عزل خلايا الكبد البشرية من قبل خطوتين كولاجيناز الإرواء الداخلي

Summary

يوصف A-خطوتين الإجراء كولاجيناز نضح تعديل لعزل خلايا الكبد البشرية. ويمكن أيضا أن هذه الطريقة يمكن تطبيقها على كبد الثدييات الأخرى. هي خلايا الكبد معزولة المتاحة في ارتفاع العائد والجدوى، مما يجعلها نموذجا مناسبة للبحث العلمي في مجالات مثل تجديد الكبد، الدوائية والسمية.

Abstract

الكبد، والجهاز مع قدرة استثنائية التجديد، ويحمل مجموعة واسعة من الوظائف، مثل إزالة السموم، والتمثيل الغذائي والتوازن. على هذا النحو، هي خلايا الكبد نموذجا هاما لمجموعة كبيرة ومتنوعة من الأسئلة البحثية. على وجه الخصوص، واستخدام خلايا الكبد البشرية أهمية خاصة في مجالات الدوائية، وعلم السموم، وتجديد الكبد والبحوث متعدية. وبالتالي، فإن هذا الأسلوب نسخة معدلة من على بعد خطوتين الإجراء كولاجيناز نضح لعزل خلايا الكبد كما وصفها Seglen ^1.

سابقا، وقد تم عزل خلايا الكبد عن طريق الطرق الميكانيكية. ومع ذلك، فقد ثبت أساليب الأنزيمية لتكون متفوقة كما تحتفظ خلايا الكبد سلامتها الهيكلية وظيفة بعد العزلة. هذه الطريقة المعروضة هنا تتكيف مع أسلوب تصميم من قبل لكبد الفئران إلى الإنسان قطعة الكبد ويؤدي إلى تحقيق عائد كبير من خلايا الكبد مع بقاء 77 ± 10٪. الرئيسيةالفرق في هذا الإجراء هو عملية إقناء؛ إدخال القنية في الأوعية الدموية. علاوة على ذلك، الطريقة الموصوفة هنا يمكن أيضا أن تطبق على كبد من الأنواع الأخرى مع الكبد أو الأوعية الدموية أحجام قابلة للمقارنة.

Introduction

خلية التعليق الكبد يمكن إعدادها من الكبد عن طريق الطرق الميكانيكية أو الأنزيمية. وتشمل الطرق الميكانيكية المستخدمة في إعداد خلايا الكبد كله يجبر الكبد من خلال القماش القطني ^2، والهز قطعة الكبد مع الخرز الزجاجي في شاكر خان ^3، وذلك باستخدام المجانسة الزجاج مع المطاحن فضفاضة ^4،5 الخ على مر السنين، انخفضت الطرق الميكانيكية من صالح بسبب الأضرار التي لحقت أغشية الخلايا وفقدان وظيفة خلايا الكبد من ^6،7 معزولة. وبالتالي فإن استخدام طريقة الأنزيمية هو حاليا الوسيلة الرئيسية لعزل خلايا الكبد.

عزل خلايا الكبد باستخدام أسلوب الأنزيمية وقد تحسنت كثيرا عندما بيري وصديق ⁸ perfused كولاجيناز وهيالورونيداز من خلال الكبد عبر الوريد البابي في الفئران. تستخدم هذه العملية نضح الأوعية الدموية للسماح للالانزيمات لتتلامس الوثيق مع الغالبية العظمى من الخلايا، مما يؤدي إلىزيادة 6 أضعاف في العائد من خلايا الكبد ^8. علاوة على ذلك، حققت هذه الطريقة الخلايا التي احتفظت سلامتها الهيكلية، مع عمليا أي التحول من الشبكة الإندوبلازمية في حويصلات معزولة وعدم وجود ضرر الميتوكوندريا ^8.

تم تعديل هذه الطريقة من قبل Seglen ^1، الذي كان رائدا إجراء نضح من خطوتين لعزل خلايا الكبد. في هذا الإجراء، يتم perfused في كبد الفئران مع كا ^{2 +} عازلة خالية يليه نضح مع العازلة كولاجيناز التي تحتوي على الكالسيوم ^{2 + 1.} إزالة كا ^{2 +} في الخطوة الأولى يساعد على تعطيل desmosomes، في حين أن المطلوب إضافة كا ^{2 +} في الخطوة الثانية للنشاط كولاجيناز الأمثل ^1،9.

بالنظر إلى أن الأعمال المنشورة المذكورة أعلاه قد تم تنفيذ في الفئران، وتهدف هذه المقالة لشرح إجراء تعديل والتي يمكن استخدامها لعزل خلايا الكبد مع سلامة عالية من همهمةوالأكباد. استخدام خلايا الكبد البشرية يظل من المهم للبحوث ومتعدية للتحقق من صحة التجارب باستخدام نماذج حيوانية. تم الحصول على قطعة كبد الإنسان المستخدمة في هذه الدراسة مع الموافقة على الحكم من خلال مؤسسة أبحاث الأنسجة البشرية والمحمولة، والتي تسيطر عليها الدولة غير ربحية الأساس ^10. بعد إزالة الطبيب الشرعي ما هو مطلوب للتشخيص، تم جمع قطع الكبد من الأنسجة المتبقية. كان الأنسجة مقطوع من قبل الطبيب الشرعي شكليا الأنسجة السليمة التي تم الحصول عليها من هوامش استئصال بعد استئصال الكبد.

Protocol

1. إعداد الإرواء وعزل حلول

1. إعداد الحلول اللازمة لنضح من قطعة الكبد وعزل خلايا الكبد وفقا للجدول 1. ويمكن تخزين الحلول في 4 درجات مئوية حتى الاستخدام.
2. تصفية العقيمة جميع الحلول باستخدام فلتر 0.22 ميكرون.
3. ينبغي لجميع الحلول التي تتلامس مع الكبد تكون معقمة.

2. إعداد معدات الإرواء وحلول

1. يجب تعيين المعدات اللازمة لنضح من الكبد حتى قطعة كما هو مبين في الشكل 1.
2. يجب تعيين حمام الماء في درجة حرارة مناسبة، والتي تختلف في كل وجه الخصوص التجريبية مجموعة المتابعة، ان هذه الحلول هي في درجة حرارة 37 درجة مئوية عندما تصل قطعة الكبد. في هذه الحالة، يتم تعيين حمام الماء عند 41 درجة مئوية لتدفئة حلول 1 و 2 و 3 و المكثف الزجاج تغلف. يجب أن تكون درجة حرارة تصل إلى 4 الحل37 درجة مئوية في حمام مائي منفصلة للاستخدام للحد من فقدان النشاط كولاجيناز.
3. قبل فترة وجيزة من نضح الكبد، بدوره على منظم من خزان الغاز التي تحتوي على 95٪ O _2/5٪ CO ₂ إلى الغاز جهاز الأوكسجين (الشكل 1E).

3. نضح من الكبد

1. قطعة الكبد مع قدر سليمة محفظة غليسون وقت ممكن وبشكل مثالي مع قطع فقط 1 السطح ينبغي الحصول عليها من الطبيب الشرعي للالارواء.
2. وضع هذه القطعة الكبد على قمع بوخنر الذي يحتوي على قرص مرشح مثقب (الشكل 1B).
3. يجب أن تستعد نظام نضح مع الحل 1.
4. مع معدل تدفق منخفض، يجب أن يتم إدراج منحني حقنة عادية الري مع نصائح الزيتون في الأوعية الدموية الكبيرة على سطح قطع من قطعة الكبد. كما تمسح الدم يخرج من الكبد، ويصبح أخف الأنسجة في المناطق ذات التروية الجيدة. عدد القنيات المستخدمة في مختلف الأحجاممن كبد هو مبين في الشكل 2A. حجم مقياس اختيار ينبغي أن يؤدي إلى نوبة دافئ من شأنها أن عقد حقنة عادية في المكان. ينبغي أن يترك الأوعية الدموية الصغيرة مفتوحة لنضح عازلة لاستنزاف من قطعة الكبد.
5. زيادة معدل التدفق على مضخة تحوي ما بين 110-460 مل / دقيقة اعتمادا على حجم الكبد (الشكل 2B). هذه النتائج في معدل تدفق 44 ± 16 مل / دقيقة لكل قنية (الشكل 2C). سرعة اختيار يعتمد على قطعة الكبد وينبغي أن يؤدي إلى النفش حتى طفيف من قطعة الكبد. في بعض الحالات، قد يكون من الضروري اتخاذ اجراءات اغلاق بعض السفن مفتوحة مع المشابك الأوعية الدموية الصغيرة لتحقيق النفش طفيف المذكورة أعلاه. ونضح جيدة يمكن ملاحظتها عندما قطعة الكبد هو لون أخف وزنا طوال الوقت.
6. الحفاظ على قطعة رطبة خلال الكبد نضح من خلال تغطية بقطعة من الشاش غارقة في المياه المالحة.
7. يروي مع 1 لتر من محلول 1 إلى طرد أي صemaining الدم في قطعة الكبد.
8. تغيير السائل نضح إلى الحل 2 ويروي لمدة 10 دقيقة.
9. تبديل السائل نضح إلى الحل 3 ويروي مع 0.5 L.
10. تغيير السائل نضح إلى الحل 4، والذي يحتوي على 0.1-0.15٪ من كولاجيناز (الجدول 2).
11. لهذه الخطوة، ينبغي أن يتم نضح بطريقة إعادة تدوير ل9-12 دقيقة أو حتى يتم هضمها الكبد بما فيه الكفاية، ويجب أن تظهر أنسجة الكبد لتحطيم قليلا تحت الكبسولة في غليسون ويشعر خففت عند بحثها مع الجانب صريحا ل مشرط.

4. عزل خلايا الكبد

1. إيقاف المضخة تحوي وإزالة حقنة عادية من قطعة الكبد.
2. وضع قطعة الكبد في طبق بلورة تحتوي على 100-200 مل من محلول 5.
3. إزالة كبسولة من غليسون بعناية وبلطف نفض الخلايا. إذا كانت هناك مناطق لا و perfused جيدا، مشرط يمكن استخدامها لقطع طريقهذه المناطق للافراج عن الخلايا الموجودة داخل. إضافة المزيد من الحلول 5 حسب الحاجة أثناء العملية.
4. إضافة المزيد من الحلول 5 حتى يتم التوصل إلى الحجم النهائي من 500 مل.
5. تصفية تعليق الخلية مرتين، أولا من خلال شبكة 210 ميكرون النايلون تليها 70 ميكرومتر شبكة النايلون. المقبل، صب تعليق خلية في 200 مل أنابيب الطرد المركزي.
6. الطرد المركزي تعليق خلية في 72 جرام لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. طاف نضح وبيليه خلية في resuspend بلطف بلطف في 200 مل من محلول 5.
7. تكرار غسل الخطوة رقم 4.6 ثلاث مرات. على الخطوة النهائية أجهزة الطرد المركزي، وخلايا resuspend في حلول التخزين البارد (انظر قائمة المواد). يجب أن تكون الخلايا تقريبا 2-5000000 خلايا الكبد في الملليمتر الواحد لتقييم العائد والجدوى باستخدام التريبان الأزرق الاستبعاد مقايسة القائم على عدادة الكريات.
8. لإجراء التريبان الأزرق الاستبعاد مقايسة، إضافة 0.1 مل من الخلايا تضعف بشكل مناسب (2-5000000 ≈ / مل) إلى أنبوب microfuge تحتوي على 0.5 مل من soluti الأزرق التريبانعلى (0.4٪ التريبان الأزرق الذائبة في الفوسفات مخزنة المالحة (PBS)) و 0.4 مل من برنامج تلفزيوني. بعد خلط تعليق خلية بدقة، تحميل عدادة الكريات مع تعليق ودراسة تحت المجهر في التكبير 100X. تحت المجهر، وسوف تكون ملطخة الخلايا الميتة الأزرق في حين تظهر الخلايا الحية غير ملوثين. حساب عدد الخلايا الحية وإجمالي في كل من 1 مم ² شبكات ملحوظ على عدادة الكريات. الجدوى (٪)، العائد من الخلايا الحية (خلايا الكبد مليون لكل مل حل التخزين البارد (CSS) أو خلايا الكبد مليون في الكبد ز) يمكن حسابها باستخدام الصيغ أدناه.

ملاحظة: في هذه الحالة، فإن عامل التخفيف التريبان الأزرق هو 10 وعامل عدادة الكريات هو 10،000.

النتائج

الإعداد التروية

يجب تعيين المعدات اللازمة لنضح الكبد حتى وفقا لالشكل 1.

الجدوى والعائد من خلايا الكبد البشرية المعزولة

كان متوسط ​​بقاء خلايا الك...

Discussion

النتائج هذا البروتوكول في عزلة خلايا الكبد البشرية مع قابلية عالية ونقاء. من أجل تحقيق هذه النتائج، فمن المهم أن تبدأ مع قطعة مناسبة من الكبد. قطعة من الكبد وينبغي أن يكون الكبسولة سليمة غليسون على جميع الأسطح باستثناء 1 قطع السطح. عامل مهم آخر هو دفعة معينة من كولاجين...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bubble trap	Gaßner Glastechnik
Glass jacketed condenser	Gaßner Glastechnik
41 °C Water bath	Julabo	35723-H24/EG
37 °C Water bath	GFL	1083
Compressed gas cylinder (95 % O2/5 % CO2)	Linde
Gas permeable tubing	Neolab	2-4440
Peristaltic pump	Ismatec	IP65
Scalpel	Feather	320010
Forceps	Omnilab	5171014
Conical flasks 1 L	Schott Duran	2121654
Conical flasks 5 L	Schott Duran	2121673
Beakers	Schott Duran	2110654
200 ml centrifuge tubes	Becton Dickinson	352075
Crystallizing dish	Omnilab	5144063
Curved irrigation cannulae with ball tips	Ernst Kratz GmbH	1464LL/ 1465LL A+B/ 1472LL
Micro vascular clamps	Ernst Kratz GmbH
Büchner funnel	Carl Roth	HT38.1
Nylon mesh 210 μm	Neolab	4-1413
Nylon mesh 70 μm	Neolab	4-1419
0.22 μm sterile filters	Peske	99505
500 ml bottles	Schott Duran	2180144
1 L bottles	Schott Duran	2180154
Hemocytometer	Peske	06-0001
1.5 ml tubes	Eppendorf	0030 120,086
50 ml conical tubes	BD Biosciences	352070
Ice bucket	Neolab	1508454
Sterile Pasteur pipettes	Brand	747715
Motorised pipette filler (Pipette boy acu)	Integra	155017
Refridgerated centrifuge	Eppendorf	5810R
Laminar flow	Kendro	Hera safe-KS9
Aspirator (Low-flow surgical suction pump)	Atmos	C361
Laboratory Gas Burner	Integra	Fire Boy eco
Disposable laboratory coat	Paperlynen GmbH	MD0202414
Surgical mask with visor	Kimberly-Clark	48247
Surgical hood	Barrier	42072
Latex gloves	Semper Care	CE0321
Collagenase (Batch number NB 4G)	Serva	17465
Calcium chloride dihydrate	Merck	2382
EGTA	Sigma	E4378
Sodium chloride	Roth	9265.2
Hepes	Roth	9105.3
Potassium chloride	Serva	26868
Albumin	Biomol	01400-2
Glucose	Serva	22700
Sodium hydrogen carbonate	Serva	30180
0.4% Trypan blue solution	Lonza	17-942E
Cold storage solution	Hepacult GmbH