בידוד של hepatocytes האנושי על ידי שני שלבים Collagenase זלוף נוהל

Summary

הליך זלוף collagenase שני שלבים שונה לבידוד של hepatocytes אדם מתואר. שיטה זו יכולה להיות מיושמת גם לכבדים של יונקים אחרים. Hepatocytes מבודד זמינים בתשואה גבוהה וכדאיות, מה שהופך אותם המודל מתאים למחקר מדעי בתחומים כגון התחדשות כבד, פרמקוקינטיקה וטוקסיקולוגיה.

Abstract

הכבד, איבר עם יכולת התחדשות יוצאת דופן, מבצע מגוון רחב של פונקציות, כגון סילוק רעלים, חילוף חומרים ועל הומאוסטזיס. ככזה, hepatocytes הוא מודל חשוב למגוון רחב של שאלות מחקר. בפרט, השימוש בhepatocytes האנושי הוא חשוב במיוחד בתחומי פרמקוקינטיקה, טוקסיקולוגיה, התחדשות כבד ומחקר translational. לכן, שיטה זו מציגה גרסה שונה של הליך זלוף collagenase שני שלבים לבודד hepatocytes כפי שתואר על ידי ¹ Seglen.

בעבר, hepatocytes היה מבודד בשיטות מכאניות. עם זאת, שיטות אנזימטיות הוכחו להיות מעולה כמו hepatocytes לשמור על השלמות המבנית שלהם ותפקוד לאחר בידוד. שיטה זו המוצגת כאן מתאים את עצמו בשיטה שנועדה בעבר לכבדי חולדה לחתיכות כבד אנושיות ותוצאות בתשואה גדולה של הפטוציטים עם כדאיות של 77 10% ±. העיקריהבדל בהליך זה הוא התהליך של cannulization של כלי הדם. יתר על כן, בשיטה שתוארה כאן יכולה להיות מיושמת גם לכבדים ממינים אחרים עם גדלים בכבד או בכלי דם דומים.

Introduction

השעיה תא כבד ניתן להכין מהכבד בשיטות מכאניות או אנזימטי. שיטות מכאניות המשמשות להכנת תאי כבד שלמים כוללות כפייה של כבד דרך הגזה ^2, רועד חתיכת כבד עם חרוזי זכוכית שייקרה קאהן ^3, באמצעות homogenizers זכוכית עם עלי רופף ^4,5 וכו 'במהלך השנים, שיטות מכאניות נפלו מתוך להעדיף בשל הנזק לקרומי תאים ואובדן התפקוד של הפטוציטים המבודדים ^6,7. כתוצאה מכך, השימוש בשיטה אנזימטית הוא כיום השיטה העיקרית לבידודה של הפטוציטים.

בידוד של hepatocytes באמצעות שיטה האנזימטית השתפר מאוד כאשר ברי והחבר ⁸ perfused collagenase וhyaluronidase דרך כבד דרך וריד הפורטל בחולדות. תהליך זה מנוצל זלוף כלי הדם כדי לאפשר לאנזימים לבוא במגע קרוב עם רוב של התאים, מה שמוביל לעלייה של פי 6 בתשואה של hepatocytes ^8. יתר על כן, שיטה זו הניבה תאים ששמרו על השלמות המבנית שלהם, עם כמעט ללא שינוי של reticulum endoplasmic לתוך שלפוחית ​​מבודדת ולא נגרם נזק המיטוכונדריה ^8.

שיטה זו שונה על ידי ¹ Seglen, שהיה חלוץ הליך זלוף שני שלבים לבידוד בתאים כבד. בהליך זה, בכבד חולדת perfused עם ^{2 +} חיץ חופשי Ca אחרי זלוף עם חיץ collagenase המכיל Ca ^{2 + 1.} ההסרה של Ca ^{2 +} בשלב הראשון מסייעת לשבש דסמוזומים, תוך התוספת של Ca ^{2 +} בשלב השני נדרשת לפעילות collagenase אופטימלית ^1,9.

בהתחשב בכך שהעבודה שפורסמה שתוארה לעיל בוצעה בחולדות, מאמר זה נועד להדגים הליך שונה שיכול לשמש לבידודה של הפטוציטים עם כדאיות גבוהה מזמזוםכבדים. השימוש בhepatocytes האנושי נשאר חשוב למחקר translational ולאימות ניסויים תוך שימוש במודלים של בעלי חיים. חתיכות הכבד האנושיות השתמשו במחקר זה נרכשו בהסכמה לממשל דרך הקרן לחקר רקמות ותאים אנושיים, קרן ללא כוונת רווח בשליטה ממשלתית ^10. לאחר הפתולוג הסיר את מה שנדרש לאבחון, חתיכות כבד נאספו מהרקמות שנותרו. הרקמה מחולק על ידי פתולוג הייתה מורפולוגית רקמה בריאה המתקבלת משולי כריתה לאחר כריתת כבד.

Protocol

1. הכנה של פתרונות זלוף ובידוד

1. הכן את הפתרונות דרושים לטפטוף של חתיכת הכבד והבידוד של hepatocytes לפי טבלת 1. ניתן לאחסן את פתרונות על 4 מעלות צלזיוס עד לשימוש.
2. סינון סטרילי כל הפתרונות באמצעות מסנן 0.22 מיקרומטר.
3. כל הפתרונות שבאים במגע עם הכבד צריכים להיות סטרילי.

2. הכנת זלוף הציוד ופתרונות

1. הציוד לטפטוף של פיסת הכבד יש להגדיר כפי שמוצגים באיור 1.
2. אמבט המים צריך להיות מוגדר בטמפרטורה מתאימה, שהוא שונה בכל ניסיוני הגדרה מסוימת, כך שהפתרונים נמצאים בטמפרטורה של C ° 37 כאשר הם מגיעים לחתיכת הכבד. במקרה זה, אמבט המים מוגדר 41 מעלות צלזיוס כדי לחמם את הפתרונות 1, 2 ו -3 וקבל זכוכית במעיל. פתרון 4 יש לחמם עד37 מעלות צלזיוס באמבט מים נפרד לשימוש כדי להפחית את האובדן של פעילות collagenase.
3. זמן קצר לפני זלוף הכבד, להדליק את הרגולטור של מיכל הדלק המכיל 95% O _2/5% CO ₂ לגז מנגנון החמצון (איור 1E).

3. טפטוף של הכבד

1. יש לקבל חתיכת כבד עם כמה שיותר הקפסולה של Glisson שלמה ככל האפשר ואופן אידיאלי עם משטח רק 1 לחתוך מפתולוג לזלוף.
2. מניחים חתיכת הכבד הזה במשפך ביכנר המכיל מסנן דיסק מחורר (איור 1).
3. מערכת זלוף צריכה להיות דרוכה עם פתרון 1.
4. עם קצב זרימה נמוך, cannulae השקיה המעוגל עם טיפים זית צריך להיות מוכנס לתוך כלי דם גדולים יותר על פני השטח החתך של פיסת הכבד. הדם שוטף החוצה מן הכבד, הרקמות הופכת להיות קלות יותר באזורים עם זלוף טוב. מספר cannulae משמש לגדלים שוניםשל כבדים מוצג באיור 2 א. גודל מד נבחר צריך לגרום להתאמה הדוקה שתחזיק cannulae במקום. יש להשאיר כלי הדם הקטנים יותר פתוחים לחיץ זלוף לניקוז מחוץ לחתיכת הכבד.
5. להגדיל את קצב הזרימה במשאבת peristaltic לבין 110-460 מיליליטר / דקה בהתאם לגודל של הכבד (איור 2). התוצאה היא קצב זרימה של 44 ± 16 ממוצע מיליליטר / דקה לצינורית (איור 2 ג). המהירות שנבחרה תלויה בחתיכת הכבד וצריכה לגרום להתפחה עד קלה של חתיכת הכבד. במקרים מסוימים, ייתכן שיהיה צורך להדק את שהחלק מכלי השיט הפתוח עם מלחציים בכלי דם מיקרו על מנת להשיג את ההתפחה הקלה שהוזכר לעיל. זלוף טוב ניתן להבחין כאשר חתיכת הכבד היא צבע בהיר יותר לאורך כל דרך.
6. שמור על פיסה הלחה הכבד במהלך זלוף על ידי כיסוי אותו עם פיסת הגזה הספוגה בתמיסת מלח.
7. Perfuse עם 1 ליטר של פתרון 1 כדי לשטוף את כל remaining דם בחתיכת הכבד.
8. לשנות את נוזל זלוף לפתרון 2 וינקב עבור 10 דקות.
9. לעבור את נוזל זלוף לפתרון 3 וינקב עם 0.5 L.
10. לשנות את נוזל זלוף ל4 פתרון, אשר מכיל .1-0.15% מcollagenase (טבלה 2).
11. לצעד זה, זלוף צריך להתבצע באופן מחזוריות ל9-12 דקות או עד שהכבד מתעכל מספיק; רקמת הכבד אמורה להופיע להתפרק מעט מתחת הכמוסה של Glisson ולהרגיש התרכך כשמשש עם הצד הקהה של אזמל.

4. בידוד של hepatocytes

1. כבה את משאבת peristaltic ולהסיר cannulae מחתיכת הכבד.
2. מניחים את חתיכת הכבד בצלחת מתגבשת המכילה 100-200 מיליליטר של פתרון 5.
3. הסר את הקפסולה של Glisson בזהירות ובעדינות לנער את התאים. אם ישנם אזורים שאינם perfused היטב, אזמל יכול לשמש כדי לחתוךאזורים אלה כדי לשחרר את התאים בתוך. הוסף עוד פתרון 5 צורך כבמהלך התהליך.
4. הוסף עוד פתרון 5 עד לנפח סופי של 500 מיליליטר.
5. סנן השעיה תא פעמיים; ראשון דרך רשת 210 ניילון מיקרומטר ואחריו רשת ניילון 70 מיקרומטר. , הבא לשפוך את ההשעיה התא לתוך 200 צינורות צנטריפוגה מיליליטר.
6. צנטריפוגה ההשעיה התא ב72 גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C. לשאוב supernatant ותא גלולה בעדינות resuspend בעדינות ב200 מיליליטר של פתרון 5.
7. חזור על מספר שלב הכביסה 4.6 שלוש פעמים. על המדרגה צנטריפוגות הסופית, תאי resuspend בפתרון אחסון קר (ראו רשימה של חומרים). תאים צריכים להיות כ 2-5,000,000 hepatocytes למיליליטר להערכה של תשואה וכדאיות באמצעות assay הרחקת trypan הכחול מבוסס hemocytometer.
8. כדי לבצע את assay הרחקת trypan הכחול, להוסיף 0.1 מיליליטר של תאים בדילול כראוי (2-5,000,000 ≈ / מיליליטר) לצינור microfuge מכיל 0.5 מיליליטר של soluti trypan הכחולב( 0.4% trypan הכחולים מומס בפוספט שנאגרו מלוח (PBS)) ו0.4 מיליליטר של PBS. לאחר ערבוב ההשעיה התא ביסודיות, טען hemocytometer עם ההשעיה ולבחון תחת מיקרוסקופ בהגדלה 100X. תחת מיקרוסקופ, התאים המתים יהיו מוכתמים כחולים ואילו תאי החיים מופיעים בלא כתם. לספור את מספר תאי חיים ומוחלט בכל אחד ממ"מ ² הרשתות 1 מסומנת על hemocytometer. כדאיות (%), תשואה של תאי חיים (מיליון hepatocytes למיליליטר פתרון אחסון קר (CSS) או מיליון hepatocytes לכבד ז) יכולה להיות מחושבת באמצעות נוסחאות שלהלן.

הערה: במקרה זה, גורם לדילול trypan הכחול הוא 10 וגורם hemocytometer הוא 10,000.

תוצאות

התקנת זלוף

הציוד הדרוש לזלוף כבד יש להגדיר על פי איור 1.

כדאיות ותשואה של hepatocytes אדם מבודד

הכדאיות הממוצעת של hepatocytes אדם הבודד הייתה 77 ± 10% והתשואה המ?...

Discussion

פרוטוקול זה גורם לבידוד של hepatocytes האנושי עם כדאיות גבוהה ובטהרה. על מנת להשיג את התוצאות הללו, חשוב להתחיל עם חתיכת הכבד מתאימה. חתיכת הכבד צריכה הכמוסה של Glisson שלמות על כל המשטחים, פרט למשטח לחתוך 1. גורם חשוב נוסף הוא אצווה המסוים של collagenase משמש, כפי שקבוצות שונות יכולו...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bubble trap	Gaßner Glastechnik
Glass jacketed condenser	Gaßner Glastechnik
41 °C Water bath	Julabo	35723-H24/EG
37 °C Water bath	GFL	1083
Compressed gas cylinder (95 % O2/5 % CO2)	Linde
Gas permeable tubing	Neolab	2-4440
Peristaltic pump	Ismatec	IP65
Scalpel	Feather	320010
Forceps	Omnilab	5171014
Conical flasks 1 L	Schott Duran	2121654
Conical flasks 5 L	Schott Duran	2121673
Beakers	Schott Duran	2110654
200 ml centrifuge tubes	Becton Dickinson	352075
Crystallizing dish	Omnilab	5144063
Curved irrigation cannulae with ball tips	Ernst Kratz GmbH	1464LL/ 1465LL A+B/ 1472LL
Micro vascular clamps	Ernst Kratz GmbH
Büchner funnel	Carl Roth	HT38.1
Nylon mesh 210 μm	Neolab	4-1413
Nylon mesh 70 μm	Neolab	4-1419
0.22 μm sterile filters	Peske	99505
500 ml bottles	Schott Duran	2180144
1 L bottles	Schott Duran	2180154
Hemocytometer	Peske	06-0001
1.5 ml tubes	Eppendorf	0030 120,086
50 ml conical tubes	BD Biosciences	352070
Ice bucket	Neolab	1508454
Sterile Pasteur pipettes	Brand	747715
Motorised pipette filler (Pipette boy acu)	Integra	155017
Refridgerated centrifuge	Eppendorf	5810R
Laminar flow	Kendro	Hera safe-KS9
Aspirator (Low-flow surgical suction pump)	Atmos	C361
Laboratory Gas Burner	Integra	Fire Boy eco
Disposable laboratory coat	Paperlynen GmbH	MD0202414
Surgical mask with visor	Kimberly-Clark	48247
Surgical hood	Barrier	42072
Latex gloves	Semper Care	CE0321
Collagenase (Batch number NB 4G)	Serva	17465
Calcium chloride dihydrate	Merck	2382
EGTA	Sigma	E4378
Sodium chloride	Roth	9265.2
Hepes	Roth	9105.3
Potassium chloride	Serva	26868
Albumin	Biomol	01400-2
Glucose	Serva	22700
Sodium hydrogen carbonate	Serva	30180
0.4% Trypan blue solution	Lonza	17-942E
Cold storage solution	Hepacult GmbH