Isolement des hépatocytes humains par un deux-étape collagénase procédure de perfusion

Résumé

Une procédure en deux étapes de la collagénase de perfusion modifié pour l'isolement d'hépatocytes humains est décrit. Cette méthode peut également être appliquée à d'autres foies de mammifères. Les hépatocytes isolés sont disponibles en haute rendement et la viabilité, les un modèle approprié pour la recherche scientifique dans des domaines tels que la régénération du foie, la pharmacocinétique et la toxicologie faire.

Résumé

Le foie, un organe d'une capacité de régénération exceptionnelle, effectue un large éventail de fonctions, telles que la désintoxication, le métabolisme et l'homéostasie. En tant que tel, les hépatocytes sont un modèle important pour une grande variété de questions de recherche. En particulier, l'utilisation d'hépatocytes humains est particulièrement important dans les domaines de la pharmacocinétique, la toxicologie, la régénération du foie et de la recherche de translation. Ainsi, ce procédé présente une version modifiée d'une procédure de perfusion de collagénase en deux étapes pour isoler les hépatocytes, comme décrit par ^une Seglen.

Auparavant, les hépatocytes ont été isolés par des méthodes mécaniques. Cependant, les méthodes enzymatiques ont été montré supérieur hépatocytes conservent leur intégrité et leur fonction structurale après isolement. Cette méthode présentée ici adapte le procédé précédemment conçu pour les foies de rats à des pièces et des résultats de foie humain dans un grand rendement des hépatocytes avec une viabilité de 77 ± 10%. Le principaldifférence de ce procédé est le processus de cannulization des vaisseaux sanguins. En outre, le procédé décrit ici peut également être appliquée à des foies provenant d'autres espèces avec foie ou des vaisseaux sanguins de tailles comparables.

Introduction

Une suspension de cellules de foie peut être préparé à partir du foie par des méthodes mécaniques ou enzymatiques. Les méthodes mécaniques utilisées pour préparer les cellules du foie entier comprennent forcer le foie à travers une étamine ^2, secouant un morceau de foie avec des perles de verre dans un shaker Kahn ^3, en utilisant des homogénéisateurs de verre avec des pilons en vrac ^4,5 etc Au fil des ans, les méthodes mécaniques ont baissé de favoriser raison des dommages à la membrane cellulaire et la perte de la fonction des hépatocytes isolés ^6,7. Par conséquent, l'utilisation d'un procédé enzymatique est actuellement la principale méthode pour l'isolement d'hépatocytes.

L'isolement des hépatocytes en utilisant une méthode enzymatique a été considérablement améliorée lorsque Berry et Friend ⁸ perfusées la collagénase et la hyaluronidase dans le foie via la veine porte chez des rats. Ce processus de perfusion utilisé le système vasculaire pour permettre aux enzymes de venir en contact étroit avec la majorité des cellules, conduisant àune augmentation de 6 fois le rendement des hépatocytes ^8. En outre, cette méthode a donné des cellules qui ont conservé leur intégrité structurelle, avec pratiquement aucune transformation de réticulum endoplasmique dans des vésicules isolées et aucun dommage mitochondrial ^8.

Cette méthode a été modifiée par ^une Seglen, pionnier une procédure de perfusion en deux étapes pour l'isolation des cellules du foie. Dans cette procédure, le foie de rat est perfusé avec un tampon ^{2 +} Ca libre suivie d'une perfusion avec un tampon contenant de la collagénase de Ca ^{2 + 1.} L'élimination de Ca ^{2 +} dans la première étape permet de perturber les desmosomes, tandis que l'addition de Ca ^{2 +} dans la deuxième étape est requise pour l'activité de la collagénase ^1,9 optimum.

Étant donné que les travaux publiés décrite ci-dessus a été réalisée chez le rat, cet article vise à démontrer une procédure modifiée qui peut être utilisé pour l'isolement des hépatocytes avec une grande viabilité de bourdonnementun foie. L'utilisation d'hépatocytes humains reste important pour la recherche de translation et de validation des expériences utilisant des modèles animaux. Les morceaux de foie humain utilisés dans cette étude ont été acquis avec le consentement de la gouvernance à travers la Fondation de tissus humains et de cellules de recherche, une fondation contrôlée par l'État à but non lucratif ^10. Après un pathologiste supprimé ce qui était nécessaire pour le diagnostic, des morceaux de foie ont été prélevés dans le tissu restant. Le tissu sectionnée par le pathologiste était morphologiquement tissus sains obtenus à partir des marges de résection après résection hépatique.

Protocole

Une. Préparation de la perfusion et l'isolement Solutions

1. Préparer les solutions nécessaires pour la perfusion de la pièce de foie et de l'isolement des hépatocytes, conformément au tableau 1. Les solutions peuvent être stockées à 4 ° C jusqu'à utilisation.
2. Filtre stérile toutes les solutions en utilisant un filtre de 0,22 um.
3. Toutes les solutions qui viennent en contact avec le foie doivent être stériles.

2. Préparation de l'équipement et des solutions de perfusion

1. L'équipement pour la perfusion de la pièce de foie doit être mis en place comme représenté sur la figure 1.
2. Le bain d'eau doit être réglée à une température appropriée, qui est différent dans chaque montage expérimental particulier, tel que les solutions sont à la température de 37 ° C quand ils atteignent la pièce de foie. Dans ce cas, le bain d'eau est réglée à 41 ° C pour chauffer les solutions 1, 2 et 3 et le condenseur en verre à double enveloppe. Solution 4 doit être réchauffé à37 ° C dans un bain d'eau séparée pour utilisation pour réduire la perte d'activité de la collagénase.
3. Peu de temps avant la perfusion du foie, mettez le régulateur du réservoir de gaz contenant 95% d'O _2/5% de CO ₂ au gaz de l'appareil d'oxygénation (figure 1E).

3. Perfusion du foie

1. Un morceau de foie avec autant capsule intacte de Glisson que possible et idéalement avec une surface de seulement 1 coupe doit être obtenue à partir d'un pathologiste pour perfusion.
2. Placer cette pièce de foie sur l'entonnoir Büchner qui contient un disque de filtre perforé (figure 1B).
3. Le système de perfusion doit être amorcée avec la solution 1.
4. Avec une vitesse d'écoulement faible, incurvée canules d'irrigation avec des embouts d'olive doit être inséré dans les vaisseaux sanguins plus grands sur la surface de la pièce de foie de coupe. Comme le sang évacue par le foie, le tissu devient plus léger dans les zones avec une bonne perfusion. Le nombre de canules utilisées pour différentes taillesdes foies est représenté sur la figure 2A. La taille de la jauge choisie devrait se traduire par un ajustement confortable qui tiendra les canules à la place. Les vaisseaux sanguins plus petits doivent être laissés ouverts pour le tampon de perfusion à s'écouler hors de la pièce de foie.
5. Augmenter le débit de la pompe péristaltique à entre 110 à 460 ml / min selon la taille du foie (Figure 2B). Il en résulte un débit moyen de 44 ± 16 ml / min par la canule (figure 2C). La vitesse choisie est fonction de la pièce de foie et devrait se traduire par une légère repulpant place de la pièce de foie. Dans certains cas, il peut être nécessaire de serrer fermer certains des récipients ouverts avec des micro clamps vasculaires pour atteindre la légère repulpant mentionné ci-dessus. Une bonne perfusion peut être observé lorsque la pièce de foie est une couleur plus claire partout.
6. Gardez la pièce humide du foie pendant la perfusion en le recouvrant d'un morceau de gaze trempé dans une solution saline.
7. Perfuser avec 1 L de solution 1 pour débusquer tout remaining sang dans la pièce du foie.
8. Changer le liquide de perfusion à la solution 2 et perfuser pendant 10 min.
9. Commuter le liquide de perfusion pour perfuser la solution 3 et avec 0,5 L.
10. Changer le liquide de perfusion de la solution 4, qui contient de 0,1 à 0,15% de collagénase (Tableau 2).
11. Pour cette étape, la perfusion doit être effectuée de manière à recirculation pour 9-12 minutes ou jusqu'à ce que le foie est suffisamment digéré, le tissu du foie devrait apparaître à briser un peu moins de la capsule de Glisson et sentir ramolli lorsque sondé avec le côté émoussé d'un scalpel.

4. Isolement des hépatocytes

1. Arrêter la pompe péristaltique et retirer les canules de la pièce de foie.
2. Placez le morceau de foie dans un cristallisoir contenant 100-200 ml de solution 5.
3. Retirez la capsule de Glisson soigneusement et secouez doucement les cellules. Si il ya des régions qui ne sont pas bien perfusés, un scalpel peut être utilisé pour couper à traversces régions pour libérer les cellules contenues à l'intérieur. Ajouter plus de solutions 5 au besoin pendant le processus.
4. Ajouter plus de solution 5 jusqu'à un volume final de 500 ml est atteinte.
5. Filtrer la suspension de cellules à deux reprises, d'abord à travers une maille de 210 um de nylon suivi d'un filet de nylon de 70 um. Ensuite, versez la suspension de cellules dans 200 ml tubes de centrifugation.
6. Centrifuger la suspension cellulaire à 72 g pendant 5 min à 4 ° C. Aspirer le surnageant et le culot de cellules doucement remis en suspension doucement dans 200 ml de Solution 5.
7. Répéter le lavage numéro de l'étape 4.6 à trois reprises. Sur l'étape de centrifugation finale, les cellules remettre en suspension dans une solution de stockage à froid (voir la liste des matériaux). Les cellules doivent être d'environ 2,5 millions hépatocytes par millilitre pour l'évaluation du rendement et la viabilité en utilisant un trypan test d'exclusion au bleu en fonction de hématimètre.
8. Pour effectuer un test d'exclusion au bleu trypan, ajouter 0,1 ml de cellules diluées de manière appropriée (≈ 2-5 millions / ml) dans un tube de centrifugeuse contenant 0,5 ml de soluti bleu trypanle (0,4% de bleu trypan dissous dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS)) et 0,4 ml de PBS. Après avoir mélangé la suspension de cellules à fond, charger un hémocytomètre avec la suspension et examiner au microscope à un grossissement de 100X. En microscopie, les cellules mortes seront colorées en bleu tandis que les cellules vivantes apparaissent sans tache. Compter le nombre de cellules vivantes et totales dans chacun des 1 mm ² grilles marquées sur la hématimètre. Viabilité (%), le rendement des cellules vivantes (en millions hépatocytes par une solution de stockage à froid ml (CSS) ou million hépatocytes par g de foie) peut être calculé en utilisant les formules ci-dessous.

Remarque: Dans ce cas, le bleu trypan facteur de dilution est de 10 et le facteur de hématimètre est 10000.

Résultats

Configuration de perfusion

L'équipement requis pour la perfusion du foie doit être mis en place selon la figure 1.

Viabilité et le rendement des hépatocytes humains isolés

La viabilité moyenne des hépatocytes humains isolés était de 77 ± 10% et le rendement moyen des hépatocytes était de 13 ± 11 millions hépatocytes / g de foie, avec des valeurs exprimées en moyenne ± écart-type. Le nombre d'isoleme...

Discussion

Ce protocole conduit à l'isolement d'hépatocytes humains à forte viabilité et de la pureté. Afin de parvenir à ces résultats, il est important de commencer par une pièce appropriée de foie. Le morceau de foie devrait avoir la capsule de Glisson intact sur toutes les surfaces à l'exception de une surface de coupe. Un autre facteur important est le lot particulier de collagénase utilisée, comme différents lots peuvent entraîner des différences marquées dans les viabilités des hépatocytes apr?...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bubble trap	Gaßner Glastechnik
Glass jacketed condenser	Gaßner Glastechnik
41 °C Water bath	Julabo	35723-H24/EG
37 °C Water bath	GFL	1083
Compressed gas cylinder (95 % O2/5 % CO2)	Linde
Gas permeable tubing	Neolab	2-4440
Peristaltic pump	Ismatec	IP65
Scalpel	Feather	320010
Forceps	Omnilab	5171014
Conical flasks 1 L	Schott Duran	2121654
Conical flasks 5 L	Schott Duran	2121673
Beakers	Schott Duran	2110654
200 ml centrifuge tubes	Becton Dickinson	352075
Crystallizing dish	Omnilab	5144063
Curved irrigation cannulae with ball tips	Ernst Kratz GmbH	1464LL/ 1465LL A+B/ 1472LL
Micro vascular clamps	Ernst Kratz GmbH
Büchner funnel	Carl Roth	HT38.1
Nylon mesh 210 μm	Neolab	4-1413
Nylon mesh 70 μm	Neolab	4-1419
0.22 μm sterile filters	Peske	99505
500 ml bottles	Schott Duran	2180144
1 L bottles	Schott Duran	2180154
Hemocytometer	Peske	06-0001
1.5 ml tubes	Eppendorf	0030 120,086
50 ml conical tubes	BD Biosciences	352070
Ice bucket	Neolab	1508454
Sterile Pasteur pipettes	Brand	747715
Motorised pipette filler (Pipette boy acu)	Integra	155017
Refridgerated centrifuge	Eppendorf	5810R
Laminar flow	Kendro	Hera safe-KS9
Aspirator (Low-flow surgical suction pump)	Atmos	C361
Laboratory Gas Burner	Integra	Fire Boy eco
Disposable laboratory coat	Paperlynen GmbH	MD0202414
Surgical mask with visor	Kimberly-Clark	48247
Surgical hood	Barrier	42072
Latex gloves	Semper Care	CE0321
Collagenase (Batch number NB 4G)	Serva	17465
Calcium chloride dihydrate	Merck	2382
EGTA	Sigma	E4378
Sodium chloride	Roth	9265.2
Hepes	Roth	9105.3
Potassium chloride	Serva	26868
Albumin	Biomol	01400-2
Glucose	Serva	22700
Sodium hydrogen carbonate	Serva	30180
0.4% Trypan blue solution	Lonza	17-942E
Cold storage solution	Hepacult GmbH