غشاء العمود الفقري: أداة كيميائية حيوية لتحديد البروتين البروتين التفاعلات للبروتينات الغشاء<em&gt; في فيفو</em

Summary

يوصف منهج الكيمياء الحيوية في الجسم الحي لتحديد البروتين البروتين التفاعلات (PPI) للبروتينات الغشاء. أسلوب يجمع بين البروتين عبر ربط، وتنقية تقارب ومطياف الكتلة، وقابلة للتكيف مع ما يقرب من أي نوع من الخلايا أو الكائن الحي. مع هذا النهج، وحتى تحديد مثبطات مضخة البروتون عابرة يصبح ذلك ممكنا.

Abstract

بروتينات الغشاء ضرورية لبقاء الخلية، وبالتالي فهي أهداف علاجية هامة ^1-3. لأنها تعمل في المجمعات ^4، وأساليب لتحديد وتوصيف تفاعلاتها ضرورية ^5. تحقيقا لهذه الغاية، قمنا بتطوير بكتيريا غشاء البروتين تجربة التفاعل، ودعا غشاء العمود الفقري ^6. هذا الأسلوب يجمع بين المجراة عبر ربط باستخدام عكسها عبر رابط مع الفورمالديهايد تنقية تقارب من بروتين الطعم غشاء الموسومة بكتيريا. أثناء الإجراء، والبروتينات فريسة عبر ربط والتعاون مع تنقية البروتين الطعم الغشاء ومفصولة الغليان في وقت لاحق. وبالتالي، واثنين من المهام الرئيسية التي يمكن تشغيلها عند تحليل التفاعلات البروتين البروتين (مثبطات مضخة البروتون) من بروتينات الغشاء باستخدام غشاء العمود الفقري: أولا، تأكيد وجود شريك التفاعل الذي اقترحه immunoblotting، والثانية، وتحديد الشركاء التفاعل جديدة عن طريق تحليل الطيف الكتلي . وعلاوة على ذلك، حتى لآه تقارب، مثبطات مضخة البروتون هي عابرة كشفها بواسطة هذه التقنية. أخيرا، غشاء العمود الفقري قابلة للتكيف مع ما يقرب من أي نوع من الخلايا، مما يجعلها قابلة للتطبيق كأداة فحص قوية لتحديد مثبطات مضخة البروتون من البروتينات الغشاء.

Introduction

لفهم وظيفة البروتين فمن الضروري أن نعرف شركاء تفاعلها. تتوفر لتحديد الشركاء التفاعل من بروتينات قابلة للذوبان العديد من التقنيات الكلاسيكية. ولكن هذه التقنيات ليست قابلة للتحويل بسهولة إلى غشاء البروتينات نظرا لطبيعة مسعور بهم ^4. للتغلب على هذا القيد، وقد وضعنا في غشاء بكتيريا البروتين التفاعل التجربة (غشاء العمود الفقري) ^6. لأنه يقوم على طريقة العمود الفقري، والتي كانت مناسبة فقط للبروتينات قابلة للذوبان ^7.

فوائد غشاء العمود الفقري من اثنين من المزايا التي تتمتع بها عبر ربط كيل الفورمالديهايد: أولا، والفورمالديهايد يمكن أن تخترق بسهولة الأغشية ويولد لقطة دقيقة من interactome خلية الحية ⁸ بالتالي. الثانية، والفورمالديهايد عبر وصلات يمكن عكسها من الغليان ^9. هنا، يتم استخدام هذه المزايا اثنين لتحديد ليس فقط مثبطات مضخة البروتون دائمة ولكن أيضا عابرة للالمتواجد الغشاء⁶ الإضافية.

في سطور، وتنصهر في علامة بكتيريا لمحطة سي من البروتين لا يتجزأ الطعم الغشاء. يتم تحضين الخلايا معربا عن البروتين الطعم الغشاء مع الفورمالديهايد التي عبر وصلات البروتينات فريسة للبروتين الغشاء الطعم (الشكل 1). ليست هناك حاجة للبروتينات التعديلات الفريسة. المقبل، وجزء الغشاء مستعدة. لذلك، يتم solubilized البروتينات الغشاء عن طريق العلاج المنظفات والطعم البروتينات هي التعاون مع تنقية البروتينات فريسته باستخدام تنقية تقارب. بعد ذلك، يتم عكس الرابط عبر من الغليان، ويتم فصل الطعم والبروتينات فريسة المشترك مزال من قبل SDS-PAGE. أخيرا، يمكن تحديدها من خلال تحليل البروتينات فريسة طخة مناعية أو مطياف الكتلة.

Protocol

ملاحظة: معلومات تفصيلية عن مخازن مشار إليه في البروتوكول متاح في الجدول 1.

1. التثبيت من البروتين البروتين التفاعلات التي كتبها الفورمالديهايد عبر ربط في الخلايا الحية

1. لبدء إعداد وسائط النمو، حلول الأسهم وعازلة P1
   1. إعداد 500 مل المتوسطة: يجب على توفير الظروف المتوسطة التي تدعم التفاعل بين غشاء البروتين الطعم والبروتينات فريسة. بالإضافة إلى ذلك، يجب أن يتم تنفيذ تجربة واحدة في ظل الظروف حيث يتوقع أي تفاعل (على سبيل المثال دون عبر ربط).
      ملاحظة: نحن نقارن تفاعلات البروتين البروتين في البكتيريا وشدد وشدد غير. لذلك، نحن نستعد لوريا BERTANI 500 مل (LB) المتوسطة (الجدول 1) أننا تكمل مع وكيل الذي يحفز التوتر (مثل كلوريد الصوديوم 0.5 M) في قارورة 2 لتر مخروطي. للسيطرة، ونحن نستخدم العادي المتوسط ​​LB مع 0.17 M كلوريد الصوديوم (الرقم الهيدروجيني 7.0).
   2. إعداد تريس العازلة (20 ملي تريس-Hالبنود؛ درجة الحموضة 8.0) و 0.1 M حمض ethylenediaminetetraacetic (EDTA)، ودرجة الحموضة 8.0 حل الأسهم (الجدول 1).
   3. إعداد العازلة P1. حل السكروز إلى تركيز النهائي من 0.5 M في تريس العازلة. تعقيم العازلة P1 عن طريق الترشيح وتخزينها في 4 درجات مئوية.
2. تنمو الخلايا معربا عن البروتين الطعم الغشاء مع محطة C بكتيريا علامة الانصهار من النواقل. لحث على التعبير عن غشاء بروتينات الطعم لفترة كافية.
   ملاحظة: نحن لحث على التعبير عن البروتينات البكتيرية الطعم الغشاء في مرحلة مبكرة سجل (A ₆₀₀ = 0.3) من خلال إضافة 250 ميكرولتر 1 M-الآيزوبروبيل β-D-thiogalactopyranoside (IPTG) إلى 500 مل المتوسطة (تركيز النهائي: 0.5 ملم) . للسماح التعبير كافية، ونحن احتضان البكتيريا حتى مرحلة سجل في وقت متأخر من (A ₆₀₀ = 1.2).
3. الاستعداد لكل ثقافة اثنين الأكواب الطرد المركزي مع الحد الأدنى من حجم 300 مل كل ووضعها على الجليد.
4. أداء الفورمالديهايد عبر ربط.
   CAUTION: الفورمالديهايد هو شديدة السمية ونحن ننصح بالعمل تحت غطاء الدخان السلامة.
   1. نقل سفينة الثقافة تحت غطاء الدخان السلامة. تقسيم كل عينة إلى قسمين العينات، واحد إهمال عبر ربط (- X) واحد بما في ذلك الفورمالديهايد عبر ربط (+ X). إضافة 4 مل 37٪ محلول الفورمالديهايد إلى 250 مل الثقافة للوصول إلى التركيز النهائي من 0.6٪.
5. نقل السفن الثقافة ذهابا وتنمو الخلايا لمزيد من 20 دقيقة كما كان من قبل.
6. ملء الثقافات الخاص في أنابيب الطرد المركزي تحت غطاء الدخان السلامة. جمع الخلايا بواسطة الطرد المركزي في 3000 x ج لمدة 30 دقيقة.
7. تجاهل طاف بواسطة pipetting بعناية تحت غطاء الدخان السلامة. جمع طاف السامة المحتوية على الفورمالديهايد والتخلص منها بشكل صحيح.
8. من أجل الوصول إلى العائد الأمثل خلال غشاء إعداد البروتين، وإعداد spheroplasts الأولى. هنا، ونحن نقدم بروتوكول لتشكيل الكوراء من البكتيريا سالبة الجرام:
   1. Preparه عازلة P2 (الجدول 1) من مسحوق مجفف بالتجميد. تذوب بلطف 2 ملغ الليزوزيم في 0.1 M EDTA، ودرجة الحموضة 8، في أنبوب 1.5 مل. إعداد العازلة P2 دائما طازجة لليوم من التجربة.
   2. إعداد تريس العازلة مع مثبطات الأنزيم البروتيني (العازلة P3). إلى 10 مل من تريس العازلة، إضافة 0.1 مل 1 M phenylmethylsulfonylfluoride (PMSF) (الجدول 1) إلى تركيز النهائي من 10 ملم. استخدام المخزن المؤقت فورا، لضمان وظيفة مناسبة من PMSF كما مثبط البروتياز.
   3. كريات الخلية resuspend في 10 مل تريس العازلة مع مثبطات الأنزيم البروتيني والحل نقلها إلى أنبوب 15 مل المخروطية.
   4. إضافة 1 مل العازلة P2 واحتضان على الجليد لمدة 30 دقيقة.
   5. جمع spheroplasts بواسطة الطرد المركزي في 3000 x ج لمدة 30 دقيقة، وتجاهل طاف بعناية.
9. احتضان الكريات الكوراء بين عشية وضحاها في -20 درجة مئوية.

2. تنقية بكتيريا علامة غشاء بروتين (بيت)

1. وضع الكوراء بيليه على الجليد.
2. خلال فترة الكريات الكوراء ذوبان الجليد على الجليد، وإعداد 10 مل العازلة P3 لكل إعداد الكوراء. بلطف حل 1 ملغ DNaseI في 10 مل تريس العازلة. إضافة 0.1 مل 1 M PMSF فقط قبل الاستخدام.
3. resuspend الكرية في 6 مل الطازجة P3. يصوتن العينة أربع مرات لمدة 1 دقيقة باستمرار على الجليد مع وقفة 1 دقيقة بين كل انفجار، من أجل تعطيل spheroplasts.
4. أجهزة الطرد المركزي في العينة 10،000 x ج لمدة 10 دقيقة إلى الحصاد الحطام الخلية. نقل طاف باستخدام ماصة إلى أنبوب نابذة فائقة السرعة.
5. بيليه الكسر غشاء على 100،000 x ج لمدة 30 دقيقة. غسل بيليه في تريس بعناية العازلة دون حلها. تجف الأنبوب بمنديل ورق (مثل كلينيكس). تجنب إزعاج بيليه في أي وقت.
6. resuspend الكرية (= الأغشية) بعناية في 1 مل تريس العازلة. استخدام قسامة 20 ميكرولتر لتحديد تركيز البروتين مثل BCA الفحص. في هذه الخطوة، والأغشية يمكن صدمة المجمدة في لىالنيتروجين مضغة وتخزينها في -80 درجة مئوية.

3. تنقية بكتيريا علامة غشاء بيت البروتين وSDS-PAGE

1. تطبيع تركيز البروتين من الكسر غشاء إلى 5 ملغ / مل مع تريس العازلة. تأخذ 2.5 مل جزء الغشاء (5 ملغ / مل) في أنبوب نابذة فائقة السرعة وإضافة 0.25 مل من 20٪ تريتون X-100 للوصول إلى تركيز النهائي من 2٪، وذلك لذوبان البروتينات الغشاء. إضافة قضيب مغناطيسي الصغرى ويقلب على الجليد لمدة 1 ساعة.
   ملاحظة: على الرغم من أن بشكل عام لدينا نتائج جيدة باستخدام تريتون X-100 كما المنظفات، فإنه قد يكون من المفيد لتغيير المنظفات من أجل التحسين. في هذا الصدد، لدينا أفضل النتائج مع تلك المنظفات المستخدمة لتنقية وظيفية من البروتين الطعم الغشاء منها.
2. أثناء أداء الخطوة 3.1، وإعداد 50 مل العازلة W و 5 مل العازلة E من (الجدول 1). ملء 10 مل 5X العازلة W التركيز إلى 50 مل وإضافة 150 ميكرولتر 20٪ تريتون X-100.
   1. تملأ 1 مل 5X العازلهص E التركيز إلى 10 مل وإضافة 30 ميكرولتر 20٪ تريتون X-100. تتوازن 1 مل بكتيريا-Tactin superflow الجاذبية العمود تدفق مع 8 مل العازلة دبليو
      ملاحظة: من الضروري لإضافة المنظفات المستخدمة لالانحلالية في تركيز 10 أضعاف أعلاه تركيز مذيلة الحرجة (CMC) في أي العازلة أثناء إجراء تنقية.
3. إزالة قضيب مغناطيسي الصغرى من العينة الانحلالية ونابذة فائقة السرعة في 100،000 x ج لمدة 30 دقيقة، لتكوير الكسر غشاء غير قابلة للذوبان. إزالة طاف باستخدام ماصة لمزيد من التنقية.
4. تحميل طاف إلى العمود. تشغيل العمود فقط مع تدفق الجاذبية. غسل العمود مع 5 مل العازلة دبليو كرر هذه الخطوة غسل 5X.
5. أزل غشاء بروتينات الطعم مع 1 مل العازلة E. كرر هذه الخطوة شطف 4X.
6. التركيز الكسور شطف 2 و 3 و 4-300 ميكرولتر مع وحدة تصفية الطرد المركزي.
7. مزيج 200 ميكرولتر من كل عينة مع 50 ميكرولتر 5X SDS-PAGE صبغ التحميل. تقسيم كل إعداد في 125 ميكرولتر مأخوذة. تغلي قسامة واحدة من كل إعداد لمدة 20 دقيقة في 95 درجة مئوية، وعلى عكس الفورمالديهايد عبر وصلات. دعونا عينات يبرد لRT لمدة 10 دقيقة على الأقل على مقاعد البدلاء أعلى.
8. تحميل 30 ميكرولتر من كل عينة إلى حارة واحدة من بولكرلميد هلام مناسبة للimmunoblotting. استخدام prestained الوزن الجزيئي علامة للحصول على أفضل توجيه وتشغيل SDS-PAGE ^10.

4. تحليل لطخة مناعية تأكيد الشركاء التفاعل

1. مرة واحدة الخطوة 3.8 اكتمال والبروتينات نقل إلى غشاء النيتروسليلوز من قبل مثل شبه الجافة.
2. منع غشاء لمنع وضع العلامات غير محددة. إعداد عرقلة العازلة وزنها ألبومين المصل البقري (BSA) لتحقيق 3٪ الوزن لكل وحدة التخزين في المياه المالحة تريس مخزنة تستكمل مع تركيز النهائي من 0.05٪ توين 20 (TBS-T). استخدام حجم كاف من عرقلة العازلة لتغطية الغشاء. منع الغشاء لمدة 1 ساعة على RT.
3. تمييع والثانية احتضان الضد محددة الأولى البروتين فريسة كالمعتاد. استخدام الأجسام المضادة المرتبطة كما HRP الضد الثاني.
4. تطوير طخة مناعية استخدام عدة الكشف chemiluminescent مع حساسية عالية. رصد إشارة باستخدام إجراء تجهيز الأفلام الكلاسيكية أو معدات التصوير الرقمية.

5. تجارب NanoLC-ESI-MS/MS عالية الدقة لتحديد الشركاء التفاعل

1. في حالة عدم وجود الأجسام المضادة المحددة متاح للبروتين فريسة أو الشركاء التفاعل غير معروفة ينبغي أن تحدد واستخدام مطياف الكتلة (MS) لتحديد الهوية. من أجل منع التلوث الكيراتين، واستخدام المواد الهلامية precasted لفصل البروتين.
2. الفضة وصمة عار على SDS-PAGE باستخدام عدة تلطيخ-MS متوافقة وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. تنفيذ كافة الخطوات تلطيخ والغسيل في خزانات زجاجية.
3. العصابات المكوس منها وتحليل هذه بواسطة عالية الدقة LC / MS ^9.

النتائج

تحليل الغشاء يسمح العمود الفقري المشارك تنقية البروتينات الغشاء والتفاعل عابر شركاء البروتين. يتم تحقيق تنقية شارك باستخدام عبر ربط كيل الفورمالديهايد. معلمتين حاسمة لمنع غير محددة عبر الروابط التالية: تركيز الفورمالدهايد والوقت عبر ربط. استخدام كافية، ولكن ليست م...

Discussion

تحليل الغشاء العمود الفقري هو نهج البيوكيميائية التي تمكن واحد لتأكيد وتحديد لهذه النقطة شركاء التفاعل غير معروف من البروتينات الغشاء. غشاء العمود الفقري يجمع في الجسم الحي عبر ربط بواسطة الفورمالديهايد مع تنقية البروتين الطعم غشاء الموسومة بكتيريا. الجمع مع i...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
37% Formaldehyde	Roth	4979.1	Should not be older than one year
DNaseI	Sigma	DN25
BCA protein assay kit	Pierce	23225
Micromagnetic rod	Roth	0955.2	5 mm in length, 2 mm in diameter
Triton X-100	Roth	6683.1	standard detergent for solubilization
n-Dodecyl-β-maltoside	Glycon	D97002-C	the best detergent to solubilze CpxA
1 ml Strep-Tactin superflow gravity flow column	IBA	2-1207-050
Strep-tag protein purification buffer set	IBA	2-1002-001	Contains buffer W and buffer E
Amicon Ultra-4 centrifugal filter	Millipore	UFC803024
SuperSignal West Pico Chemiluminescent substrate	Pierce	34080
SilverQuest Silverstaining kit	Invitrogen	LC6070
FireSilver Staining Kit	Proteome Factory	P-S-2001
Ultracentrifuge