Isolierung von humanen Hepatozyten durch eine Zwei-Schritt-Verfahren Collagenase Perfusion

Zusammenfassung

Eine modifizierte Zwei-Schritt-Kollagenase-Perfusion Verfahren zur Isolierung von humanen Hepatozyten beschrieben. Dieses Verfahren kann auch auf andere Säugetierlebern, angewendet werden. Die isolierten Hepatozyten sind in hoher Ausbeute und Lebensfähigkeit, so dass sie ein geeignetes Modell für die wissenschaftliche Forschung in Bereichen wie der Leberregeneration, Pharmakokinetik und Toxikologie.

Zusammenfassung

Die Leber, ein Organ mit einer außergewöhnlichen Regenerationsfähigkeit, führt eine breite Palette von Funktionen, wie zB Entgiftung, Stoffwechsel und Homöostase. Als solche sind Hepatozyten ein wichtiges Modell für eine große Vielfalt von Forschungsfragen. Insbesondere ist die Verwendung von humanen Hepatozyten in den Bereichen Pharmakokinetik, Toxikologie, Leberregeneration und translationale Forschung besonders wichtig. Somit stellt dieses Verfahren eine modifizierte Version einer Zwei-Schritt-Verfahren, um Collagenase-Perfusion isoliert Hepatozyten durch Seglen ¹ beschrieben.

Früher wurden Hepatozyten durch mechanische Methoden isoliert. Allerdings haben enzymatischen Methoden wurde gezeigt, überlegen zu sein, wie Hepatozyten nach Isolierung behalten ihre strukturelle Integrität und Funktion. Das hier vorgestellte Verfahren passt sich das Verfahren bisher für Rattenlebern der menschlichen Leber Teile und führt zu einer großen Ausbeute von Hepatozyten mit einer Lebensfähigkeit von 77 ± 10% bestimmt. Der HauptUnterschied in diesem Verfahren ist das Verfahren der cannulization der Blutgefäße. Weiterhin kann das hier beschriebene Verfahren auch auf andere Arten von Lebern mit vergleichbaren Leber-und Blutgefäßgrößen angewendet werden.

Einleitung

Eine Leberzellsuspension aus der Leber durch mechanische oder enzymatische Verfahren hergestellt werden. Mechanische Verfahren verwendet werden, um ganze Leberzellen herzustellen, umfassen die Leber zwingt durch Gaze ^2, schüttelt ein Leberstück mit Glasperlen in einem Kahn Schüttler ^3, mit Glas-Homogenisatoren mit losen Stößel ^4,5 usw. Im Laufe der Jahre haben mechanische Methoden aus gefallen begünstigen aufgrund der Schäden an Zellmembranen und der Verlust der Funktion der isolierten Hepatozyten ^6,7. Folglich ist die Verwendung eines enzymatischen Verfahrens derzeit die wichtigste Methode zur Isolierung von Hepatozyten.

Isolation von Hepatozyten mit einem enzymatischen Verfahren wurde stark verbessert, wenn Berry und Friend ⁸ durchströmt Kollagenase und Hyaluronidase durch die Leber über die Pfortader in Ratten. Dieses Verfahren verwendet die Perfusion Gefßsystem zu ermöglichen, dass die Enzyme in engen Kontakt mit der Mehrzahl der Zellen kommen, was zueine 6-fache Zunahme der Ausbeute an Hepatozyten ^8. Weiterhin ergab diese Methode Zellen, die ihre strukturelle Integrität beibehalten, praktisch ohne Transformation des endoplasmatischen Reticulum in isolierte Bläschen und ohne mitochondriale Schädigungen ^8.

Diese Methode wurde von Seglen ^1, die eine Zwei-Schritt-Verfahren für die Durchblutung der Leber Zellisolierung Pionier modifiziert. In diesem Verfahren wird der Rattenleber mit einem Ca ^{2 +-freien} Puffer, gefolgt von einer Perfusion mit Kollagenase-Puffer, enthaltend Ca ^{2 + 1} perfundiert. Die Entfernung von Ca ^{2 +} in der ersten Stufe hilft dabei, Desmosomen zu stören, während die Zugabe von Ca ^{2 +} in der zweiten Stufe ist für eine optimale Collagenaseaktivität ^1,9 erforderlich.

Da die oben beschriebenen veröffentlichte Arbeit wurde bei Ratten durchgeführt wurde, versucht dieser Artikel ein modifiziertes Verfahren, die für die Isolierung von Hepatozyten mit hoher Rentabilität von Summen verwendet werden können, zeigen,Leber ein. Die Verwendung von humanen Hepatozyten bleibt wichtig für die translationale Forschung und für die Validierung von Versuchen mit Tiermodellen. Die menschliche Leber Stücke in dieser Studie verwendet wurden mit Zustimmung der Governance durch das Human Tissue and Cell Research Foundation, einer staatlich kontrollierten Non-Profit-Stiftung ¹⁰ erworben. Nach ein Pathologe entfernt, was für die Diagnose erforderlich ist, wurden Leberstücke aus dem verbleibenden Gewebe gesammelt. Die durch den Pathologen geschnittene Gewebe wurde morphologisch nach Leberresektion von Resektionsränder erhalten gesunden Gewebe.

Protokoll

1. Vorbereitung der Perfusion und Isolation Lösungen

1. Vorbereitung der für die Durchblutung der Leber Stück und die Isolierung von Hepatozyten nach Tabelle 1 erforderlichen Lösungen. Lösungen bei 4 ° C bis zur Verwendung gelagert werden.
2. Sterilfilter alle Lösungen mit einem 0,22 um Filter.
3. Alle Lösungen, die in Kontakt mit der Leber kommen sollte steril sein.

2. Vorbereitung der Perfusion Geräte und Lösungen

1. Die Ausrüstung für die Durchblutung der Leber Stück sollte wie in Abbildung 1 gezeigt, eingestellt werden.
2. Das Wasserbad sollte bei einer geeigneten Temperatur, die in jedem einzelnen Versuchsaufbau unterschiedlich ist, so eingestellt werden, dass die Lösungen bei der Temperatur von 37 ° C, wenn sie die Leber Stück zu erreichen. In diesem Fall wird das Wasserbad auf 41 ° C eingestellt, um die Lösungen 1, 2 und 3 und die ummantelten Glaskühler wärmen. Lösung 4 sollte erwärmt werden37 ° C in einem separaten Wasserbad für den Verlust von Kollagenase-Aktivität zu reduzieren.
3. Kurz vor Leberperfusion, schalten Sie den Regler der Gastank mit 95% O _2/5% CO _2, um die Sauerstoffgerät (1E) Gas.

3. Perfusion der Leber

1. Eine Leberstück mit so viel Glisson-Kapsel intakt wie möglich und im Idealfall mit nur 1 Schnittfläche sollte von einem Pathologen zur Perfusion erzielt werden.
2. Legen Sie diese Leber Stück auf der Büchner-Trichter, die einen perforierten Filterscheibe (Abbildung 1B) enthält.
3. Die Perfusion System sollte mit der Lösung 1 grundiert werden.
4. Mit einer niedrigen Flussrate sollte gekrümmte Bewässerung Kanülen mit Oliven-Tipps in die größeren Blutgefäße auf der Schnittfläche der Leber Stück eingesetzt werden. Wie Blut spült aus der Leber wird das Gewebe leichter in Gebieten mit guter Durchblutung. Die Anzahl der Kanülen für verschiedene Größen verwendetder Leber ist in 2A gezeigt. Die Spurgröße gewählt werden sollte in einer Passform, die die Kanülen in Position zu halten die Folge. Die kleineren Blutgefäßen sollte für die Perfusion Puffer aus der Leber Stück abtropfen offen gelassen werden.
5. Erhöhung der Strömungsgeschwindigkeit an der peristaltischen Pumpe zwischen 110 bis 460 ml / min in Abhängigkeit von der Größe der Leber (Fig. 2B). Dies führt zu einer mittleren Strömungsrate von 44 ± 16 ml / min pro Kanüle (Fig. 2C). Die gewählte Geschwindigkeit hängt von der Leber Stück und sollte in einem leichten Hyalurosmooth Stück der Leber führen. In einigen Fällen kann es notwendig sein, zu klemmen herunter einige der offene Behälter mit Mikrogefäßklemmen, die oben erwähnte leichte Aufpolsterung erzielen. Eine gute Durchblutung beobachtet werden kann, wenn die Leber Stück ist eine hellere Farbe ganz.
6. Halten Sie das Leberstück feucht während der Perfusion durch Abdecken mit einem Stück Gaze in Kochsalzlösung eingeweicht.
7. Perfundieren mit 1 l Lösung 1 zu spülen, keine remaining Blut in der Leber Stück.
8. Ändern Sie den Perfusionsfluid zur Lösung 2 und Perfusion für 10 min.
9. Schalten Sie das Perfusionsfluid zu Lösung 3 und Perfusion mit 0,5 L.
10. Ändern Sie den Perfusionsfluid zu Lösung 4, die von 0,1 bis 0,15% Kollagenase (Tabelle 2) enthält.
11. Für diesen Schritt, Perfusion sollte in einer Umlauf Weise für 9-12 Minuten durchgeführt werden kann oder bis die Leber ausreichend verdaut, das Lebergewebe erscheinen soll unter der Glisson-Kapsel zu leicht auseinander brechen und fühlen sich weich, wenn sie mit der stumpfen Seite einer sondiert Skalpell.

4. Isolierung von Hepatozyten

1. Schalten Sie die Schlauchpumpe und Kanülen entfernen aus der Leber Stück.
2. Legen Sie das Stück Leber in eine Kristallisationsschale mit 100-200 ml Lösung 5.
3. Entfernen der Glisson-Kapsel vorsichtig und sanft schütteln die Zellen. Wenn es Regionen gibt, die nicht gut durchblutet sind, kann ein Skalpell durchtrennt werdendiese Regionen zu den Zellen enthaltenen freizugeben. Fügen Sie weitere Lösung 5 während des Prozesses, wie gebraucht.
4. Noch Lösung 5 bis ein Endvolumen von 500 ml erreicht ist.
5. Filter Zellsuspension zweimal, zunächst durch einen 210 um Nylon-Mesh, gefolgt von einer 70 um Nylon-Mesh. Weiter, gießen Sie die Zellsuspension in 200 ml-Zentrifugenröhrchen.
6. Zentrifugieren der Zellsuspension bei 72 g für 5 min bei 4 ° C. Überstand wird abgesaugt und vorsichtig resuspendieren Zellpellet vorsichtig in 200 ml Lösung 5.
7. Wiederholen Sie den Waschschritt Nummer 4.6 dreimal. Am letzten Zentrifugen Schritt resuspendieren Zellen in Kühllösung (siehe Liste der Materialien). Die Zellen sind etwa 2,5 Millionen Leberzellen pro Milliliter für die Bewertung von Ertrag und Rentabilität mit einer Zählkammer-basierte Trypanblau-Ausschluss-Test sein.
8. Zur Durchführung einer Trypanblau-Ausschluss-Assay, fügen Sie 0,1 ml der entsprechend verdünnten Zellen (≈ 2,5 Millionen / ml) zu einem Mikrozentrifugenröhrchen mit 0,5 ml Trypanblau Löauf (0,4% Trypanblau in mit Phosphat gepufferter Salzlösung (PBS) gelöst) und 0,4 ml PBS. Nach dem Mischen der Zellsuspension gründlich, legen Sie eine Zählkammer mit der Suspension und überprüfen unter dem Mikroskop bei 100-facher Vergrößerung. Unter Mikroskopie, werden die toten Zellen blau gefärbt werden, während die lebenden Zellen ungefärbt erscheinen. Zählen Sie die Anzahl der lebenden Zellen und insgesamt in jedem der 1 mm ² Gitter auf der Hämozytometers markiert. Die Lebensfähigkeit (%), die Ausbeute an lebenden Zellen (Hepatozyten Millionen pro ml kaltem Speicherlösung (CSS) oder Millionen Hepatozyten pro g Leber) können mit den nachfolgenden Formeln berechnet werden.

Anmerkung: In diesem Fall ist 10 die Trypanblau-Verdünnungsfaktor und die Zählkammer Faktor beträgt 10.000.

Ergebnisse

Perfusion-Setup

Die Leberdurchblutung erforderliche Ausrüstung sollte nach 1 gesetzt werden.

Die Lebensfähigkeit und Rendite von isolierten menschlichen Hepatozyten

Die durchschnittliche Lebensfähigkeit von isolierten humanen Hepatozyten betrug 77 ± 10% und die durchschnittliche Rendite der Hepatozyten war 13 ± 11 Millionen Hepatozyten / g Leber, mit Werten als Mittelwert ± Standardabweichung. Die Zahl der Hepatozyten...

Diskussion

Dieses Protokoll führt zu der Isolierung von humanen Hepatozyten mit hohen Lebensfähigkeit und Reinheit. Um diese Ergebnisse zu erzielen, ist es wichtig, mit einem geeigneten Stück Leber starten. Das Stück Leber sollte intakt Glisson-Kapsel auf allen Oberflächen außer ein Schnittfläche haben. Ein weiterer wichtiger Faktor ist die bestimmte Charge von Collagenase verwendet werden, wie verschiedene Chargen können deutliche Unterschiede in der Lebensfähigkeit von Hepatozyten nach Aufschluss ¹¹ führen. ...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bubble trap	Gaßner Glastechnik
Glass jacketed condenser	Gaßner Glastechnik
41 °C Water bath	Julabo	35723-H24/EG
37 °C Water bath	GFL	1083
Compressed gas cylinder (95 % O2/5 % CO2)	Linde
Gas permeable tubing	Neolab	2-4440
Peristaltic pump	Ismatec	IP65
Scalpel	Feather	320010
Forceps	Omnilab	5171014
Conical flasks 1 L	Schott Duran	2121654
Conical flasks 5 L	Schott Duran	2121673
Beakers	Schott Duran	2110654
200 ml centrifuge tubes	Becton Dickinson	352075
Crystallizing dish	Omnilab	5144063
Curved irrigation cannulae with ball tips	Ernst Kratz GmbH	1464LL/ 1465LL A+B/ 1472LL
Micro vascular clamps	Ernst Kratz GmbH
Büchner funnel	Carl Roth	HT38.1
Nylon mesh 210 μm	Neolab	4-1413
Nylon mesh 70 μm	Neolab	4-1419
0.22 μm sterile filters	Peske	99505
500 ml bottles	Schott Duran	2180144
1 L bottles	Schott Duran	2180154
Hemocytometer	Peske	06-0001
1.5 ml tubes	Eppendorf	0030 120,086
50 ml conical tubes	BD Biosciences	352070
Ice bucket	Neolab	1508454
Sterile Pasteur pipettes	Brand	747715
Motorised pipette filler (Pipette boy acu)	Integra	155017
Refridgerated centrifuge	Eppendorf	5810R
Laminar flow	Kendro	Hera safe-KS9
Aspirator (Low-flow surgical suction pump)	Atmos	C361
Laboratory Gas Burner	Integra	Fire Boy eco
Disposable laboratory coat	Paperlynen GmbH	MD0202414
Surgical mask with visor	Kimberly-Clark	48247
Surgical hood	Barrier	42072
Latex gloves	Semper Care	CE0321
Collagenase (Batch number NB 4G)	Serva	17465
Calcium chloride dihydrate	Merck	2382
EGTA	Sigma	E4378
Sodium chloride	Roth	9265.2
Hepes	Roth	9105.3
Potassium chloride	Serva	26868
Albumin	Biomol	01400-2
Glucose	Serva	22700
Sodium hydrogen carbonate	Serva	30180
0.4% Trypan blue solution	Lonza	17-942E
Cold storage solution	Hepacult GmbH