלו על הפלסטיק הרבה מתחת להוסיף (המציין כי תאים עשויים שגדלו דרך הנקבובי של ההוספה)
• כעבור 2-3 שבועות לאחר זריעה לפיתוח התנגדות מלא
• בדקו את הרכב והגודל נקבובי של מוסיף משמש, לשנות במידת צורך (מומלץ להוסיף פוליאסטר, גודל נקבובי 0.3 מיקרומטר, ללא ציפויים, ראה חומרים לפרטים נוספים)
• בדקו את האיכות של האלקטרודה, שיוף עדין המסיר את החלבונים שהצטברו מהקצה, והחלפה במידת צורך
• בדקו בינוני להתפתחות חיידקים

התנגדות מתפתחת, אבל קיטוב מלא (≥ Ω × 1000 סנטימטר ²⁾ לא הושג

• לאפשר זמן נוסף לקיטוב לפתח (אולי מדי פעם לקחת עד 4 שבועות)
• השתמש-3 Calu תאים שsubcultured ממניות קפוא פחות מ 10 פעמים
• אל תאפשרו ל- 3 Calu תאים להגיע למפגש 100% בתת monolayer
• עקביות להחליף בינוני בתרבויות Transwell, לסירוגין בין היום הרביעי 3 ואז אחרי ההאכלה הקודמת
• תאי תרבות יחידים במוסיף כי ממוקמות את השורות החיצוניות של צלחות
• השתמש שונים בהרבה ממוסיף Transwell

תאים לקטב באופן מלא, אבל התנגדות אינה עקבית מקריאה אחד למשנו

• אל תפגעו או לערום צלחות בחממה
• אל תגרום לרעידות בארון הבטיחות הביולוגי תוך Transwell plates מטופלות
• הסר את כל בועות אוויר בבארות
• נא לא להפריע את שכבת התא עם טיפי פיפטה כשמשתנית מדיה או ביצוע קריאות TEER
• השתמש בינוני μl 200 בתא האפיקלי; עוצמת קול נמוכה יותר עלולה לגרום לקריאות TEER יציבות
• בדוק את האיכות של האלקטרודה, שיוף עדין המסיר את החלבונים שהצטברו מהקצה, ולהחליף במידת צורך

1. בעיות טבלת פתרון בעיות, שעשוי להתעורר כאשר 3 Calu תאי culturing בTranswells. גורמים רבים תורמים לקיטוב מלא ב- 3 Calu תאים בתרבית נוזל מכוסה, הסבירה שרובם מסומנים בטבלה זו.

Discussion

כאשר הקמת Calu-3 LCC במוסיף Transwell, תאים לא יכולים לקטב בכלל, או לא יכולים לקטב באופן מלא, כפי שהוגדרו על ידי TEER ≥ Ω 1000 × ² סנטימטר ו≤ 1% איזון צבע נתרן fluorescein בין תאי apical וbasolateral. בנוסף, Calu 3 תאים בLCC יכולים לקטב באופן מלא, אך עשויה להיות לא עקבי TEER בין מדידות. למרות תנודות במדידות TEER של Calu-3 LCC הן נורמליות מיום ליום, נדנדות פעם מקוטבות באופן מלא, דרמטיות בTEER לא צפויות עד שהתרבות באופן טבעי יורדת עם גיל, שיכול להיות קטן כמו 5 שבועות או כל עוד 12 שבועות לאחר זריעה.

היכולת של Calu-3 LCC לקטב תלויה בחלקו על אופן בו תאים נשמרים וsubcultured לפני השימוש במערכת Transwell. תאים שצמחו מעבר למפגש 90% כmonolayer במהלך subculturing, כי כבר subcultured יותר מ 10 פעמים מהמניות קפוא, או שלא תהיהen מסופק עם מדיום טרי על לוח זמנים קבוע נוטה פחות לקטב באופן מלא, וכל קיטוב צפוי לרדת במהירות. חוסר חלקי או מלאה של קיטוב גם ניתן לייחס לשינויים בחומר והגודל נקבובי של Transwells משמש לCalu-3 LCC, ושונות הרבה להרבה בTranswells של הרכב דומה וגודל נקבובי עשויות להשפיע גם על קיטוב. נקבוביים בגדלים גדולים יותר יכולים לאפשר Calu-3 לצמוח דרך קרום Transwell לתוך תא basolateral, מניעת התרבות מקיטוב. העדר הקיטוב יכול להיות גם בשל התפתחות חיידקים, שצוין על ידי תרבות בינונית מעורפלת, מה שמוביל להתמוטטות הבאה של צומת ההדוקים בין 3 Calu תאים.

מדידות TEER משתנות של Calu-3 LCC עלולות להיגרם על ידי הפרעות מכאניות של monolayers Calu -3 LCC התא, מוסיף, או את הצלחות בעצמם. שינויים בינוניים ומדידות TEER צריכים להתבצע בלי עצות פיפטה או אלקטרודה מובילה לגעת בתאים. בעת ביצוע פעולות אלה, יש להקפיד להימנע מהחדרת בועות אוויר אל תאי apical וbasolateral, אשר משבשים את היכולת של voltohmmeter לזהות התנגדות. היכולת של voltohmmeter לזהות התנגדות בתרבות שהיא למעשה מקוטב יכולה גם מוגבלת על ידי הצטברות חלבון על מוביל אלקטרודות. למעלה לבנות זה עשוי להסיר עם משייף עדין, או ניתן לתקן על ידי החלפת אלקטרודה.

ברגע Calu-3 LCC לקטב לחלוטין וTEER כבר לא עולה, Calu-3 LCC מוכן לשימוש כמודל במבחנה לאפיון תגובות תא אפיתל ריאה מארחת לזיהום בדרך נשימה. מערכת זו מאפשרת אפיון טוב יותר של תגובות כיוונית לפתוגנים השוואה לשורות תאי ריאת monolayer-תרבית משמשות באופן מסורתי כדי ללמוד פתוגנים בדרכי נשימה, כגון A549-2 והפ תאים, עם יתרונות הנוספים של Calu-3 LCC being מהיר יותר לפיתוח, המתקבל בקלות רבה יותר, ופחות יקר להפקה מאשר NHBE הראשוני, מקוטב, מובחן. בדומה לNHBE, מקוטב Calu-3 להפגין היווצרות צומת הדוקה, ולייצר mucins. עם זאת, בניגוד לNHBE, Calu-3 תאים מקוטבים אינם מבחין לתוך שכבות של תאי בסיס ותאי אפיתל ריסי columnar, וCalu-3 כמה תאים מקוטבים לפתח תחזיות ריסים כמו ^19. כך, למרות ששימושי לבחינת תגובות מקוטבות של תאי האפיתל בדרכי אוויר לנשימת עלבון, Calu-3 המקוטבים LCC הוא לא מודל אידיאלי לבדיקת פיתוח דרכי נשימה או שיפוץ בתגובה לעלבון או פגיעה בדרכי נשימה. ייצור ריר על ידי תאים בתרבית במבחנה עשוי להשפיע infectivity סלולרי, כמו גם שחרורו של וירוס מדבק והתפשטות וירוס במודל מקוטב, והשוואה ישירה בין ייצור הריר Calu-3 המקוטבים LCC וNHBE מקוטב, בדיל לא דווח . A549 ו- 2 תאים HEPמחדש קל יותר לתרבות מאשר-3 Calu תאים, עם זאת, שלא כמו Calu-3 LCC, הם לא יוצרים תרבויות מקוטבות כאשר גדלו במוסיף Transwell, ובכך מהווים מודל אידיאלי לבדיקה לא במבחנה את התגובות של תאי האפיתל מקוטבים לזיהום וירוס בדרך נשימה .

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
			ריאגנטים
Calu-3	ATCC	HTB-55
טריפסין 0.05% - 0.02% EDTA	Gibco / Invitrogen	25300
הבינוני החיוני המינימאלי של הנשר (EMEM)	Gibco / Invitrogen	07-00100DK
סרום שור עוברי (FBS)	HyClone	SH30070.03	חום להשבית, 56 ° C, 30 דקות
חומצות אמינו לא חיוניות 100x (10 מ"מ)	Gibco / Invitrogen	11140	חנות ב 4 ° C בחושך
L-גלוטמין	Gibco / Invitrogen	25030
HEPES	Gibco / Invitrogen	15630
EMEM-10% FBS (EMEM-10%)			תוספת EMEM עם FBS חום מומת עד 10% בסרום, עקר מסנן
EMEM-20% FBS + תוספים (EMEM-20% + S)			תוספת EMEM לריכוזים סופיים: FBS חום מומת, 20%; 1X חומצות אמינו; 2 L-גלוטמין מ"מ; 10 HEPES מ"מ; עקר מסנן
צלחות Transwell 24 גם	קורנינג שחקן משנה	3472	3 גודל נקבובי מיקרומטר, פוליאסטר
Trypan כחול	Gibco / Invitrogen	15250
אתנול	סיגמא	E7023	הכן ל 70% באמצעות DH 2 O סטרילי
PBS של Dulbecco (D-PBS)	Invitrogen	14040
חיץ ללא ניאון			118 mM NaCl;4.75 mM KCl; 2.53 mM CaCl 2 × H 2 O; 2.44 mM MgSO 4; 1.19 mM KH 2 PO 4, 25 מ"מ 3 NaHCO במים סטריליים; עקר מסנן
fluorescein נתרן	סיגמא	6377	1 מ"ג / מ"ל ​​בחיץ סטרילי שאינו ניאון; עקר מסנן, להגן מפני אור; חנות ב 4 ° C עד 6 חודשים
			ציוד
Voltohmmeter	מכשירי Precision העולם
STX2 האלקטרודה	מכשירי Precision העולם
ELISA צלחת קורא			מסוגל למדוד 486 או 490