Выделение гепатоцитов человека два-ступенчатой ​​коллагеназы процедуры перфузионный

Резюме

Модифицированная двухэтапной процедуры коллагеназы перфузии для изоляции гепатоцитов человека описывается. Этот метод может быть также применен к другим печени млекопитающих. Выделенные гепатоциты доступны с высоким выходом и жизнеспособности, что делает их удобной моделью для научных исследований в таких областях, как регенерации печени, фармакокинетики и токсикологии.

Аннотация

Печень, орган с исключительной мощностью регенерации, выполняет широкий спектр функций, таких как детоксикации, метаболизма и гомеостаза. Таким образом, гепатоциты являются важной моделью для большого разнообразия исследовательских вопросов. В частности, использование человеческих гепатоцитов особенно важно в области фармакокинетики, токсикологии, регенерации печени и трансляционных исследований. Таким образом, этот способ представляет собой модифицированную версию процедуры коллагеназы перфузии двухступенчатой ​​чтобы изолировать гепатоциты, как описано Seglen ^1.

Ранее, гепатоциты были выделены с помощью механических методов. Тем не менее, ферментативные способы, как было показано, чтобы быть выше как гепатоциты сохраняют свою структурную целостность и функцию после выделения. Этот метод представлен здесь адаптирует метод, предназначенный ранее для печени крыс к человеческим кусочки печени и приводит к большим выходом гепатоцитов с жизнеспособностью 77 ± 10%. ОсновнойРазница в этой процедуре является процесс cannulization кровеносных сосудов. Кроме того, способ, описанный здесь, также могут быть применены к печени от других видов с печени или кровеносных сосудов, сравнимых размеров.

Введение

Суспензию клеток печени могут быть получены из печени с помощью механических или ферментативными методами. Механические методы, используемые для получения целые клетки печени включают заставляя печень через марлю ^2, качая кусок печени со стеклянными шариками в шейкере Кан ^3, используя стеклянные гомогенизаторы со свободными пестики ^4,5 и т.д. На протяжении многих лет, механические методы выпали из пользу в связи с повреждением клеточных мембран и потери функции изолированных гепатоцитов ^6,7. Следовательно, использование ферментативного метода в настоящее время является основным методом изоляции гепатоцитов.

Выделение гепатоцитов с использованием способа ферментативной была значительно улучшена, когда Берри и друзья ⁸ перфузии коллагеназы и гиалуронидазы через печень через портальную вену у крыс. Этот процесс перфузии использовали сосудистую чтобы позволить ферменты входить в тесный контакт с большинством клеток, что приводит кувеличение в 6 раз с выходом гепатоцитов ^8. Кроме того, этот метод дает клетки, которые сохранили свои структурную целостность, практически без трансформации эндоплазматической сети в изолированных пузырьков и без повреждений митохондриальной ^8.

Этот метод был модифицирован Seglen ^1, который впервые процедуру двухэтапного перфузии для выделения клеток печени. В этой процедуре печени крысы перфузии с Ca ^{2 +} свободного буфера с последующим перфузии буфер коллагеназы, содержащего Са ^{2 + 1.} Удаление Ca ^{2 +} на первой стадии помогает разрушить десмосомы, в то время как добавление Ca ^{2 +} на втором этапе требуется для оптимальной активности коллагеназы ^1,9.

Учитывая, что опубликованная работа описано выше была выполнена на крысах, эта статья призвана продемонстрировать, модифицированной методики, которую можно использовать для выделения гепатоцитов с высокой жизнеспособностью от гулаА.Н. печень. Использование гепатоцитов человека остается важным для трансляционных исследований и для проверки эксперименты с использованием животных моделей. Человеческие частей печени используемые в этом исследовании были приобретены с согласия для управления через ткани человека и Cell Research Foundation в, контролируемой государством некоммерческого фонда ^10. После патологоанатом удалены, что требовалось для диагностики, куски печени были собраны из оставшейся ткани. Ткань секционного патологоанатом был морфологически здоровые ткани получают из резекции после резекции печени.

протокол

1. Подготовка перфузии и изоляция Решения

1. Подготовка растворов, необходимых для перфузии части печени и выделения гепатоцитов соответствии с таблицей 1. Растворы можно хранить при 4 ° С до использования.
2. Стерильный фильтр все решения с использованием 0,22 мкм.
3. Все растворы, которые вступают в контакт с печени должны быть стерильными.

2. Подготовка перфузии оборудования и решений

1. Оборудование для перфузии части печени должны быть созданы, как показано на рисунке 1.
2. Водяная баня должна быть установлена ​​при соответствующей температуре, которая отличается в каждом конкретном экспериментальной установки, например, что решения при температуре 37 ° С, когда они достигают кусок печени. В этом случае водяной бани устанавливается на 41 ° С, чтобы нагреть растворов 1, 2 и 3 и рубашкой стекло конденсатора. Решение 4 должны быть прогреты до37 ° C в отдельном водяной бане в течение использования, чтобы уменьшить потери активности коллагеназы.
3. Незадолго до перфузии печени, включите регулятора газового резервуара, содержащего 95% O _2/5% CO ₂ на газ оксигенации аппарат (рис. 1д).

3. Перфузия печени

1. Кусок печени с такой же неповрежденной капсулы Глиссона насколько возможно, а в идеале с только 1 поверхности разреза должно быть получено от патологоанатома для перфузии.
2. Поместите этот кусок печени на воронке Бюхнера, который содержит перфорированную фильтра диск (рис. 1В).
3. Система перфузии следует загрунтовать Решение 1.
4. С низкой скоростью потока, изогнутые орошения канюли с оливковыми советы должны быть вставлены в больших кровеносных сосудов на поверхности разреза куска печени. Как кровь вымывает из печени, ткань становится светлее в местах с хорошей перфузии. Используется для различных размеров количество канюлииз печени показано на рисунке 2А. Размер калибра выбрали должно привести к плотного прилегания, который будет содержать канюли на месте. Меньшие кровеносные сосуды следует оставить открытым для буфера перфузии для слива из куска печени.
5. Увеличение скорости потока на перистальтического насоса к между 110-460 мл / мин в зависимости от размера печени (рис. 2В). Это приводит к средней скорости потока 44 ± 16 мл / мин на канюли (рис. 2в). Скорость выбирается в зависимости от куска печени и должно привести к небольшим уплотняет до куска печени. В некоторых случаях это может быть необходимо, чтобы зажать закрыть некоторые из открытых сосудах с микро сосудистых зажимов для достижения небольшое уплотняет упомянутую выше. Хороший перфузии можно наблюдать, когда часть печени является светлый цвет во всем.
6. Держите кусок печени влажный во перфузии с помощью покрытия из кусочком марли, смоченной в солевом растворе.
7. Заливать 1 л раствора 1, чтобы избавиться от любого гemaining кровь в куске печени.
8. Изменение перфузионной жидкости к раствору 2 и заливать в течение 10 мин.
9. Переключите перфузии жидкости для решения 3 и заливать 0,5 L.
10. Изменение перфузионной жидкости к решению 4, который содержит 0,1-0,15% от коллагеназы (табл. 2).
11. На этом этапе, перфузии следует проводить в рециркуляционной образом в течение 9-12 мин или до тех пор, печень не достаточно переваривается; ткани печени должен появиться распадаться слегка под капсулой Глиссона и чувствовать размягчается при зондировании тупой стороной скальпель.

4. Выделение гепатоцитов

1. Выключите перистальтического насоса и снимите канюли из куска печени.
2. Поместите часть печени в кристаллизатор, содержащей 100-200 мл раствора 5.
3. Осторожно снимите капсулу в Глиссона и осторожно вытряхнуть клетки. Если есть регионы, которые недостаточно хорошо перфузии, скальпель может быть использован, чтобы прорезатьэти регионы, чтобы освободить клетки, содержащиеся в. Добавьте больше решение 5, как необходимо в процессе.
4. Добавить еще решение 5 до конечного объема 500 мл пока не будет достигнута.
5. Фильтр клеточной суспензии дважды: сначала через 210 мкм нейлоновую сетку с последующим нейлоновое сито 70 мкм. Затем залить клеточной суспензии в 200 мл центрифужные пробирки.
6. Центрифуга клеточной суспензии в 72 г в течение 5 мин при 4 ° С. Аспирируйте супернатант и осторожно ресуспендируют осадок клеток осторожно в 200 мл раствора 5.
7. Повторите стиральную номер шага 4,6 три раза. На последнем шаге центрифуги, ресуспендирования клеток в холодной решение для хранения данных (см. перечень материалов). Клетки должны быть примерно 2-5 млн. гепатоциты на миллилитр для оценки вылова и жизнеспособности с помощью гемоцитометра основе трипановым голубым.
8. Для проведения теста с трипановым голубым, добавить 0,1 мл соответственно разбавленных клеток (млн. ≈ 2-5 / мл) в пробирке, содержащей 0,5 мл трипанового синего Solutiна (0,4% трипанового синего растворяли в фосфатно-солевом буфере (PBS)) и 0,4 мл PBS. После перемешивания клеточной суспензии тщательно, загрузить гемоцитометра с подвеской и исследовать под микроскопом при 100-кратном увеличении. Под микроскопом, мертвые клетки будут окрашен в голубой цвет в то время как живые клетки появляются неокрашенными. Подсчитайте количество живых и общего числа клеток в каждом из 1 мм ² сеток, отмеченных на гемоцитометре. Жизнеспособность (%), выход живых клеток (млн. гепатоциты в мл раствора холодильной (CSS) или миллион гепатоциты в г печени) можно рассчитать, используя приведенные ниже формулы.

Примечание: В этом случае трипанового синего коэффициент разбавления 10 и фактор гемоцитометр составляет 10000.

Результаты

Перфузии установки

Оборудование, необходимое для перфузии печени должны быть созданы в соответствии с рисунком 1.

Жизнеспособность и Выход выделенного гепатоциты человека

Средняя жизнеспособность изолированных гепатоци?...

Обсуждение

Этот протокол приводит к выделению гепатоцитов человека с высокой жизнеспособности и чистоты. Для достижения этих результатов, важно, чтобы начать с соответствующим кусочком печени. Кусок печени должны иметь капсулу нетронутыми Глиссона в на всех поверхностях в течение 1 поверхности ...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bubble trap	Gaßner Glastechnik
Glass jacketed condenser	Gaßner Glastechnik
41 °C Water bath	Julabo	35723-H24/EG
37 °C Water bath	GFL	1083
Compressed gas cylinder (95 % O2/5 % CO2)	Linde
Gas permeable tubing	Neolab	2-4440
Peristaltic pump	Ismatec	IP65
Scalpel	Feather	320010
Forceps	Omnilab	5171014
Conical flasks 1 L	Schott Duran	2121654
Conical flasks 5 L	Schott Duran	2121673
Beakers	Schott Duran	2110654
200 ml centrifuge tubes	Becton Dickinson	352075
Crystallizing dish	Omnilab	5144063
Curved irrigation cannulae with ball tips	Ernst Kratz GmbH	1464LL/ 1465LL A+B/ 1472LL
Micro vascular clamps	Ernst Kratz GmbH
Büchner funnel	Carl Roth	HT38.1
Nylon mesh 210 μm	Neolab	4-1413
Nylon mesh 70 μm	Neolab	4-1419
0.22 μm sterile filters	Peske	99505
500 ml bottles	Schott Duran	2180144
1 L bottles	Schott Duran	2180154
Hemocytometer	Peske	06-0001
1.5 ml tubes	Eppendorf	0030 120,086
50 ml conical tubes	BD Biosciences	352070
Ice bucket	Neolab	1508454
Sterile Pasteur pipettes	Brand	747715
Motorised pipette filler (Pipette boy acu)	Integra	155017
Refridgerated centrifuge	Eppendorf	5810R
Laminar flow	Kendro	Hera safe-KS9
Aspirator (Low-flow surgical suction pump)	Atmos	C361
Laboratory Gas Burner	Integra	Fire Boy eco
Disposable laboratory coat	Paperlynen GmbH	MD0202414
Surgical mask with visor	Kimberly-Clark	48247
Surgical hood	Barrier	42072
Latex gloves	Semper Care	CE0321
Collagenase (Batch number NB 4G)	Serva	17465
Calcium chloride dihydrate	Merck	2382
EGTA	Sigma	E4378
Sodium chloride	Roth	9265.2
Hepes	Roth	9105.3
Potassium chloride	Serva	26868
Albumin	Biomol	01400-2
Glucose	Serva	22700
Sodium hydrogen carbonate	Serva	30180
0.4% Trypan blue solution	Lonza	17-942E
Cold storage solution	Hepacult GmbH