Membrane-SPINE: un outil biochimique pour identifier les interactions protéine-protéine de protéines membranaires<em&gt; In Vivo</em

Résumé

Une approche biochimique est décrite in vivo pour identifier les interactions protéine-protéine dans (PPI) de protéines membranaires. Le procédé combine la réticulation des protéines, purification par affinité et la spectrométrie de masse, et peut être adapté à presque n'importe quel type de cellule ou un organisme. Avec cette approche, même l'identification des IPP transitoires devient possible.

Résumé

Les protéines membranaires sont essentielles pour la viabilité des cellules et sont donc des cibles thérapeutiques importantes ^3.1. Comme ils fonctionnent dans des complexes ^4, méthodes pour identifier et caractériser leurs interactions sont nécessaires ^5. À cette fin, nous avons développé l'expérience d'interaction Strep-protéine de membrane, appelée membrane-SPINE ^6. Cette technique combine in vivo de réticulation réversible à l'aide du formaldéhyde agent de réticulation avec une purification par affinité de la protéine d'appât de la membrane à étiquette Strep. Au cours de la procédure, les protéines de proies réticulés sont co-purifiés avec la protéine appât de la membrane et ensuite séparées par ébullition. Ainsi, deux grandes tâches peuvent être exécutées lors de l'analyse des interactions protéine-protéine (IPP) de protéines membranaires en utilisant membrane-SPINE: d'abord, la confirmation d'un partenaire d'interaction proposé par immunoblot, et d'autre part, l'identification de nouveaux partenaires d'interaction par spectrométrie de masse . En outre, même low affinité, les IPP transitoires sont détectables par cette technique. Enfin, Membrane-SPINE est adaptable à presque n'importe quel type de cellule, qu'il s'applique à un outil de dépistage pour identifier des IPP de protéines membranaires.

Introduction

Pour comprendre la fonction d'une protéine, il est essentiel de connaître ses partenaires d'interaction. Plusieurs techniques classiques sont disponibles pour l'identification des partenaires d'interaction de protéines solubles. Cependant, ces techniques ne sont pas facilement transférables à des protéines membranaires du fait de leur nature hydrophobe ^4. Pour contourner cette limitation, nous avons développé la membrane Strep-protéine interaction expérience (Membrane-SPINE) ^6. Il est basé sur la méthode de la colonne vertébrale, qui était uniquement pour les protéines solubles ^7.

Membrane-SPINE bénéficie de deux avantages de la formaldéhyde agent de réticulation: d'abord, le formaldéhyde peuvent facilement pénétrer les membranes et donc génère un aperçu précis de l'interactome d'une cellule vivante ^8. Deuxièmement, le formaldéhyde liaisons transversales peuvent être inversées en faisant bouillir ^9. Ici, ces deux avantages sont utilisés pour identifier non seulement les IPP permanents mais aussi transitoires de prote de la membraneins ^6.

En bref, une Strep-tag est fusionnée à l'extrémité C-terminale de la protéine appât membranaire intégrale. Les cellules exprimant la protéine appât de la membrane sont mises en incubation avec du formaldéhyde qui réticule les protéines s'attaquent à la protéine appât de la membrane (Figure 1). Les modifications des protéines de la proie ne sont pas nécessaires. Ensuite, la fraction membranaire est préparée. Par conséquent, les protéines membranaires sont solubilisés par traitement avec un détergent et de l'appât protéines sont co-purifiés avec ses protéines de proie en utilisant une purification par affinité. Par la suite, la liaison réticulée est inversé par ebullition, et l'appât et de proie ses protéines co-éluées sont séparés par SDS-PAGE. Enfin, les protéines de proie peuvent être identifiés par une analyse par immunotransfert ou spectrométrie de masse.

Protocole

Remarque: Les informations détaillées concernant les tampons indiquées dans le protocole est disponible dans le tableau 1.

Une. Fixation des interactions protéine-protéine par formaldéhyde réticulation dans les cellules vivantes

1. Pour commencer la préparation des milieux de culture, solutions mères et de tampon P1
   1. Préparer 500 ml de milieu: Le milieu doit offrir des conditions qui favorisent l'interaction entre les protéines membranaires de protéines appâts et proies. En outre, une expérience doit être réalisée dans des conditions où l'on prévoit aucune interaction (par exemple, sans réticulation).
      Note: Nous comparons les interactions protéine-protéine dans des bactéries stressées et non stressées. Par conséquent, on prépare 500 ml de milieu Luria Bertani (LB) (tableau 1) que nous sommes complémentaires avec un agent inducteur de stress (par exemple NaCl 0,5 M) dans un ballon d'Erlenmeyer de 2 litres. Pour le contrôle, nous utilisons milieu LB normale avec 0,17 M de NaCl (pH 7,0).
   2. Préparer du tampon Tris (20 mM Tris-HCl, pH 8,0) et 0,1 M d'acide éthylènediaminetétra-acétique (EDTA), pH 8,0, solution mère (Tableau 1).
   3. Préparer tampon P1. Dissoudre le saccharose à une concentration finale de 0,5 M dans du tampon Tris. Stériliser tampon P1 par filtration et stocker à 4 ° C.
2. Cultiver des cellules exprimant la protéine appât de la membrane avec une Strep-tag fusion C-terminale à partir d'un vecteur. Induire l'expression de protéines d'appât de la membrane pendant une durée suffisante.
   Note: on induit l'expression de protéines d'appât de la membrane bactérienne lors de la phase précoce-log (A ₆₀₀ = 0,3) par addition de 250 ul de 1 M d'isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG) à 500 ml de milieu (concentration finale: 0,5 mM) . Afin de permettre une expression suffisante, l'incubation de la bactérie jusqu'à la phase logarithmique tardive (A ₆₀₀ = 1,2).
3. Préparer pour chaque culture deux béchers de centrifugation d'un volume minimum de 300 ml chacun et de les placer sur la glace.
4. Effectuer formaldéhyde réticulation.
   CAUTION: Le formaldéhyde est hautement toxique Nous recommandons de travailler sous une hotte de sécurité..
   1. Transférer le récipient de culture sous une hotte de sécurité. Diviser chaque échantillon en deux échantillons, l'un en omettant de réticulation (- X) et y compris le formaldéhyde une réticulation (+ X). Ajouter une solution de 4 ml de formaldéhyde à 37% à 250 ml de la culture pour parvenir à une concentration finale de 0,6%.
5. Transférer les récipients de culture en arrière et cultiver des cellules pour 20 minutes supplémentaires comme avant.
6. Remplissez vos cultures dans les tubes de centrifugation sous une hotte de sécurité. Recueillir les cellules par centrifugation à 3000 xg pendant 30 min.
7. Rejeter le surnageant par pipetage avec précaution sous une hotte de sécurité. Recueillir toxique surnageant contenant du formaldéhyde et jetez-la.
8. Afin d'atteindre un rendement optimal lors de la préparation de protéine membranaire, de préparer d'abord des sphéroplastes. Ici, nous fournissons un protocole pour la formation de sphéroplastes de bactéries à Gram négatif:
   1. Prepare tampon P2 (tableau 1) à partir de poudre lyophilisée. Dissoudre doucement 2 mg de lysozyme dans 0,1 M d'EDTA, pH 8, dans un tube de 1,5 ml. Toujours préparer fraîchement tampon P2 pour le jour de l'expérience.
   2. Préparer le tampon Tris avec un inhibiteur de la protéase (P3 tampon). A 10 ml de Tris-tampon, ajouter 0,1 ml de 1 M de fluorure de phénylméthylsulfonyle (PMSF) (tableau 1) à une concentration finale de 10 mM. Utiliser le tampon immédiatement, afin d'assurer le bon fonctionnement de PMSF comme inhibiteur de protéase.
   3. culots cellulaires d'Remettre en suspension dans 10 ml de Tris-tampon avec un inhibiteur de protéase et de la solution de transfert à un tube conique de 15 ml.
   4. Ajouter 1 ml de tampon P2 et incuber sur de la glace pendant 30 min.
   5. Recueillir sphéroplastes par centrifugation à 3000 g pendant 30 min et éliminer le surnageant avec précaution.
9. Incuber les pastilles de sphéroplastes pendant une nuit à -20 ° C.

2. Purification de Strep-tag Membrane Protein (Bait)

1. Placez sphéroplaste pastille sur la glace.
2. Pendant le temps des pastilles de sphéroplaste dégel sur la glace, préparer 10 ml de tampon P3 pour chaque préparation sphéroplaste. Dissoudre délicatement 1 mg DNaseI dans 10 ml de Tris-tampon. Ajouter 0,1 ml de 1 M de PMSF juste avant utilisation.
3. Reprendre le culot dans 6 ml de P3 fraîchement préparé. Soniquer l'échantillon quatre fois pendant 1 min en continu sur de la glace avec 1 min de pause entre chaque rafale, afin de perturber les sphéroplastes.
4. Centrifuger l'échantillon à 10 000 xg pendant 10 minutes à des débris de cellules de la récolte. Transférer le surnageant à l'aide d'une pipette dans un tube d'ultracentrifugation.
5. Sédimenter la fraction membranaire à 100 000 xg pendant 30 min. Laver le culot avec soin dans du tampon Tris sans dissolvant. Sécher le tube avec un mouchoir en papier (par exemple Kleenex). Ne pas perturber le culot, à tout moment.
6. Reprendre le culot (= membranes) avec précaution 1 ml de Tris-tampon. Utiliser une fraction aliquote de 20 ul de déterminer la concentration en protéine par dosage BCA par exemple. À cette étape, les membranes peuvent être congelés dans un choc lichique azote et conservés à -80 ° C.

3. Purification de Strep-tag Membrane Protein Bait et SDS-PAGE

1. Normaliser la concentration en protéines de la fraction membranaire à 5 mg / ml avec du tampon Tris. Prendre 2,5 ml fraction de membrane (5 mg / ml) dans un tube d'ultracentrifugation et ajouter 0,25 ml de 20% de Triton X-100 pour atteindre une concentration finale de 2%, afin de solubiliser les protéines membranaires. Ajouter une tige micro-magnétique et remuer sur de la glace pendant 1 heure.
   Remarque: Bien que, en général, nous avons de bons résultats en utilisant du Triton X-100 comme détergent, il peut être utile de modifier le détergent pour l'optimisation. A cet égard, il faut obtenir les meilleurs résultats avec les détergents utilisés pour la purification de la protéine fonctionnelle de l'appât de la membrane respective.
2. Tout en exécutant l'étape 3.1, de préparer 50 ml de tampon B et 5 ml de tampon E (tableau 1). Remplir 10 ml 5x tampon W concentré à 50 ml et ajouter 150 ul 20% de Triton X-100.
   1. Remplir 1 ml 5x Buffer E concentré à 10 ml et ajouter 30 ul de 20% de Triton X-100. Equilibrer une colonne de débit 1 ml Strep-Tactin superflow gravité avec 8 ml de tampon W.
      Remarque: il est essentiel d'ajouter le détergent utilisé pour la solubilisation dans un facteur 10 de la concentration au-dessus de la concentration micellaire critique (cmc) dans tout le tampon au cours de la procédure de purification.
3. Retirer la tige de micro-magnétique à partir de l'échantillon de solubilisation et par ultracentrifugation à 100000 g pendant 30 min, pour obtenir un culot de la fraction membranaire insoluble. Retirer le surnageant avec une pipette pour une purification supplémentaire.
4. Charger le surnageant à la colonne. Exécutez la colonne uniquement avec écoulement par gravité. Laver la colonne avec 5 ml de tampon W. Répétez cette étape de lavage 5x.
5. Éluer protéines appâts de la membrane avec 1 ml de tampon E. Répétez cette étape d'élution 4x.
6. Concentrer les fractions d'élution 2, 3, et 4 à 300 ul avec une unité de filtre centrifuge.
7. Mélanger 200 ul de chaque échantillon avec 50 pi 5x SDS-PAGE colorant de chargement. Fendez chaque préparation dans 125 aliquotes. Faire bouillir une fraction aliquote de chaque préparation pendant 20 min à 95 ° C, pour inverser formaldéhyde liaisons transversales. Laissez refroidir les échantillons à la température ambiante pendant au moins 10 min au-dessus de banc.
8. Charge: 30 ul de chaque échantillon à une seule voie d'un gel de polyacrylamide-adapté à un immunotransfert. Utilisez un marqueur Prestained de poids moléculaire pour une meilleure orientation et exécuter SDS-PAGE ^10.

4. Analyse par immunoblot pour confirmer interaction Partenaires

1. Une fois l'étape 3.8 est terminée, protéines de transfert sur ​​une membrane de nitrocellulose par exemple demi-sec.
2. Bloquer la membrane pour éviter l'étiquetage imprécis. Préparer le tampon de blocage en pesant le sérum-albumine bovine (BSA) pour atteindre 3% en poids par volume dans une solution saline tamponnée au Tris supplémenté avec une concentration finale de 0,05% de Tween-20 (TBS-T). Utiliser un volume suffisant de tampon de blocage pour couvrir la membrane. Bloquer la membrane pendant 1 heure à température ambiante.
3. Diluer unend incuber le premier anticorps spécifique de la protéine proie comme d'habitude. Utilisation d'un anticorps HRP-lié en tant que second anticorps.
4. Développer l'immunoblot en utilisant un kit de détection de chimioluminescence avec une grande sensibilité. Surveiller le signal en utilisant une procédure de traitement de film classique ou de l'équipement d'imagerie numérique.

5. NanoLC-ESI-MS/MS haute résolution expériences pour repérer interaction Partenaires

1. Dans le cas où aucun anticorps spécifique est disponible pour la protéine proie ou partenaires d'interaction inconnus doivent être identifiés, utiliser la spectrométrie de masse (MS) pour l'identification. Afin d'empêcher la contamination de la kératine, en utilisant des gels precasted pour la séparation des protéines.
2. Coloration à l'argent du SDS-PAGE en utilisant un kit de coloration MS-compatible selon le protocole du fabricant. Effectuez toutes les étapes de lavage et coloration dans les réservoirs de verre.
3. Accise bandes respectives et analyser ceux-ci en haute résolution LC / MS ^9.

Résultats

Analyse membrane RACHIS permet la co-purification des protéines membranaires et interagissant de manière transitoire partenaires protéiques. La co-purification est réalisée en utilisant l'agent formaldéhyde transversale de liaison. Deux paramètres sont critiques pour éviter des liaisons transversales non spécifiques: la concentration en formaldéhyde et le temps de réticulation. L'utilisation suffisante, mais non excessive de formaldéhyde peut être facilement contrôlé par immuno. Complexes protéiq...

Discussion

Analyse membrane colonne vertébrale est une approche biochimique que l'on permet de confirmer et d'identifier à ce point inconnus partenaires d'interaction de protéines membranaires. Membrane SPINE combine in vivo réticulation par le formaldéhyde à la purification d'une protéine appât de membrane Strep-marqué. La combinaison avec des immuno-empreinte facilite la confirmation de partenaires d'interaction prédites (Figure 2). En outre, la combinaison avec l'analy...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
37% Formaldehyde	Roth	4979.1	Should not be older than one year
DNaseI	Sigma	DN25
BCA protein assay kit	Pierce	23225
Micromagnetic rod	Roth	0955.2	5 mm in length, 2 mm in diameter
Triton X-100	Roth	6683.1	standard detergent for solubilization
n-Dodecyl-β-maltoside	Glycon	D97002-C	the best detergent to solubilze CpxA
1 ml Strep-Tactin superflow gravity flow column	IBA	2-1207-050
Strep-tag protein purification buffer set	IBA	2-1002-001	Contains buffer W and buffer E
Amicon Ultra-4 centrifugal filter	Millipore	UFC803024
SuperSignal West Pico Chemiluminescent substrate	Pierce	34080
SilverQuest Silverstaining kit	Invitrogen	LC6070
FireSilver Staining Kit	Proteome Factory	P-S-2001
Ultracentrifuge