二段階コラゲナーゼ灌流手順によって、ヒト肝細胞の分離

要約

ヒト肝細胞の単離のための修飾された二工程コラゲナーゼ灌流手順が記載されている。この方法はまた、他の哺乳動物の肝臓にも適用することができる。単離された肝細胞は、それらのような肝臓の再生、薬物動態および毒物学などの分野での科学的研究に適したモデル作り、高い収率および生存度で提供されています。

要約

肝臓、例外的な再生能力を有する器官は、解毒、代謝及び恒常性などの機能の広い範囲を実行する。このように、肝細胞は、研究課題の多種多様のための重要なモデルである。特に、ヒト肝細胞の使用は、薬物動態、毒性、肝再生および翻訳研究の分野で特に重要である。したがって、この方法は、Seglen ¹によって記載されるように肝細胞を単離するために2段階コラゲナーゼ灌流手順の修正版を提示する。

以前に、肝細胞は、機械的な方法によって単離されている。しかし、酵素法は、肝細胞が分離した後にその構造的完全性と機能を保持するように優れていることが示されている。ここで紹介するこの方法は、77±10％の生存と肝細胞の大規模な収率でヒトの肝臓片と結果に対するラットの肝臓のために以前に設計された方法を適応させる。メインこの手順の違いは、血管のカニューレ挿入するプロセスである。また、ここで説明する方法はまた、匹敵する肝臓または血管サイズを有する他の種由来の肝臓に適用することができる。

概要

肝細胞懸濁液を機械的または酵素的方法によって肝臓から調製することができる。全体の肝細胞を調製するために使用される機械的な方法は、チーズクロス²を介して肝臓を強制カーンシェーカー³におけるガラスビーズの肝臓片を振盪、長年にわたりなど緩い乳棒^4,5有するガラスホモジナイザーを用いて、機械的な方法は、外に落ちて含むにより、細胞膜の損傷と単離肝細胞^6,7の機能喪失に有利に働く。したがって、酵素的方法の使用は、現在、肝細胞の単離のための主要な方法である。

ベリーと友達^8は 、ラットにおける門脈経由で肝臓をコラゲナーゼおよびヒアルロニダーゼを灌流したとき、酵素法を用いて肝細胞の単離は大きく改善されました。この灌流過程を導く、酵素は細胞の大部分に密着できるようにするために血管系を利用した肝細胞⁸の収量の6倍の増加。さらに、この方法は、事実上孤立小胞への小胞体の変換なしなしミトコンドリア損傷⁸で、その構造的完全性を保持された細胞が得られた。

この方法は、肝細胞の単離のために二段階灌流手順を開拓Seglen ¹によって改変した。この手順では、ラットの肝臓のCa ^{2 +を}含有する¹コラゲナーゼ緩衝液で灌流、続いてのCa ^{2 +}を含まない緩衝液で灌流される。第二工程におけるCa ^{2 +}の添加は、最適なコラゲナーゼ活性^1,9に必要とされている間第一工程におけるCa ^{2 +}の除去は、デスモソームを破壊するのに役立つ。

上記の発表された研究は、ラットで行われたことを考えると、この記事では、ハムから高い生存して肝細胞の単離に使用することができます変更された手順を実証することを目的と肝臓。ヒト肝細胞の使用は、トランスレーショナル研究のための動物モデルを用いた実験を検証するための重要なままです。本研究で用いたヒト肝臓片を、ヒト組織および細胞研究基金、国営の非営利財団¹⁰を通じてガバナンスの同意を得て取得した。病理学者は、診断のために必要であったものを除去した後、肝臓片を残りの組織から採取した。病理学者によって区画さ組織は、形態学的に肝切除後の切除縁から得た健康な組織だった。

プロトコル

1。灌流および分離された溶液の調製

1. 肝臓片と、表1によると、肝細胞の単離灌流のために必要なソリューションを準備します。溶液は使用時まで4℃で保存することができる。
2. 無菌フィルター0.22μmのフィルターを使用して、すべてのソリューションを提供しています。
3. 肝臓と接触するすべてのソリューションは無菌でなければならない。

2。灌流機器とソリューションの作成

1. 図1に示すように、肝臓片の灌流のための機器は、セットアップする必要があります。
2. 水浴は、それらが肝臓片に到達したときに溶液が37℃の温度であるように、各特定の実験設定で異なる適切な温度に設定されるべきである。この場合には、水浴を溶液1,2および3とジャケット付きガラス凝縮器を温めるために41°Cに設定されている。溶液4に温めべきであるコラゲナーゼ活性の損失を低減するために使用するための別個の水浴中で37℃で。
3. まもなく肝灌流の前に、酸素化装置（ 図1E）をガスに95％のO _{2/5％CO 2を}含むガスのタンクのレギュレータをオンにします。

3。肝臓の灌流

1. 肝臓ピースできるだけ多くそのままグリソン鞘と、理想的には唯一の1切断面には、灌流のための病理学者から入手する必要があります。
2. 有孔フィルターディスク（ 図1B）が含まれてブフナー漏斗上、この肝臓ピースを置きます。
3. 灌流システムは、ソリューション1で下塗りする必要があります。
4. 低流量で、オリーブ先端を有する湾曲灌注カニューレは、肝臓片の切断面に大きな血管内に挿入されるべきである。血液が肝臓から洗い流すように、組織はよい潅流地域で軽くなる。様々なサイズのために使用さカニューレの数肝臓の図2Aに示されている。選択されたゲージのサイズが所定の位置にカニューレを保持するぴったりフィットをもたらすべきである。小さい血管が肝臓片の外に排出する灌流液のためオープンにしてください。
5. 肝臓（ 図2B）のサイズに応じて、ml /分110-460の間に蠕動ポンプでの流量を増加させる。これは、カニューレあたり44±16 ml /分（ 図2C）の平均流量をもたらす。選択した速度は、肝臓片に依存し、肝臓片のわずかにプランピングアップにつながるはずです。いくつかの場合においては、上述したわずかなプランピングを達成するために、微小血管クランプを備えた開放血管の一部を遮断クランプする必要があるかもしれない。肝臓片は全体を通して明るい色である場合に良好な灌流を観察することができる。
6. 生理食塩水に浸したガーゼで覆うことにより、灌流中の湿った肝作品を保管してください。
7. 任意のRを洗い流すためのソリューション1 1Lで灌流肝臓枚で血をemaining。
8. 解決策2に灌流液を変更し、10分間灌流する。
9. 解決策3に潅流液を切り替えて、0.5 Lで灌流
10. コラゲナーゼ（ 表2）の0.1から0.15パーセントを含む溶液4に灌流液を変更します。
11. 肝臓が十分に消化されるまで、このステップでは、灌流は9月12日分の再循環方法で実施あるいはすべきである肝組織はグリソン鞘の下に離れて少し破っての鈍側でプローブ時に軟化感じるように表示されます小刀。

4。肝細胞を単離する

1. 蠕動ポンプの電源を切り、肝臓片からカニューレを取り外します。
2. ソリューション5 100〜200 mlを含む結晶皿で肝ピースを置きます。
3. 慎重にグリソン鞘を外し、静かにセルを横に振る。よく灌流されていない領域がある場合は、外科用メスを介して切断するために使用することができるこれらの領域は、中に含まれる細胞を放出する。プロセス中に必要に応じてより多くのソリューション5を追加します。
4. 500ミリリットルの最終体積に達するまで、より多くのソリューションの追加5。
5. 二回細胞懸濁液をフィルタリング、最初の70ミクロンのナイロンメッシュに続いて210ミクロンのナイロンメッシュ。次に、30mlを200ml遠心管に細胞懸濁液を注ぐ。
6. 4℃で5分間、72 gで細胞懸濁液を遠心分離上清を吸引し、ゆっくりと溶液5の200ミリリットル中に静かに細胞ペレットを再懸濁します。
7. 洗浄工程数4.6 3回繰り返します。最後の遠心分離ステップで、（材料のリストを参照）低温貯蔵溶液中で細胞を再懸濁。細胞は血球計数器ベースのトリパンブルー排除アッセイを用いて収量と生存性の評価のためのミリリットル当たり約2から5000000肝細胞である必要があります。
8. トリパンブルー排除アッセイを実施するために、パンブルーsolutiの0.5ミリリットルを含む微量遠心管に（≈2から5000000 / ml）を適切に希釈した細胞の0.1ミリリットルを追加オン（リン酸緩衝生理食塩水（PBS）に溶解し、0.4％トリパンブルー）と0.4mlのPBS。完全に細胞懸濁液を混合した後、懸濁液を血球計数器をロードし、100Xの倍率で顕微鏡下で調べる。生きた細胞は染色されていない表示されている間、顕微鏡下では、死んだ細胞が青く染色されます。血球計数器上にマークさ1ミリメートル²のグリッドのそれぞれに住んでいて、全細胞の数を数える。生存率（％）、生細胞（中低温貯蔵溶液あたり百万肝細胞（CSS）又はg肝臓肝細胞あたり百万）の収率は以下の式を用いて計算することができる。

注：この場合には、トリパンブルー希釈係数は10であり、血球計係数は、10,000である。

結果

灌流セットアップ

肝灌流に必要な機器は、 図1に応じて設定する必要があります。

単離されたヒト肝細胞の生存率および収量

単離されたヒト肝細胞の平均生存率は77±10％であった肝細胞の平均収量は、平均値±標準偏差として表される値を使用して、13±1100万肝細胞/ g肝臓であった。肝細胞の単離の数は、648アイソレーシ?...

ディスカッション

このプロトコルは、高い生存率および純度のヒト肝細胞を単離することになる。これらの結果を達成するためには、肝臓の適切な個数で開始することが重要である。肝臓の一部は、1切断面を除くすべての表面上でそのままグリソン鞘を持つ必要があります。別の重要な要因は、異なるバッチの消化後¹¹肝細胞の生存率の著しい違いをもたらすことができるように、使用されるコラゲ?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bubble trap	Gaßner Glastechnik
Glass jacketed condenser	Gaßner Glastechnik
41 °C Water bath	Julabo	35723-H24/EG
37 °C Water bath	GFL	1083
Compressed gas cylinder (95 % O2/5 % CO2)	Linde
Gas permeable tubing	Neolab	2-4440
Peristaltic pump	Ismatec	IP65
Scalpel	Feather	320010
Forceps	Omnilab	5171014
Conical flasks 1 L	Schott Duran	2121654
Conical flasks 5 L	Schott Duran	2121673
Beakers	Schott Duran	2110654
200 ml centrifuge tubes	Becton Dickinson	352075
Crystallizing dish	Omnilab	5144063
Curved irrigation cannulae with ball tips	Ernst Kratz GmbH	1464LL/ 1465LL A+B/ 1472LL
Micro vascular clamps	Ernst Kratz GmbH
Büchner funnel	Carl Roth	HT38.1
Nylon mesh 210 μm	Neolab	4-1413
Nylon mesh 70 μm	Neolab	4-1419
0.22 μm sterile filters	Peske	99505
500 ml bottles	Schott Duran	2180144
1 L bottles	Schott Duran	2180154
Hemocytometer	Peske	06-0001
1.5 ml tubes	Eppendorf	0030 120,086
50 ml conical tubes	BD Biosciences	352070
Ice bucket	Neolab	1508454
Sterile Pasteur pipettes	Brand	747715
Motorised pipette filler (Pipette boy acu)	Integra	155017
Refridgerated centrifuge	Eppendorf	5810R
Laminar flow	Kendro	Hera safe-KS9
Aspirator (Low-flow surgical suction pump)	Atmos	C361
Laboratory Gas Burner	Integra	Fire Boy eco
Disposable laboratory coat	Paperlynen GmbH	MD0202414
Surgical mask with visor	Kimberly-Clark	48247
Surgical hood	Barrier	42072
Latex gloves	Semper Care	CE0321
Collagenase (Batch number NB 4G)	Serva	17465
Calcium chloride dihydrate	Merck	2382
EGTA	Sigma	E4378
Sodium chloride	Roth	9265.2
Hepes	Roth	9105.3
Potassium chloride	Serva	26868
Albumin	Biomol	01400-2
Glucose	Serva	22700
Sodium hydrogen carbonate	Serva	30180
0.4% Trypan blue solution	Lonza	17-942E
Cold storage solution	Hepacult GmbH