El aislamiento de hepatocitos humanos por una colagenasa perfusión Procedimiento de dos pasos

Resumen

Se describe un procedimiento de perfusión con colagenasa de dos etapas modificado para el aislamiento de hepatocitos humanos. Este método también se puede aplicar a otros hígados de mamíferos. Los hepatocitos aislados están disponibles con un alto rendimiento y la viabilidad, por lo que un modelo adecuado para la investigación científica en áreas como la regeneración hepática, farmacocinética y toxicología.

Resumen

El hígado, un órgano con una capacidad de regeneración excepcional, lleva a cabo una amplia gama de funciones, tales como la desintoxicación, el metabolismo y la homeostasis. Como tal, los hepatocitos son un modelo importante para una gran variedad de preguntas de investigación. En particular, el uso de hepatocitos humanos es especialmente importante en los campos de la farmacocinética, la toxicología, la regeneración del hígado y la investigación de translación. Por lo tanto, este método presenta una versión modificada de un procedimiento de perfusión con colagenasa de dos etapas para aislar los hepatocitos como se ha descrito por Seglen ^1.

Anteriormente, los hepatocitos han sido aislados por métodos mecánicos. Sin embargo, los métodos enzimáticos han demostrado ser superior como hepatocitos conservan su integridad y función estructural después del aislamiento. Este método que aquí se presenta se adapta el método previamente diseñado para hígados de rata a pedazos de hígado humano y los resultados en un gran rendimiento de hepatocitos con una viabilidad de 77 ± 10%. La principaldiferencia en este procedimiento es el proceso de cannulization de los vasos sanguíneos. Además, el método descrito aquí también se puede aplicar a los hígados de otras especies con tamaños de hígado o de los vasos sanguíneos comparables.

Introducción

Una suspensión de células de hígado puede prepararse a partir del hígado por métodos mecánicos o enzimáticos. Los métodos mecánicos utilizados para preparar las células del hígado enteros incluyen obligar al hígado a través de una gasa ^2, agitando un trozo de hígado con perlas de vidrio en un agitador de Kahn ^3, utilizando homogeneizadores de vidrio con morteros sueltas ^4,5 etc Con los años, los métodos mecánicos han caído en favor debido a los daños a las membranas celulares y la pérdida de función de los hepatocitos aislados ^6,7. En consecuencia, el uso de un método enzimático es actualmente el principal método para el aislamiento de hepatocitos.

Aislamiento de hepatocitos utilizando un método enzimático mejoró notablemente cuando Berry y Friend ⁸ perfundidos colagenasa y hialuronidasa a través del hígado a través de la vena porta en ratas. Este proceso utiliza la perfusión de la vasculatura para permitir que las enzimas entran en estrecho contacto con la mayoría de las células, conduciendo aun aumento de 6 veces en el rendimiento de hepatocitos ^8. Además, este método produjo células que conservan su integridad estructural, prácticamente sin transformación del retículo endoplásmico en vesículas aisladas y ningún daño mitocondrial ^8.

Este método se modificó por Seglen ^1, que fue pionero en un procedimiento de perfusión en dos etapas para el aislamiento de células del hígado. En este procedimiento, el hígado de la rata se perfunde con un tampón de ^{Ca2 +} libre seguido de la perfusión con un tampón de colagenasa que contiene Ca ^{2 + 1.} La eliminación de Ca ^{2 +} en la primera etapa ayuda a romper los desmosomas, mientras que se requiere la adición de Ca ^{2 +} en el segundo paso para la actividad de la colagenasa óptimo ^1,9.

Dado que el trabajo publicado descrito anteriormente se ha realizado en ratas, este artículo tiene como objetivo demostrar un procedimiento modificado que se puede utilizar para el aislamiento de hepatocitos con alta viabilidad de zumbidoun hígados. El uso de hepatocitos humanos sigue siendo importante para la investigación traslacional y para la validación de los experimentos con modelos animales. Los pedazos de hígado humano utilizados en este estudio fueron obtenidas con el consentimiento de la gobernanza a través de la Fundación Tejido Humano y la investigación con células, una fundación sin fines de lucro controladas por el Estado ^10. Después de un patólogo elimina lo que se requiere para el diagnóstico, pedazos de hígado se recogieron a partir del tejido restante. El tejido seccionado por el patólogo era morfológicamente tejido sano obtenido a partir de los márgenes de resección después de la resección hepática.

Protocolo

1. Preparación de la perfusión y el aislamiento Soluciones

1. Preparar las soluciones necesarias para la perfusión de la pieza hígado y el aislamiento de hepatocitos de acuerdo a la Tabla 1. Las soluciones pueden ser almacenadas a 4 ° C hasta su uso.
2. Filtro estéril todas las soluciones utilizando un filtro de 0,22 micras.
3. Todas las soluciones que entran en contacto con el hígado deben ser estériles.

2. Preparación de equipos y soluciones para infusión

1. Equipamiento para la perfusión de la pieza de hígado debe establecerse como se muestra en la Figura 1.
2. El baño de agua se establece a una temperatura apropiada, que es diferente en cada particular, experimental, de tal manera que las soluciones están a la temperatura de 37 ° C cuando llegan a la pieza de hígado. En este caso, el baño de agua se fijó en 41 ° C para calentar las soluciones 1, 2 y 3 y el condensador de vidrio con camisa. Solución 4 debe calentarse hasta37 ° C en un baño de agua separada para su uso para reducir la pérdida de actividad de la colagenasa.
3. Poco antes de la perfusión del hígado, encienda el regulador del tanque de gas que contiene 95% O _2/5% CO ₂ a gas del aparato de oxigenación (Figura 1E).

3. Perfusión del Hígado

1. Un trozo de hígado con tanto cápsula intacta de Glisson posible e idealmente con superficie sólo 1 de corte se debe obtener de un patólogo para perfusión.
2. Coloque esta pieza de hígado en el embudo Büchner que contiene un disco de filtro perforada (Figura 1B).
3. El sistema de perfusión debe ser cebado con la solución 1.
4. Con un caudal bajo, cánulas de irrigación curvo con punta de oliva se debe insertar en los vasos sanguíneos más grandes en la superficie de corte de la pieza de hígado. Cuando la sangre limpia las del hígado, el tejido se vuelve más claro en áreas con buena perfusión. El número de cánulas utilizado para diversos tamañosde hígados se muestra en la Figura 2A. El tamaño relativa elegida debe resultar en un ajuste cómodo que sostendrá la cánula en su lugar. Los vasos sanguíneos más pequeños se deben dejar abiertos para el tampón de perfusión para drenar fuera de la pieza de hígado.
5. Aumentar la tasa de flujo en la bomba peristáltica a entre 110 a 460 ml / min dependiendo del tamaño del hígado (Figura 2B). Esto se traduce en una tasa media de flujo de 44 ± 16 ml / min por cánula (Figura 2C). La velocidad elegida depende de la pieza de hígado y debe resultar en un plumping ligero de la pieza de hígado. En algunos casos, puede ser necesario para sujetar cerró algunos de los vasos abiertos con pinzas vasculares micro para lograr el ligero voluminizador mencionado anteriormente. Una buena perfusión se puede observar cuando el pedazo de hígado es un color más claro en todo.
6. Mantenga la pieza de hígado húmedo durante la perfusión cubriéndola con una gasa empapada en solución salina.
7. Perfundir con 1 l de solución 1 para eliminar cualquier remaining sangre en la pieza de hígado.
8. Cambiar el fluido de perfusión a la Solución 2 y perfundir durante 10 min.
9. Cambie el líquido de perfusión a la Solución 3 y perfundir con 0,5 L.
10. Cambiar el fluido de perfusión a la Solución 4, que contiene 0,1-0,15% de la colagenasa (Tabla 2).
11. Para este paso, la perfusión debe llevarse a cabo de una manera de recirculación para 9-12 min o hasta que el hígado está lo suficientemente digerido; el tejido hepático debería aparecer a separarse ligeramente debajo de la cápsula de Glisson y sentir ablandado cuando se sondearon con el lado romo de un bisturí.

4. Aislamiento de los hepatocitos

1. Apague la bomba peristáltica y extraiga las cánulas de la pieza de hígado.
2. Colocar la pieza de hígado en un plato de cristalización que contiene 100-200 ml de solución 5.
3. Retire la cápsula de Glisson con cuidado y suavidad sacudir las células. Si hay regiones que no están bien perfundidos, un bisturí se puede utilizar para cortar a travésestas regiones para liberar las células que contiene. Añadir más Solución 5 según sea necesario durante el proceso.
4. Añadir más solución de 5 hasta que se alcanza un volumen final de 500 ml.
5. Filtrar la suspensión celular dos veces; primero a través de una malla de 210 micras de nylon seguido de una malla de nylon 70 micras. A continuación, se vierte la suspensión celular en tubos de 200 ml de centrífuga.
6. Centrifugar la suspensión celular a 72 g durante 5 min a 4 ° C. Aspirar el sobrenadante y resuspender el sedimento celular suavemente suavemente en 200 ml de solución 5.
7. Repita el paso número lavado 4.6 tres veces. En el paso de centrifugación final, volver a suspender las células en una solución de almacenamiento en frío (ver la lista de materiales). Las células deben ser aproximadamente de 2-5 million hepatocitos por mililitro para la evaluación del rendimiento y la viabilidad mediante un ensayo de azul tripán exclusión basada en hemocitómetro.
8. Para llevar a cabo un ensayo de exclusión con azul de tripano, añadir 0,1 ml de células diluidas adecuadamente (≈ 2-5 million / ml) a un tubo de microcentrífuga que contiene 0,5 ml de azul de tripano solutien (0,4% de azul de tripano disolvió en solución salina tamponada con fosfato (PBS)) y 0,4 ml de PBS. Después de mezclar la suspensión de células a fondo, cargar un hemocitómetro con la suspensión y examinar bajo un microscopio a un aumento de 100X. Al examen microscópico, las células muertas se tiñen azul, mientras que las células vivas aparecen sin teñir. Contar el número de células vivas y totales en cada una de las 1 mm ² cuadrículas marcadas en el hemocitómetro. Viabilidad (%), el rendimiento de las células vivas (millones de hepatocitos por la solución de almacenamiento en frío ml (CSS) o millones de hepatocitos por g de hígado) puede calcularse utilizando las fórmulas siguientes.

Nota: En este caso, el factor de dilución de azul de tripano es 10 y el factor de hemocitómetro es 10.000.

Resultados

Configuración de perfusión

El equipo necesario para la perfusión hepática debe establecerse de acuerdo con la figura 1.

Viabilidad y Rentabilidad de hepatocitos aislados de humanos

La viabilidad media de hepatocitos humanos aislados fue de 77 ± 10% y el rendimiento promedio de los hepatocitos fue de 13 ± 11 millones hepatocitos / g de hígado, con los valores expresados ​​como medias ± desviación estándar. El n...

Discusión

Este protocolo da como resultado el aislamiento de hepatocitos humanos con una alta viabilidad y pureza. Con el fin de alcanzar estos resultados, es importante comenzar con una pieza adecuada de hígado. El trozo de hígado debe tener la cápsula de Glisson intacta en todas las superficies excepto por 1 superficie de corte. Otro factor importante es el lote particular de colagenasa utilizado, como diferentes lotes pueden dar lugar a marcadas diferencias en viabilidades de los hepatocitos después de la digestión ^1...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bubble trap	Gaßner Glastechnik
Glass jacketed condenser	Gaßner Glastechnik
41 °C Water bath	Julabo	35723-H24/EG
37 °C Water bath	GFL	1083
Compressed gas cylinder (95 % O2/5 % CO2)	Linde
Gas permeable tubing	Neolab	2-4440
Peristaltic pump	Ismatec	IP65
Scalpel	Feather	320010
Forceps	Omnilab	5171014
Conical flasks 1 L	Schott Duran	2121654
Conical flasks 5 L	Schott Duran	2121673
Beakers	Schott Duran	2110654
200 ml centrifuge tubes	Becton Dickinson	352075
Crystallizing dish	Omnilab	5144063
Curved irrigation cannulae with ball tips	Ernst Kratz GmbH	1464LL/ 1465LL A+B/ 1472LL
Micro vascular clamps	Ernst Kratz GmbH
Büchner funnel	Carl Roth	HT38.1
Nylon mesh 210 μm	Neolab	4-1413
Nylon mesh 70 μm	Neolab	4-1419
0.22 μm sterile filters	Peske	99505
500 ml bottles	Schott Duran	2180144
1 L bottles	Schott Duran	2180154
Hemocytometer	Peske	06-0001
1.5 ml tubes	Eppendorf	0030 120,086
50 ml conical tubes	BD Biosciences	352070
Ice bucket	Neolab	1508454
Sterile Pasteur pipettes	Brand	747715
Motorised pipette filler (Pipette boy acu)	Integra	155017
Refridgerated centrifuge	Eppendorf	5810R
Laminar flow	Kendro	Hera safe-KS9
Aspirator (Low-flow surgical suction pump)	Atmos	C361
Laboratory Gas Burner	Integra	Fire Boy eco
Disposable laboratory coat	Paperlynen GmbH	MD0202414
Surgical mask with visor	Kimberly-Clark	48247
Surgical hood	Barrier	42072
Latex gloves	Semper Care	CE0321
Collagenase (Batch number NB 4G)	Serva	17465
Calcium chloride dihydrate	Merck	2382
EGTA	Sigma	E4378
Sodium chloride	Roth	9265.2
Hepes	Roth	9105.3
Potassium chloride	Serva	26868
Albumin	Biomol	01400-2
Glucose	Serva	22700
Sodium hydrogen carbonate	Serva	30180
0.4% Trypan blue solution	Lonza	17-942E
Cold storage solution	Hepacult GmbH